Name: activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Vi skulle vilja erkänna Ibrahim Al Amedi för odling av transgena tobaksväxter och Dr Thomas Rademacher för att tillhandahålla tobaks uttryck vektor. Författarna vill tacka Dr Richard M. Twyman för redaktionellt stöd och Markus säck för givande diskussioner om DFE tillhörighet ligand struktur. Detta arbete finansierades delvis av Fraunhofer-Gesellschaft interna program under Grant nr. Attrahera 125-600164 och delstaten Nordrhein-Westfalen under Leistungszentrum Grant No. 423 "nätverksansluten, adaptiv produktion". Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inom ramen för forskarutbildningsgruppen "Tumörinriktad Läkemedelsleverans" Grant 331065168. GE Healthcare stödde Open-Access publicering av denna artikel.

1. odla de genetiskt modifierade tobaks plantorna
Anmärkning: Utformningen av DFE fusionsprotein och generering av transgena växter beskrivs på annat håll5,17.
<ol><li>Gror de transgena tobaks plantorna i jord. Vattna växterna med en 1,0 g · L-1 gödselmedel lösning. Överför plantorna till singel, 100 mm x 100 mm x 60 mm (längd, bredd, höjd) krukor när de växer till en diameter på ~ 0,04 m.</li>
	<li>Odla de transgena tobaks plantorna i ett växthus med en 16-h fotoperiod (25/22 ° c ljus/mörker temperatur regim), med 70% relativ luftfuktighet och automatiserad befruktning med en 1,0 g · L-1 gödsel lösning för 15 min varje timme.</li>
	<li>Efter 7 veckor, skörd alla blad utom de fyra brud bladen vid basen av växten stammen. Omedelbart bearbeta de skördade bladen enligt beskrivningen nedan.</li>
</ol>2. värmeutfällning av värd cells proteiner
<ol><li>Ställ upp ett vattenbad med en arbetsvolym på 20 L i ett uppvärmt rostfrittstål (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m). I början, placera en magnetisk pump i vattenbadet att agitera vätskan permanent med ett flöde av 5 L min-1. Montera en justerbar termostat på vattenbadet för temperaturkontroll (steg 2,4 och 2,8). Försiktighet: Alla följande steg upp till 2,10 innebär hantering av varm vätska. Använd lämplig personlig skyddsutrustning inklusive Termiskt isolerade handskar och skyddsglasögon.</li>
	<li>Tillsätt 15 L avjoniserat vatten till vattenbadet och Värm vätskan till 70 ° c.</li>
	<li>Placera en 10 L hink fylld med 5 L avjoniserat vatten på en magnetisk omrörare. Tillsätt natriumfosfat till en slutkoncentration av 120 mM. Justera pH till 8,14 med 10 M saltsyra. När alla komponenter har lösts, tillsätt den resulterande koncentrerade blanchningsbufferten (5 L) till vattenbadet från steg 2,2.</li>
	<li>Agitera vattenbadet tills temperaturen når 70 ° c. Använd 10 M saltsyra för att justera pH till 8,14 vid behov. Fortsätt agitera i minst 15 min efter erforderlig temperatur och pH uppnås för att säkerställa att hela församlingen är i termisk jämvikt.</li>
	<li>Förbered en 20 L hink (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m) fylld med avjoniserat vatten vid en temperatur på ~ 17 ° c (krävs för steg 2,9).</li>
	<li>Förbered 400 g-portioner av de skördade tobaksbladen från steg 1,3. Placera en alikvot i en perforerad korg (0,2 m x 0,2 m x 0,2 m; pore-bredd minst 0,02 m x 0,02 m). Undvik att överfylla korgen med växtmaterial eller packning bladen för hårt för att undvika att skada vävnaden.</li>
	<li>Helt Sänk korgen i den varma blanchering buffert från steg 2,4 och se till att alla bladen kvar under vätskeytan. Använd en Termostabil silikon sked för att hålla bladen under ytan om det behövs.</li>
	<li>Inkubera tobaksbladen för 1,5 min i blanchering vätskan medan pumpen fortfarande agitera vätskan. Övervaka vätsketemperaturen under hela inkubationstiden. Undvik att blockera pumpens inlopp med tobaksblad.</li>
	<li>Ta bort korgen av tobaksblad från blanchering buffert och dränera resterande buffert från bladen för 30 s. överför korgen till skopan fylld med kallt vatten (från steg 2,5) och sänk ned bladen i 30 s. ta bort korgen och Töm det resterande vattnet från Le 30 s före homogenisering (steg 3).</li>
	<li>Upprepa steg 2,6 till 2,9 med färska alikvoter från 2,6 tills hela den skördade biomassan bearbetas. Ständigt övervaka och justera pH och temperaturen i blanchering buffert i vattenbadet. Anmärkning: Blanched växtmaterial kan lagras på is i upp till 30 min när flera blanchering cykler krävs för att bearbeta hela biomassan. Blanched löv kan också förvaras i vakuum förslutna påsar vid-80 ° c i minst 3 veckor. Dock rekommenderas omedelbar bearbetning eftersom långvarig lagring kan minska DFE-utbytet.</li>
</ol>3. protein utvinning och förtydligande
Försiktighet: Följande steg involverar en mixer med roterande blad. Arbeta inte i mixer kärlet när den är påslagen eller monterad på motor enheten.
<ol><li>Placera 150 g (våt massa) blancherade tobaksblad (steg 2,9) i mixer kärlet och tillsätt 450 mL extraktionsbuffert (50 mM natriumfosfat, 500 mM natriumklorid, 10 mM natriumdisulfit, pH 7,5). Stäng mixer locket ordentligt för att förhindra spill av växtmaterial eller buffert.</li>
	<li>Homogenisera bladen för 3x för 30 s, med 30 s raster mellan varje puls. Se till att alla bladen är homogeniserade och att ingen fastnar på toppen av mixer fartyget. Om det behövs, öppna mixern under pauserna och tryck ner bladen som fastnar på den övre delen av kärlet, med en ren silikon sked.</li>
	<li>Efter homogenisering, ta ett 1,0 mL-prov av Homogenatet för efterföljande analys (steg 7).</li>
	<li>Samla upp homogenisera i ett kärl av lämplig storlek (t. ex. om du arbetar med en total biomassa på 1,0 kg, Använd ett kärl med en kapacitet på minst 5 L). Upprepa steg 3,1 till 3,3 tills all blancherade biomassa är homogeniserad.</li>
	<li>Montera ett säck filter i ett filter fäste och placera ett annat tillräckligt stort kärl (se 3,4) under monteringen. Applicera homogenisen på säck filtret med en hastighet av ~ 0,15 L min-1. Ta prover av påsen filtratet efter varje liter för efterföljande analys (steg 7) och mäta grumlighet av påsen filtratet poolen som en 1:10 utspädning i extraktion buffert med hjälp av en turbidimeter eller liknande anordning.</li>
	<li>Ytterligare klargöra påsen filtratet pool med 0,02 m2 av en K700 (topp) och KS50 (botten) djup filter lager kombination per liter av påse filtrat pool. Applicera en flödeshastighet på 3,0 L min-1· m-2 upp till ett Max tryck på 0,2 MPa. Ta sedan bort kvarvarande partiklar genom att passera det klargjorda filtratet genom ett sterilt 0,2 μm-filter som tidigare beskrivits5.</li>
</ol>4. rening av DFE-affinitet ligand
<ol><li>Förbered ett snabbt proteinvätskekromatografisystem genom spolning med elueringbuffert (10 mM natriumfosfat, 300 mM Imidazol, pH 7,4), tvättbuffert (10 mM natriumfosfat, pH 7,4) och equilibrationbuffert (20 mM natriumfosfat, 500 mM natriumklorid, pH 7,4). Montera en kolonn som innehåller ~ 50 mL kelaterande tvärbunden aganharts per kilogram blad biomassa (~ 2,5 L djup filtrat).</li>
	<li>Ladda kolonnen med nickeljoner genom att applicera 5 kolumn volymer (CV) på 200 mM nickelsulfatlösning och tvätta den med 5 CV av elutionsbuffert. Använd en flödeshastighet på 50 cm h-1 och övervaka UV-signalerna vid 260, 280 och 558 Nm för alla efterföljande kromatografisteg.</li>
	<li>Equilibrate kolonnen med 10 CV av jämvikts buffert. Ladda sedan 50 CV av det förtydligade växtextraktet (från steg 3,6) till den konditionerade kolonnen.</li>
	<li>Tvätta kolonnen med 10 CV av tvättbuffert. Eluera DFE-fusionsproteinet med 5 CV-elueringbuffert och samla in den produktinnehåll ande fraktionen när UV-signalerna vid 280 nm och 558 nm har ökat till mer än 5 mAU över baslinjen.</li>
	<li>Ta ett prov på 0,2 mL från elueringfraktionen för att mäta koncentrationen av total löslig protein (TSP) (steg 7,1), DFE-koncentration (steg 7,2 och 7,3) och DFE-renhet (steg 7,4).</li>
	<li>Montera en kolonn som innehåller ~ 50 mL tvärbunden dextran harts på ett kromatografisystem. Equilibrate kolonnen med 5 CV för kopplingsbuffert (200 mM HEPES, 500 mM natriumklorid, pH 8,5). Injicera 10 mL av DFE-elueringfraktionen (steg 4,4) för buffertutbyte och övervaka UV-absorbansen vid 280 och 558 nm.</li>
	<li>Samla in den DFE-innehållande fraktionen när UV-signalerna vid 280 nm och 558 nm har ökat till mer än 5 mAU över baslinjen. Ta ett prov på 0,2 mL och bestäm TSP-koncentrationen, DFE-koncentrationen och DFE-renhet (steg 7).</li>
	<li>Koncentrera det renade DFE-provet (från steg 4,7) till 15 g L-1 med ett centrifugalkoncentratorrör på 3 000 x g vid 4 ° c i 30 minuter i en centrifug. Fortsätt med kopplings reaktionen (steg 5). Anmärkning: Förvara DFE-lösningen vid 4 ° c om koncentrations-eller kopplings stegen inte kan utföras omedelbart.</li>
</ol>5. koppling DFE till den aktiverade tvärbunden Aganharts
Anmärkning: Ersätt inte isopropanol som används för lagring av NHS-aktiverade kolonner förrän all utrustning och alla lösningar för koppling är klara. Låt aldrig kolonnerna köras torra.
<ol><li>Ställ in en modell för design av experiment (DoE) för att optimera kopplingen av DFE till det aktiverade hartset, med pH, buffertsammansättning och DFE-koncentration som faktorer. Detaljerna i DoE-metoden beskrivs på annat håll15.</li>
	<li>Bered affinitetslösningen (från steg 4,8) i ett koncentrationsintervall från 0,5 – 15 g · L-1 eller enligt definitionen i Doe och förvara den på is tills kopplings reaktionen är klar (steg 5,5). Fyll minst tio mL-sprutor med DFE-lösningen och Förbered en adapter för att montera sprutorna på NHS-aktiverade korlänkade agankolonner med en bädd volym på 1,0 mL.</li>
	<li>För varje 10 kolonner som används för koppling, Förbered 30 mL avaktiveringslösning (0,5 M etanolamin, 0,5 M natriumklorid, pH 8,3), 30 mL låg-pH-lösning (0,1 M natriumacetat, 0,5 M natriumklorid, pH 4,0) och 10 mL lagringslösning (0,05 M dinatriumfosfat , 0,1% (m/v) natriumazid, pH 7,0).</li>
	<li>Bered 20 mL 1 mM saltsyra i ett rör och inkubera på isen i minst 20 min. Förbered en precisions skala för att övervaka genomflödesfraktionerna för alla steg under kopplings reaktionen (steg 5,7).</li>
	<li>Öppna en förseglad NHS-aktiverad tvärbunden aganskolumn och montera sprutadaptern vid kolonnens inlopp. Förhindra att luft tränger in i kolonnen genom att applicera en droppe buffert på adapterns inlopp innan den ansluts till sprutan.</li>
	<li>Tvätta kolonnen med 6 mL iskall 1 mM saltsyra (från steg 5,4) med en flödeshastighet på < 1 mL min-1 och gå genast vidare till steg 5,7.</li>
	<li>Injicera 1,5 mL DFE-lösning (steg 5,2) med en 2 mL spruta med en flödeshastighet på < 1 mL min-1 och samla in genomflödesfraktionen på en precisions skala (steg 5,4) för efterföljande analys (steg 7). Försegla kolonnen i båda ändar och inkubera i 15 – 45 minuter vid 22 ° c, beroende på DoE-inställningen.</li>
	<li>Injicera 6 mL avaktiveringslösning följt av 6 mL låg-pH-lösning med en flödeshastighet av < 1 mL min-1 för att avlägsna icke-kovalent bundna ligander från hartset. Injicera sedan 6 mL avaktiveringslösning och inkubera kolonnen i 15 min.</li>
	<li>Injicera 6 mL låg-pH-lösning i kolonnen, följt av 6 mL avaktiveringslösning. Injicera sedan ytterligare 6 mL låg-pH-lösning i kolonnen.</li>
	<li>Injicera 2 mL lagringslösning i kolonnen och förvara vid 4 ° c.</li>
</ol>6. testa rening av mAbs från klargjorda växter extrakt
<ol><li>Förbered 100 mL av det klargjorda växtextraktet som innehåller 2F55 eller supernatanten från det föredragna cellbaserade uttrycks systemet, som också innehåller 2f5.</li>
	<li>Preparationbuffert (20 mM natriumfosfat, 500 mM natriumklorid, pH 7,4), låg pH-elueringbuffert (0,05 M citrat, 0,05 M natriumklorid, pH 4,0 – 3,25) och högjonisk elueringbuffert (1,0 – 4,0 M magnesiumklorid, 0,1 M HEPES, pH 8,0)</li>
	<li>Spola kromatografisystemet med buffertarna. Montera en DFE-affinitetskolumn (från steg 5,10) på kromatografisystemet och jämvikt med 5 CV av equilibrationbuffert med en flödeshastighet på 1,0 ml min-1. Övervaka UV-absorbansen vid 280 nm. Anmärkning: Lastning växtextrakt eller cellkultur supernatanten på kolonnen kan orsaka en ökning av mottrycket. Ställ in en högtrycks varning på 0,2 MPa för att undvika skador på kromatografisystemet eller DFE-kolonnen.</li>
	<li>Fyll 80 mL av det klargjorda växtextraktet eller supernatanten (steg 6,1) på kolonnen med en flödeshastighet på 0,5 mL min-1 för att garantera en kontakttid på 2 min. samla in genomflödesproverna i 2 ml fraktioner för rekonstruktion av genombrotts kurvan (steg 7,3). Förvara genomflödesproverna vid 4 ° c om omedelbar provanalys inte är möjlig.</li>
	<li>Tvätta kolonnen med 6 CV av jämvikts buffert. Samla ett prov av tvätten i början, mitten och slutet av detta steg.</li>
	<li>
Elute mAb 2F5 med 5 CV låg-pH elueringbuffert eller hög-Jon-styrka elutionsbuffert (0,1 M HEPES, 1,25 M magnesiumklorid, pH 8,0). Samla in DFE-fraktionen när UV 280 nm-signalen har ökat till 5 mAU över baslinjen.
	<ol>
<li>Optimera elutionsbufferten för varje Epitope – antikropppar. För 2F5, 1,25 M magnesiumklorid uppnått en optimal balans mellan produkt återhämtning och ligand stabilitet. Anmärkning: Magnesium klo RID lösningen är utsatt för nederbörd. Lös därför magnesiumklorid i ~ 700 mL vatten. Lös upp HEPES i 100 mL vatten separat och justera pH till 8,0. Tillsätt den lösta magnesiumkloridlösningen till HEPES-lösningen och tillsätt vatten till en slutlig volym på 1,0 L. Justera inte pH efter upplösning av magnesiumklorid eftersom detta kommer att orsaka nederbörd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysera alla prover som tagits under steg 6.4 – 6.6 med hjälp av Bradford-metoden, litiumdodecylsulfat polyakrylamid gel elektrofores (LDS-PAGE) och ytplasmon resonans (SPR) spektroskopi (steg 7).</li>
</ol>7. analys av provet
<ol><li>Mät TSP-koncentrationen med hjälp av Bradford-metoden18,19.
	<ol>
<li>I tre exemplar, Pipettera 2,5 μL av varje prov till en enda brunn på en 96-brunn tallrik. Använd åtta standarder för bovint serum albumin (BSA) i tre exemplar som täcker intervallet 0 – 2000 mg · L-1.</li>
		<li>Tillsätt 200 μL av Bradford-reagens till varje brunn och blanda genom att försiktigt Pipettera upp och ner. Behåll pipettnivån för att undvika bildandet av bubblor som förvränger efterföljande avläsning.</li>
		<li>Inkubera plattan i 10 min vid 22 ° c och Mät absorbansen vid 595 nm i en spektrofotometer. Beräkna TSP-koncentrationen i proverna baserat på en standardkurva genom Referenspunkterna för BSA.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantifiera DFE genom fluormetri
	<ol>
<li>I tre exemplar, Pipettera 50 μL av varje prov till enkelbrunnar i en svart 96-brunn halv områdes plåt. Inkludera sex DsRed standarder som täcker intervallet 0 – 225 mg · L-1.</li>
		<li>Mät fluorescensen två gånger med ett 530 ± 30 Nm magnetisering filter och ett 590 ± 35 nm emissions filter i en spektrofotometer. Beräkna DFE-koncentrationen i proverna baserat på en standardkurva genom de DsRed referenspunkterna.</li>
	</ol></li>
	<li>Mät 2F5-koncentrationen med SPR-spektroskopi20.
	<ol>
<li>Förbered löpbufferten HBS-EP (10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethansulfonsyra (HEPES), 3 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 150 mM natriumklorid, 0,005% v/v Tween-20, pH 7,4) och filter sterilisera den genom att passera den genom en 0,2 μm vakuum Flask topp filter. Degas bufferten i 15 min.</li>
		<li>Anslut HBS-EP-körningsbufferten till spr-instrumentet innan du dockar en karboxymetylerad dextran-ytkrets och jämvikt systemet med hjälp av funktionen Prime. Starta en manuell körning med en flödeshastighet på 30 μL min-1 och villkora spånytan genom att växelvis injicera 30 mm saltsyra och 25 mm natriumhydroxid (två injektioner vardera) över flödes cellerna 1 och 2 med en flödeshastighet på 30 μl min-1 under 1 min.</li>
		<li>Förbered 300 μL av en 500 mg · L-1 protein A-lösning i 10 mm natriumacetat (pH 4,0). Tina injektionsflaskor med 0,4 M 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimidhydroklorid (EDC) och 0,1 M NHS och centrifugera vid 16 000 x g under 1 min före blandning av 70 μl edc och 70 μl av NHS.</li>
		<li>Överför EDC/NHS-blandningen och proteinet en lösning till 7 mm plast provflaskor och placera dem i prov stället. Aktivera karboxymetylerad dextran-spånytan genom att injicera EDC/NHS-blandningen över flödes cellerna 1 och 2 med en flödeshastighet på 10 μL min-1 i 10 minuter.</li>
		<li>Par protein A till den aktiverade karboxymetylerade dextran ytan genom att injicera proteinet en lösning över flöde cell 2 med en flödeshastighet av 15 μL min-1 för 15 min.</li>
		<li>Medan kopplingen proteinet A, Tina en injektionsflaska med 1,0 M etanolaminhydroklorid (pH 8,5) och centrifugera vid 16 000 x g för 1 min. överför 150 μl till en 7-mm plastflaska och placera den i instrumentet. När steg 7.3.5 är slutfört avaktiverar du spånytan genom att injicera etanolaminlösningen över flödes cellerna 1 och 2 med en flödeshastighet på 10 μL min-1 i 7 minuter.</li>
		<li>Villkora spånytan genom att växelvis injicera 30 mM saltsyra och 25 mM natriumhydroxid (två injektioner vardera) över flödes cellerna 1 och 2 med en flödeshastighet av 30 μL min-1 för 0,5 min.</li>
		<li>Förbered standarderna för antikropp 2F5 i HBS-EP-körningsbuffert med en koncentration av 500 μg · L-1 och Späd prover innehållande 2F5 i HBS-EP till en slutlig koncentration i intervallet 20 – 1 000 μg · L-1. Injicera prover och standarder över flödes cellerna 1 och 2 med en flödeshastighet på 30 μL min-1 under 3 min. injicera en 2f5-standard efter varje 15 prov.</li>
		<li>Subtrahera den relativa enheter (RU) signalen från Flow cell 1 (referenscell) från signalen från Flow cell 2 (mätcell) för varje prov och beräkna antikroppskoncentrationen baserat på RU-signalen av 2F5 standard injektioner.</li>
		<li>Efter varje prov eller standard injektion, regenerera spånytan genom att injicera 30 mM saltsyra med en flödeshastighet av 30 μL min-1 för 0,5 min över flödesceller 1 och 2.</li>
		<li>Rita upp 2F5-koncentrationen för varje genomflödesprov från steg 6,4 mot flödet genom volym för att få en genombrotts kurva på 2F5. Beräkna mängden injicerat 2F5 när 10% av koncentrationen 2F5 uppnåddes för att erhålla 10% dynamisk bindnings kapacitet (DBC).</li>
	</ol></li>
	<li>Analysera proteinprover på LDS-sidan.
	<ol>
<li>Öppna en klar att använda 4 – 12% BisTris LDS polyakrylamidgel och placera den i en elektrofores modul. Överför 800 mL löpbuffert (50 mM MES, 50 mM Tris bas, 0,1% (m/v) SDS, 1 mM EDTA, pH 7,3) i modulen och tillsätt 0,5 mL antioxidant lösning.</li>
		<li>I ett 1,5 mL reaktionsrör, blanda 10 μL lastbuffert med 4 μL reduktionsmedel och 26 μL av protein provet. Inkubera röret i ett värmeblock i 10 min vid 80 ° c. Centrifugera röret vid 500 x g i 30 s.</li>
		<li>Fyll på LDS polyakrylamidgel (10 μL prov per körfält) och lasta 5 μL förmålat protein standard (10 – 180 kDa) i ett separat körfält.</li>
		<li>Stäng elektrofores kammare och Anslut strömförsörjningen. Elektrofores bör löpa för 40 min och vid konstant 200 V.</li>
		<li>Ta bort gelen från elektrofores kammaren. Öppna gel hölje och tvätta gelen i 15 min i vatten på en shaker vid 19 RPM. Färga gelen i 1 h i infärgnings lösningen på en shaker vid 19 RPM.</li>
		<li>Destain gelen för 1 h i vatten på en shaker vid 19 RPM. Skanna gelen med en filmscanner.</li>
	</ol></li>
</ol>

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Applikationer av romanen affinitet kåda
Vi har visat att Custom affinitetskromatografi hartser för avskiljning av Mabs kan tillverkas genom immobilisera en ligand som innehåller en MAB-specifik epitop till NHS-aktiverade tvärbunden aguppstod. För att designa en sådan harts var det nödvändigt att känna till epitopsekvensen och att använda en linjär epitop. Den resulterande hartser är fördelaktigt för fångst av mAbs eftersom de potentiellt kan ersätta dyra protein en affinitetskromatografi steg. Interaktionen mellan 2F5 och DFE i vår fallstudie medierades av Epitope – paratope Binding, så vår ligand borde vara mer selektiv än protein A, som binder till FC-regionen i de flesta murina och mänskliga IgGs. Eftersom enskilda ligander behövs för varje mAb, vår metod kan inledningsvis verkar lämplig främst för antikroppar som produceras i mycket stor skala. Men genom att kombinera vår strategi med Rapid växtbaserat övergående proteinuttryck kan nya affinitetsligander beredas på mindre än 2 veckor27 med minimal ansträngning28. Därför är metoden också lämplig för småskalig mAb rening.
Produktion och potentiella förbättringar av affinitet ligand
Växter erbjuder en snabb och säker produktionsplattform för affinitet ligander5,29,30, såsom DFE fusionsprotein som visas i vår fallstudie. Blanching växtmaterialet kraftigt minskat mängden av värd cellproteiner i ett enda steg och var lätt integreras i en standard förtydligande rutin. Återhämtningen av ligand var dock låg i den nuvarande installationen, troligen på grund av dess måttliga termiska stabilitet och vissa icke-specifik bindning till filter lagren, som rapporterats för andra produkter31,32,33. Engineering transportören att öka sin termiska stabilitet kan därför bidra till att förbättra ligand avkastning i framtiden, som beskrivs för malariavaccin kandidaten CCT, antitumörenzymet ppadi eller en mesofil β-glukosidas34, 35,36. Detsamma gäller för djup filtrering steg, där proteinteknik kan bidra till att minska icke-specifik bindning till filtermaterialet37. Produktionskostnaderna för DFE och liknande ligander skulle också kunna minskas genom att förbättra den övergripande effektiviteten av klargöranden med hjälp av flockningsmedel eller filtertillsatser38,39.
När DsRed används som bärare bildar den ett tetrameriskt komplex. Detta är fördelaktigt eftersom det ökar antalet epitoper per ligand, men det kan också göra ligand mer mottagliga för demontering eller denaturering under affinitetskromatografi. En monomerisk bärare protein som mCherry kan därför vara att föredra, eftersom det är stabilt vid lågt pH40, och införandet av tandem upprepningar av epitopen skulle öka aviditet av ligand och därmed öka harts kapacitet5, 26 , 41. för enkla bärare-Epitope proteiner (dvs. de utan disulfid obligationer eller post-translationella modifieringar) mikrobiella produktionssystem kan minska tillverkningskostnaderna och göra ligander mer konkurrenskraftiga med protein A. Till exempel, grönt fluorescerande protein har uttryckts i bakterieceller med en avkastning på ~ 1 g · kg-1 biomassa, vilket avsevärt skulle minska ligand produktionskostnader42.
Oavsett uttryckets värd krävdes en renad affinitetsligand under kopplingen för att minimera immobiliseringen av värd cells proteiner eller mediekomponenter som annars kan reducera hartselektivitet och kapacitet. Införandet av en poly-Histidine tagg för iMac rening ökade renhet till ~ 90% i ett enda steg, vilket underlättar snabb och billig ligand produktion5,43,44. Men positionen för fusion tag är viktigt eftersom det har potential att sterically hindra epitop bindande eller att framkalla klyvning av antingen taggen eller epitop från bäraren45,46.
Immobilisering av affinitet ligand på NHS-aktiverade kromatografikolonner
Immobilisering utfördes manuellt eller med hjälp av ett kromatografisystem. De små buffertvolymerna per kolumn verkade gynna manuell hantering (t. ex. på grund av de minimala avfallsvolymerna). Men om flera/större kolumner behövs gör kromatografisystemet att kopplings förhållandena blir lättare att kontrollera (t. ex. reglerade flöden) och är därför mer benägna att uppnå reproducerbara resultat i form av DBC. Våra data tyder på att kopplingsbufferten och pH-värdet har en viktig inverkan på kopplings effektiviteten och de totala kolumn kostnaderna. Screening faktorer som påverkar kopplingen reaktionen och justera dem för varje bärare protein (eller ens för varje bärare-ligand fusion) kan därför förbättra kopplingen effektivitet och harts prestanda, och vi rekommenderar detta tillvägagångssätt.
Testa 2F5-isolering med DFE-tillhörighets kådan
Produktens avkastning och renhet är viktiga aspekter av harts prestanda, och i fallet med DFE vi uppnått en avkastning på 105 ± 11% (± SD, n = 3) och en renhet av 97 ± 3% (± SD, n = 3), vilket är jämförbart med prestanda av benchmark protein A hartser25 ,26. En annan viktig resultatindikator för hartser i allmänhet (och särskilt för dem som bygger på affinitet ligands) är DBC på 10% produkt genombrott, eftersom denna parameter påverkar mängden harts som krävs för en viss process och därmed kostnaderna. För DFE ligand var den initiala DBC ~ 4 g · L-1 harts, vilket är ~ 13% av motsvarande värde för protein A under liknande förhållanden (endast 2 min kontakttid)25,47 men om 15-faldigt högre jämfört med andra anpassade affinitetshartser såsom anti-FSH-immunoaffinity ligand med samma uppehållstid på 2 min48. DBC av DFE sjönk till 15% av start värdet efter 25 bind-och-elute cykler, medan mer än 50 cykler krävs för samma förlust av DBC i kommersiellt protein A-hartser49. Det är dock viktigt att notera att vår transportör ännu inte har optimerats i samma utsträckning som protein A, som har undersökts grundligt och förbättrats under de senaste fyra decennierna8.
Hittills har vi förbättrat harts stabilitet och produkt återhämtning genom att byta från en låg-pH elutionsbuffert till en hög koncentration av magnesiumklorid (figur 3), som rekommenderas i tidigare studier13. Den karakteristiska röda färgen på affinitet ligand inte bleknar kraftigt under de 25 binda-och-elute cykler, så vi spekulerar i att endogena växt proteaser i den förtydligade växtextrakt31 kan ha stympat och därmed inaktiverat epitopen av ligand. Därför, designa proteas-resistenta Linkers att ansluta bäraren och epitop kan bidra till att bibehålla den initiala DBC över ett utökat antal cykler. Med tanke på den snabba och enkla uttryck och rening av DFE ligand, dess enkla koppling till kommersiella kromatografi hartser, och dess utmärkta produkt avkastning och renhet, anser vi att vår metod erbjuder ett lämpligt alternativ till protein A för rening av mAbs och antikropps derivat som inte binder till protein A, särskilt om förbättringar av bärare och länkare kan förbättra den DBC och ligand stabilitet. Detta antagande stöddes av den lilla skillnaden i dissociationskonstant av DFE-renat och protein A-renad 2F5 antikropp5, vilket indikerar att vår nya affinitet ligand tillåter återvinning av högkvalitativa Mabs.
Fördelar och nuvarande begränsningar av metoden
Genom att producera affinitet ligand som en genetisk fusion med ett bärare protein ökar lösligheten i vattenbuffertar och därmed kompatibilitet med typiska ligand koppling villkor. Däremot kan blanka peptider som härrör från solid fas peptid syntes ha begränsad löslighet under dessa förhållanden på grund av deras sekvens50, som inte kan ändras eftersom det styrs av aminosyran sekvens av epitop som erkänts av MAB att renas. Andra har därför använt en on-Resin-syntes av peptid-ligander51. Den statiska bindnings kapaciteten hos den resulterande kådan var hög (~ 80 g · L-1), men processen för harts beredning är lång, en dynamisk bindningsförmåga rapporterades inte och den erhållna renhet och återhämtning var lägre än i vår strategi. En ytterligare fördel med ett fusionsprotein ligand i laboratorieskala är att ligand och varianter därav snabbt kan produceras, renas och testas med minimal ansträngning i en enkel att använda hög-genom Expression system52.
De två nuvarande begränsningarna för den metod som presenteras här är den låga dynamiska bindnings kapaciteten på 3 g · L-1 och dess 90% minskning under loppet av 25 bind-och-elute cykler5. Dessa begränsningar kan åtgärdas i framtiden genom att tillämpa mindre stränga lastnings förhållanden och ersätta den nuvarande DsRed transportören med en konstruerad, stabilare variant respektive. Till exempel, fördubbla den nuvarande kontakttiden från 2 till 4 minuter har potential att fördubbla den dynamiska bindnings kapacitet som visades för vissa protein A hartser26.
Felsökning
Följande tabell belyser potentiella problem som kan uppstå under detta protokoll och ger tips om hur du löser dem (tabell 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tabell 1: potentiella problem som kan uppstå och möjliga korrigeringar.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protocol steg</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Couse</td>
			<td>Fixa</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Växter växer inte</td>
			<td>Komprometterade tillväxtförhållanden</td>
			<td>Kontrollera gödselmedlet pH och konduktivitet</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kontrollera temperatur och ljusförhållanden</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 och 3</td>
			<td>Stora mängder värd cells proteiner förekommer efter extraktion</td>
			<td>Ofullständig nederbörd</td>
			<td>Kontrollera temperaturen under blanchering</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kontrollera agitation i blanchering Bath</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 och 3</td>
			<td>Ingen produkt som finns i växtextraktet</td>
			<td>Blanching temperatur för hög</td>
			<td>Kontrollera temperatur och pH under blanchering</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH i blanchering buffert för låg</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Stora stam-eller löv delar återstår efter extraktion</td>
			<td>Ofullständig blandning i mixer</td>
			<td>Se till att växtmaterialet inte bildar en plugg i mixern</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Snabb tryck ökning vid djup filtrering</td>
			<td>Felaktigt filterval och/eller orientering</td>
			<td>Kontrollera filtertyp och orientering</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Litet fusionsprotein vid eluering/mycket fusionsprotein i genomflödesbaserad</td>
			<td>IMAC Resin har inte belastats med metalljoner</td>
			<td>Kontrollera om IMAC-kådan var korrekt laddad med joner</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Fusionsproteinet förlorade tillhörighets märket</td>
			<td>Undvik intensivt solljus och höga temperaturer under växtodling</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Fusionsprotein som förlorats under koncentrationen</td>
			<td>Fusionsprotein bundet till membranet</td>
			<td>Kontrollera membran typen</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kontrollera att koncentrations faktorn inte var för hög</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Låg Kopplingskapacitet</td>
			<td>Felaktig sekvens av kopplings reagenstillsats</td>
			<td>Kontrollera reagensetiketterna och sekvensen för addition</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Felaktig beredning av kolonnerna före koppling</td>
			<td>Kontrollera villkoren för kolumn preparaiton</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 och 6</td>
			<td>Låg mAb-avkastning</td>
			<td>Lågt mAb-uttryck i anläggningens biomassa</td>
			<td>Test mAb uttryck i biomassa</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Låg ligand densitet</td>
			<td>Kontrollera reningen av fusionsprotein preparatet</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Mycket låg/hög proteinkoncentrationer i Bradford assay</td>
			<td>Bubbelbildning vid pipettering</td>
			<td>Kontrollera bubblor i 96-Tja Palte</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Låg mAb-koncentration under SPR-mätning</td>
			<td>Kompromissat protein ett chip</td>
			<td>Jämför med resultat från standard mAb med känd koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Felaktig provspädning</td>
			<td>Kontrollera utspädnings hastighet och buffert</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Felsökning.

Biopharmaceutical produkter är viktiga för behandling av ett brett spektrum av sjukdomar i nästan varje gren av medicin1. Monoklonala antikroppar (Mabs) dominerar den biofarmaceutiska marknaden, med global försäljning förväntas nå nästan €110 000 000 000 i 20202. Den gynnade uttrycks plattform för Mabs är kinesisk hamster äggstockarna cellinjer, som vanligtvis producerar höga MAB-titrar på upp till 10 g ∙ L-1 i kulturen supernatanten3,4. Produktionen av mAbs i däggdjurscell kulturer är dock dyr på grund av de höga kostnaderna för mediet och behovet av steril jäsning5. Alternativa uttryck plattformar som växter potentiellt erbjuder en snabbare, enklare, billigare och mer skalbar metod för industriell tillverkning6,7.
Utöver de kostnader som är förknippade med däggdjurscell kulturer är den utbredda användningen av protein en affinitetskromatografi för produkt avskiljning en stor kostnadsdrivande drivrutin för industriell produktion av mAbs. Protein A finns naturligt på ytan av Staphylococcus aureus celler och det binder till fragmentet kristalliserbar (FC) regionen av vissa murin och mänskliga antikroppar, vilket fungerar som en försvarsmekanism för att kringgå den humorala immunförsvaret8. Protein A har blivit branschens guldmyntfot för fångst av Mabs från cellkultur samman supernatanterna och används också flitigt av forskarsamfundet eftersom det är mycket selektiv, typiskt uppnå MAB renhet av ~ 95% i ett enda steg8. Föga förvånande, försäljning av protein A under de senaste två decennierna har nära speglade försäljningen av mAbs8. Beroende på produktions skalan kan kostnaderna för protein A motsvara mer än 25% av de totala process kostnaderna och därmed påverka marknadspriset på terapeutiska Mabs, vilket kan vara upp till €2 000 g-15,5. Därför har alternativa kromatografihartser med liknande reningsprestanda potential att avsevärt minska produktionskostnaderna, vilket gör antikroppsbaserade terapier tillgängliga för ett större antal patienter10,11 ,12. Sådana alternativ kan också kringgå nackdelarna med protein en kromatografi, inklusive de hårda elutionsförhållandena vid lågt pH (typiskt < 3.5) som potentiellt kan orsaka mAbs att genomgå överensstämmande förändringar som främjar aggregering13 . Viktigt är att protein A endast är selektivt för FC-regionen i vissa IgG-underklasser, så att icke-funktionella molekyler med stympade bindnings domäner kan samrena med intakt produkt5, medan MAB-derivatier såsom enkedjiga variabla fragment bind inte till protein A alls.
Här beskriver vi ett alternativt affinitetskromatografiharts för avskiljning av hiv-neutraliserande MAB 2f5 med hjälp av dess linjära epitop eldkwa (en bokstav aminosyra kod)5,14. Vi genetiskt smält 2F5 epitop till C-terminus av fluorescerande protein DsRed, som fungerade som en bärare och reporter molekyl, och producerade det resulterande proteinet Dsred-2F5-Epitope (DFE) i transgena tobak ( Nicotiana tabacum) växter. DFE renades genom enstegs immobiliserad metalljonaffinitetskromatografi (IMAC). Immobiliseringen av den renade DFE-affinitet ligand på ett tvärbunden aganharts uppnåddes genom kemisk koppling med hjälp av N-hydroxysuccinimide (NHS)-aktiverade kors bundna aganspolumner. Sedan användes statistiska experimentella konstruktioner för att optimera immobiliseringsproceduren och kopplings effektiviteten15. Renings strategin för mAb 2F5 utvärderades i termer av renhet, avkastning och ligand-stabilitet i kroppen. Till skillnad från protein A, som binder FC-regionen, binds DFE till den komplementaritetbestämmande regionen 2F5, vilket säkerställer att molekyler renas med intakt paratope. Vårt koncept kan enkelt anpassas till alla mAb med en linjär epitop eller till andra peptid-baserade affinitet ligander som lätt kan identifieras genom microarray studier16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> Figur 1: process flödesschema för beredning av epitop-affinitet hartser som kan användas för avskiljning av Mabs från råa växtextrakt eller cellkulturer supernatants. A) affinitet LIGAND DFE uttrycks i transgena tobaksplantor. En värme nederbörd steg (B) ingick innan skördade bladen var homogeniserade (C). Dråväxtextraktet klargjordes genom säck filtrering, djup filtrering och 0,2 μm steril filtrering. (E) DFE renas sedan med iMac. (F, G) Den renade DFE affinitet ligand var immobiliserade på EDC/NHS-aktiverade tvärbunden aganspolumner. H) bakteriekulturer som transporterar T-DNA-kodning av antikroppar 2f5 användes för övergående uttryck i N. benthamiana -växter (i) som odlas i en fytotron. J) N benthamiana -blad skördades och bearbetades enligt beskrivningen i D. (K) MAB 2f5 renas från det KLARGJORDA extraktet med hjälp av DFE-affinitetskolumnerna (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10L/20L Bucket</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td>Hach</td>
			<td>4650000</td>
			<td>Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTApure</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 2G12</td>
			<td>Fraunhofer IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standard for SPR quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-410</td>
			<td>Fuhr</td>
			<td>2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CanoScan 5600F</td>
			<td>Canon</td>
			<td>2925B009</td>
			<td>Scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td>Labomedic</td>
			<td>1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose FF</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0575-01</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cond 3320</td>
			<td>WTW</td>
			<td>EKA 3338</td>
			<td>Conductometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design-Expert(R) 8</td>
			<td>Stat-Ease, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Compfort</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F81029</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4984.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diverse bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Glas bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block DB8</td>
			<td>Techne</td>
			<td>Z381373</td>
			<td>Heat block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Fraunhofe IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2390-0000</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHG-912</td>
			<td>Oregon Scientific</td>
			<td>086L001499-230</td>
			<td>Thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9-C</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29027743</td>
			<td>Fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferty 2 Mega</td>
			<td>Kammlott</td>
			<td>5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma -86C ULT freezer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>2400</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0716-01</td>
			<td>Chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3899.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K700</td>
			<td>Pall</td>
			<td>5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KM02 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KS50P 60D</td>
			<td>Pall</td>
			<td>B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S 24</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda E300</td>
			<td>Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td>Z90010</td>
			<td>Immersion circulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>Filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>Vacuum filtration of SPR buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel sulphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T111.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0336BOX</td>
			<td>LDS-PAA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex X-cell Mini Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>PAGE chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 20x running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Buffer concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein ladder (10-180 kDa)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26616</td>
			<td>Protein standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated bucked</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH 3110</td>
			<td>WTW</td>
			<td>2AA110</td>
			<td>PH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Electrophoresis module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7837-5MG</td>
			<td>Coating of SPR chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17003301</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spoon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>Gel staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6773.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X891.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>HN13.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>243973-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosophate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T877.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>SPR-AS-HCA</td>
			<td>SPR chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>n/a</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSM3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>10034264</td>
			<td>Mini Gyro-rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated vessel, 20 L</td>
			<td>Clatronic</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes, 2 mL</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe adpter (Union Luer F)</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>181112-51</td>
			<td>Syringe adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE6101</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>TE6101</td>
			<td>Precision scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polysorbate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8170721000</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn 6.4</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29056102</td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>203.392.84</td>
			<td>Plant storge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VelaPad 60</td>
			<td>Pall</td>
			<td>VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK-26/20 column housing</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>28-9889-48</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study

Rening av monoklonala antikroppar (mAbs) är vanligen uppnås genom protein en affinitetskromatografi, som kan redogöra för upp till 25% av de totala proceskostnaderna. Alternativa, kostnadseffektiva insamlings steg är därför värdefulla för industriell tillverkning, där stora mängder av en enda mAb produceras. Här presenterar vi en metod för immobilisering av en dsred-baserade epitop ligand till en tvärbunden aguppstod harts möjliggör selektiv fångst av hiv-neutraliserande antikroppen 2f5 från rå växtextrakt utan att använda protein a. Den linjära epitopen ELDKWA var först genetiskt smält till fluorescerande protein DsRed och fusionsproteinet uttrycktes i transgena tobak (Nicotiana tabacum) växter före rening av immobiliserade metal-Ion affinitetskromatografi. Dessutom var en metod baserad på aktiverad tvärbunden aguppstod optimerad för hög ligand densitet, effektiv koppling och låga kostnader. PH-och buffertsammansättningen och den lösliga ligand-koncentrationen var de viktigaste parametrarna under kopplingsproceduren, vilket förbättrades med hjälp av en metod för design av experiment. Den resulterande affinitetskådan testades för dess förmåga att selektivt binda målet mAb i en rå växtextrakt och elutionsbufferten var optimerad för hög mAb återhämtning, produkt aktivitet och tillhörighet harts stabilitet. Metoden kan enkelt anpassas till andra antikroppar med linjära epitoper. De nya hartserna möjliggör mjukare elueringskostnader än protein A och kan också minska kostnaderna för ett första infångnings steg för mAb-produktion.

Uttryck och rening av affinitet ligand
Fusionsproteinet DFE uttrycktes i transgena tobaksplantor som odlats i ett växthus. Avkastningen var ~ 120 mg · kg-1 blad massa med en genomsnittlig biomassa av ~ 130 g per planta. Den DFE renhet var < 5% av TSP i rå växtextrakt innan blanchering men ökade till ~ 40% efter värmebehandling vid 70 ° c för 1,5 min, som fälls ut > 97% av de värden cellproteiner. Den blanchering steg var lätt integrerat i skörd och utvinning rutin (figur 1) och tog mindre än 2 h extra tid, inklusive inrättandet av vattenbadet. Den totala återhämtningen av DFE var 23,5 mg kg1 med en renhet på > 90%. De steg som ansvarar för produktförlust var blanching, djup filtrering och IMAC, med specifika förluster på 40%, 27% och 45%, respektive. Djup filter kapaciteten var i genomsnitt 135 ± 36 L m-2 (± SD, n = 3) och därmed i det övre intervallet av värden som rapporterades i litteraturen21. DFE-avkastningen ökade med växternas ålder (figur 2).
Immobilisering av affinitet ligand på NHS-aktiverade kromatografikolonner
Under de första kopplings proven fann vi att HEPES buffert (pH 8,3) ökade kopplings effektiviteten till 89 ± 6% (± SD, n = 3) jämfört med 78 ± 9% (± SD, n = 3) för bikarbonatbufferten som rekommenderades av tillverkaren. Därför användes HEPES för alla efterföljande kopplings experiment. En DoE metod valdes för att optimera kopplingen effektivitet DFE till NHS-aktiverade tvärbunden aganharts. Den absoluta mängden DFE immobiliserade på hartset ökade med massan av DFE injiceras i kolonnen och nått sitt tak på ~ 15 g · L-1 medan kopplings avkastningen sjönk kontinuerligt när mer DFE injicerades (figur 2). Kopplings avkastningen var också > 50% lägre i en sur buffert, vilket indikerar behovet av att avskärma lämpliga kopplings förhållanden för varje ligand från fall till fall. Ideala förhållanden när det gäller koppling avkastning, absoluta mängden immobiliserade DFE och kolumn kostnader identifierades med hjälp av numeriska optimeringsverktyget av DoE programvaran. De mest önskvärda förhållandena (pH 9,0 och 7,0 mg DFE per 1 mL tvärbunden aganharts) var placerade på en stor platå och var därför robusta. DFE-molekylerna behöll sin röda fluorescens även efter kopplingen, och färgintensiteten motsvarade den totala mängden immobiliserade DFE (figur 2). Därför kan kolumn färg användas som en enkel kvalitetskontroll parameter för att uppskatta kopplingen effektivitet och kolumn kvalitet. Fluorescensen bekräftade också att DFE fusionsprotein monteras i tetrameriska tillstånd av Native dsred.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> Figur 2: optimering av DFE-immobilisering till NHS-aktiverat tvärbunden aganharts. ALDS-PAA-gel med Western blot-överlagring av homogena och elutionsprover från oblanched och blancherade transgena DFE-växtextrakter. Skörd av växter utfördes 38, 45 eller 52 dagar efter seeding. Western blotting utfördes med hjälp av en anti-his6-antikroppar5. B) total mängd kopplad DFE-affinitet ligand i beroende om koppling pH och total massa av renad DFE injiceras på NHS-aktiverade tvärbunden aganspolumner. Röda prickar visar de faktiska experiment som utförs för att skapa svars ytans modell. C) DFE-affinitetskolumner efter kopplingsproceduren. Siffrorna motsvarar kopplings förhållandena som är markerade i panel B. DPS = dagar efter seedning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Testa 2F5-isolering med DFE-tillhörighets kådan
Rekombinant 2F5-antikropp var transitivt producerad i Nikotiana benthamiana -växter som odlats i en fytotron5. Erövrandet av 2F5 från råväxtextraktet testades med hjälp av affinitetskolonner tillsammans med ~ 7,0 mg renat DFE (steg 6). Eluering från protein en hartser innebär vanligtvis en sur buffert (pH ~ 3,3)13. Därför utvärderade vi initialt olika låg-pH elutionsbuffertar (pH 6.0 – 3,25) för DFE-kolumnerna. Elueringen av 2F5 var framgångsrik vid pH-värden under 4,5 med den högsta återhämtningen på ~ 35% vid pH 3,25. Låg pH-eluering inaktiverade dock både antikroppen (som bekräftas av SPR-spektrometri) och DFE ligand (som indikeras av förlusten av färg och den lägre DBC, figur 3). Den senare förväntades med tanke på att Native dsred denaturerar vid pH < 4.022,23. För att undvika produkt-och ligand denaturering testade vi magnesiumklorid som ett alternativt elueringsmedel eftersom det tidigare har använts för att eluera mAbs från andra affinitetshartser24. En magnesium kloridkoncentration på 1,25 M var tillräcklig för att eluera 2F5 från DFE-affinitetsharts med en återhämtning på 105 ± 11% (± SD, n = 3) och en renhet på 97 ± 3% (± SD, n = 3). Denna prestation var jämförbar med protein A-hartser25,26. Jämvikts dissociationskonstanten (KD) av DFE-renad 2f5-antikropp och syntetisk ligand-Fuzeon var 791 PM, medan den för en protein a-renad motsvarighet var 763 PM5. Dessutom observerades ingen betydande färg förlust i hartset över totalt 25 bind-och-elute cykler. Den DBC av DFE affinitetsharts vid 10% 2F5 genombrott sjönk linjärt under loppet av 25 cykler till ~ 15% av det initiala värdet (figur 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> Figur 3: testa isoleringen av 2F5 från klargjorda växtextrakt med hjälp av DFE-affinitetshartserna. A) DFE-affinitet hartser efter en elutionscykel med hjälp av buffertar med olika pH-värden i intervallet 4,0 – 3,0 och samma hartser efter ett neutraliseringssteg vid pH 6,0. BDFE-affinitet hartser efter en och sex cykler av 2f5-rening med 1,25 m eller 4,00 m magnesiumklorid som Eluent. C) kromatogram för experiment med frontal lastning (genombrytnings kurvor) för bestämning av den cykel beroende dynamiska bindnings kapaciteten hos DFE-harts med hjälp av magnesiumklorid som Eluent. De Breakthrough kurvor mättes för 4,0 M och 1,25 M magnesiumklorid elueringbuffertar och olika cykel nummer. D) cykel beroende dynamisk bindningsförmåga hos DFE med 1,25 M magnesiumklorid som Eluent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

I detta förfarande, en dsred-baserade epitop ligand immobiliseras för att producera en mycket selektiv affinitet harts för avskiljning av monoklonala antikroppar från råa växtextrakt eller cellkultur supernatants, som ett alternativ till protein a.

Aktiverat tvärbunden Aguppstod för den snabba utvecklingen av affinitet Kromatografihartser-antikropps fångst som en fallstudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Monoklonala antikroppar dominerar den biofarmaceutiska marknaden och renas vanligtvis av Protein A-kromatografi. Den enligt harts är en viktig kostnadsförare under produktionen påverkar priset på antikroppsbaserade therapeutics. Här beskriver vi en ny affinitet ligand baserat på fluorescerande protein som läses som bärare för den linjära epitopen av HIV neutraliserande antikropp 2F5.I allmänhet vår metod tillåter snabb generering av affinitet kromatografi hartser som kan användas för fångst av monoklonala antikroppar. Vi visade denna förmåga genom att fånga antikroppar 2F5 från rå växt extrakt. Vi optimerade infångningsförhållandena och lösningsbufferten för att förbättra den dynamiska bindningskapaciteten och resetreabiliteten.Vår harts tillåter generellt lösare förhållanden än Protein A och har potential att minska reningskostnaderna för monoklonala antikroppar. Vidare kan hartset enkelt anpassas till andra antikroppar som binder till linjära epitoper. För att börja detta förfarande, justera koncentrationen av den beredda affinitet ligand lösningen så att är i intervallet 5 till 15 gram per liter som definieras av utformningen av experiment.Förvara lösningen på is tills kopplingsreaktionen är klar. Därefter fyller du en två milliliter spruta med DFE-lösningen. Och förbered en adapter för att montera sprutorna på NHS-aktiverade korslänks-agaroskolonner med en sängvolym på en milliliter.För varje 10 kolumner som används för koppling, preparera 30 milliliter avaktiveringslösning, 30 milliliter låg pH-lösning och en milliliter lagringslösning. Förbered sedan 20 milliliter av en millimolar saltsyra i ett rör. Och ruva den på is i minst 20 minuter.Förbered en precisionsskala för att övervaka flödet genom bråk för alla steg under kopplingsreaktionen. Efter detta öppnar du en förseglad NHS-aktiverad crosslinked agarose kolumn. Applicera en droppe buffert på adapterns inlopp, för att förhindra att luft kommer in i kolonnen.Montera sprutadaptern vid pelarinloppet. Tvätta kolonnen med sex milliliter iskall en millimolar saltsyra, med en flödeshastighet mindre än en milliliter per minut. Med hjälp av en två milliliter spruta, injicera omedelbart 1,5 milliliter DFE-lösning vid en flödeshastighet mindre än en milliliter per minut.Och samla flödet genom fraktion på en precisionsskala för efterföljande analys. Försegla kolonnen i båda ändar och inkubera i 15 till 45 minuter, vid 22 grader Celsius. Nästa injicera sex milliliter av aktiveringslösningen, följt av sex milliliter låg pH-lösning, vid en flödeshastighet mindre än en milliliter per minut, avlägsna icke kovalent bundna ligander från hartset.Injicera sex milliliter av aktiveringslösningen, och inkubera kolonnen i 15 minuter. Efter detta injicerar du sex milliliter låg pH-lösning i kolonnen. Följt av sex milliliter av aktiveringslösningen.Injicera sedan ytterligare sex milliliter låg pH-lösning i kolonnen. Injicera två milliliter lagringslösning i kolonnen och förvara den i fyra grader Celsius. Först förbereda 100 milliliter av antingen den förtydligade växtextrakt som innehåller 2F5, eller supernatanten för den föredragna cell baserade uttryckssystem, som också innehåller 2F5.Nästa förbereda jämviktsbuffert, och den höga järn X styrka illusion buffert, som beskrivs i textprotokollet. Spola kromatografisystemet med buffertarna. Montera en DFE-affinitetskolumn på kromatografisystemet.Och jämvikt med fem CV av jämviktsbuffert, med en flödeshastighet på en milliliter per minut. Övervaka UV-absorbansen vid 280 nanometer. Ladda sedan 80 milliliter av antingen det klarklarade växtextraktet, eller supernatanten på kolonnen med en flödeshastighet på 5 milliliter per minut.För att garantera en kontakttid på två minuter. Samla flödet genom prover i två milliliter fraktioner eller genombrott kurva återuppbyggnad. Förvara flödet genom prover vid fyra grader Celsius, om omedelbar provanalys inte är möjlig.Efter denna tvätta kolumnen med 6CV av jämvikt buffert. Samla ett prov i början, mitten och slutet av tvätten. Späd MAB2F5 med fem volymer av hög jonisk styrka illusion buffert.Samla UPP DFE-fraktionen när UV-signalen vid 280 nanometer har ökat till fem milli absorbansenheter över baslinjen. Optimera illusionsbufferten för varje epitop-antikroppspar, som det beskrivs i textprotokollet. Fusionsproteinet DFE uttrycks i transgena tobaksplantor, odlade i ett växthus.Den totala återhämtningen av DFE är 23,5 milligram per kilo. Med en renhet på över 90%Den absoluta mängden DFE immobiliserade på hartset ökar med massan av DFE injiceras i kolumnen, och platåer på cirka 15 gram per liter, medan kopplingen avkastningen minskar kontinuerligt som mer DFE injiceras. DFE-molekylerna ses behålla sin röda florescens, även efter koppling.Färgintensiteten motsvarar den totala mängden immobiliserad DFE. Därför kolumnfärg kan användas som en enkel kvalitetskontroll parameter för att uppskatta kopplingen effektivitet, och kolumnkvalitet. Den rekombinanta 2F5-antikroppen är transiently producerad i Nicotiana benthamiana växter som odlas i en phytotron.Avskiljning av 2F5 från rå växt extrakt, testas med hjälp av affinitet kolumner, tillsammans med cirka sju milligram renad DFE. En magnesiumkloridkoncentration på 1,25 molar är tillräcklig för att eluera 2F5 från DFE-tillhörighetsharts med en återhämtning nära 100%och en renhetsgrad på cirka 97%som är jämförbar med Protein A-hartser. DBC av DFE affinitet harts på 10%2F5 genombrott, minskar linjärt under loppet av 25 cykler, till cirka 15%av det ursprungliga värdet.Vi använde en design av experiment tillvägagångssätt för att optimera kopplingskapaciteten hos vår affinitets ligand. Dessa villkor kan finjusteras för andra ligander i framtiden. Vår metod använder florescent protein för att tråda en sub carrier protein för produkten specifika ligand.Samtidigt bara lägga till funktioner som en visuell kvalitet indikator på mobiliseringsförfarandet, vilket ger en omedelbar och intuitiv feedback till operatören.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile och effektiv strategi för produktion av Vändbar disulfid Tvärbundna Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Fastställande av hög affinitet antikropp-antigenbindning Kinetics med fyra Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

En filtreringsbaserad metod för att förbereda högkvalitativ nukleär från tvärbunden skelettmuskel för kromatinimmunutfällning

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Bänkmonterade orörlig metall affinitetskromatografi, beredning och analys av en Polyhistidine Taggad Metalloenzyme för grundutbildning laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Oriktad flytande kromatografi-Mass Pektrometri-Baserade metabolomika analys av vetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Snabb bestämning av antikropp-antigen affinitet genom Mass Photometry

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellfri produktion av proteoliposomer för funktionell analys och antikroppsutveckling riktad mot membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Utveckling av en immunokromatografisk remsa för lateralt flöde för snabb och kvantitativ detektion av små molekylföreningar

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...