Name: activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

İbrahim Al Amedi'ye transgenik tütün bitkilerini yetiştirdiği için ve Dr. Thomas Rademacher'e tütün ekspresyonu vektörü sağladığı için teşekkür etmek istiyoruz. Yazarlar DFE yakınlık ligand yapısı hakkında verimli tartışmalar için editoryal yardım ve Markus Sack için Dr Richard M. Twyman teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Hibe No altında Fraunhofer-Gesellschaft İç Programları tarafından finanse edilmiştir. 125-600164 çekmek ve Leistungszentrum hibe no 423 altında Kuzey-Ren-Vestfalya devlet "Ağ, adaptif üretim". Bu çalışma Deutsche Forschungsgememeinschaft (DFG) tarafından Araştırma Eğitim Grubu "Tümör hedefli İlaç Dağıtımı" hibe 331065168 çerçevesinde desteklenmiştir. GE sağlık bu makalenin açık erişim yayın destekledi.

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Roman affinity resin uygulamaları
MAbs'nin yakalanması için özel yakınlık kromatografi reçinelerinin, NHS tarafından aktive edilen çapraz bağlı agarose'a mAb'ye özgü bir epitop içeren bir ligandın immobilize edilerek üretilebildiği gösterilmiştir. Böyle bir rezorin tasarlamak için epitop dizisini bilmek ve lineer bir epitop kullanmak gerekiyordu. Ortaya çıkan rejenler mAbs'nin yakalanması için avantajlıdır, çünkü pahalı Protein A affinity kromatografi adımlarının yerini alabilir. Olgu tetkiklerimizde 2F5 ve DFE arasındaki etkileşim epitop-paratop bağlanması ile aracılık edilebildi, bu nedenle ligandımız protein A'dan daha seçici olmalıdır, bu da çoğu murine ve insan IgG'nin Fc bölgesine bağlanır. Her mAb için bireysel ligandlar gerekli olduğundan, yöntemimiz başlangıçta çok büyük ölçekte üretilen antikorlar için uygun görünebilir. Ancak, hızlı bitki bazlı geçici protein ekspresyonu ile yaklaşımımızı birleştirerek, yeni afinite ligands az 2 hafta içinde hazırlanabilir27 minimal çabaile 28. Bu nedenle, yöntem de küçük ölçekli mAb arıtma için uygundur.
Üretim ve yakınlık ligand potansiyel iyileştirmeler
Bitkiler yakınlık ligandsiçinhızlı ve güvenli bir üretim platformu sunuyoruz 5,29,30, DFE füzyon proteini gibi bizim vaka çalışmasıözellikli. Bitki materyalinin beyazlatma büyük ölçüde tek bir adımda konak hücre proteinlerinin miktarını azalttı ve kolayca standart bir açıklama rutin entegre edildi. Ancak, ligand kurtarma mevcut kurulum düşük, muhtemelen orta termal stabilite ve filtre katmanları bazı non-spesifik bağlama nedeniyle, diğer ürünler için bildirilen31,32,33. Mühendislik taşıyıcı termal istikrarı artırmak için bu nedenle gelecekte ligand verimi artırmak için yardımcı olabilir, sıtma aşısı adayı CCT için açıklandığı gibi, antitümör enzim PpADI veya mezofilik β-glukozidaz34, 35,36. Aynı protein mühendisliği filtre malzemesi37non-spesifik bağlama azaltmaya yardımcı olabilir derinlik filtrasyon adım için geçerlidir. DFE ve benzeri ligandlar için üretim maliyetleri de flocculants veya filtre katkı maddeleri kullanarak açıklama genel verimliliğini artırarak azaltılabilir38,39.
DsRed taşıyıcı olarak kullanıldığında tetramerik bir kompleks oluşturur. Bu, ligand başına epitopsayısı artar, çünkü avantajlıdır, ama aynı zamanda afinite kromatografi sırasında demontaj veya denatürasyon ligand daha duyarlı hale getirebilir. Düşük pH40kararlı olduğu için mCherry gibi monomerik taşıyıcı protein tercih edilebilir, ve epitop tandem tekrarları dahil ligand avidite artacak ve böylece reçine kapasitesini artırmak5, 26.000 , 41. Basit taşıyıcı-epitop proteinler için (yani, disülfür bağı veya çeviri sonrası modifikasyonları olmayanlar) mikrobiyal üretim sistemleri üretim maliyetlerini azaltabilir ve ligandları Protein A ile daha rekabetçi hale getirebilir. Örneğin, yeşil floresan protein ~ 1 g·kg-1 biyokütle verimi ile bakteri hücrelerinde ifade edilmiştir, hangi önemli ölçüde ligand üretim maliyetlerini azaltacak42.
Ne olursa olsun ifade ana bilgisayar, saflaştırılmış bir yakınlık ligand aksi takdirde reçine seçicilik ve kapasitesini azaltabilir konak hücre proteinleri veya medya bileşenlerinin immobilizasyonen en aza indirmek için kaplin sırasında gerekli oldu. IMAC arınma için bir poli-histidin etiketi dahil tek bir adımda ~ 90% saflık arttı, hızlı ve ucuz ligand üretimi kolaylaştırmak5,43,44. Ancak, bu steral epitop bağlanmasını engellemek veya taşıyıcı45veya epitop ya dekolte indüklemek için potansiyele sahiptir çünkü füzyon etiketinin konumu önemlidir 45,46.
NHS-aktive kromatografi kolonlarında afinite ligandın immobilizasyonu
İmmobilizasyon el ile veya kromatografi sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Sütun başına küçük tampon hacimleri manuel kullanımdan yana görünüyordu (örn. minimum atık hacimleri nedeniyle). Ancak, birden fazla/daha büyük sütun gerekiyorsa, kromatografi sistemi bağlantı koşullarını kontrol etmeyi kolaylaştırır (örn. düzenlenmiş akış hızları) ve bu nedenle DBC açısından tekrarlanabilir sonuçlar elde etme olasılığı daha yüksektir. Verilerimiz, bağlantı arabelleği ve pH'ın bağlantı verimliliği ve genel sütun maliyetleri üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Kaplin reaksiyonunu etkileyen tarama faktörleri ve her taşıyıcı protein için ayarlanması (hatta her taşıyıcı-ligand füzyonu için) bu nedenle bağlantı verimliliğini ve reçin performansını artırabilir ve bu yaklaşımı öneriyoruz.
DFE afinite reçiyinkullanarak 2F5 izolasyontest
Ürün verimi ve saflık rekarne performansının önemli yönleridir ve DFE durumunda 105 ± %11 (±SD, n=3) ve %97 ± 3 saflık (±SD, n=3) elde ettik ve bu da kıyaslama Protein A rekarnelerinin performansıyla karşılaştırılabilir25 ,26. Genel olarak rekarneler için bir diğer önemli performans göstergesi (ve özellikle afinite ligands dayalı olanlar için) DBC% 10 ürün atılım, bu parametre belirli bir işlem ve böylece maliyetleri için gerekli rekarin miktarını etkilediği için. DFE ligand için, ilk DBC ~4 g· L-1 rezorin, benzer koşullar altında Protein A için karşılık gelen değerin ~% 13 (sadece 2 dk temas süresi)25,47 ama yaklaşık 15 kat daha yüksek gibi diğer özel afinite recins göre anti-FSH-immünafinite ligand 2 dk48aynı ikamet süresi kullanarak . DFE DBC 25 bind-ve-elute döngüleri sonra başlangıç değerinin% 15'e geriledi, 50'den fazla döngüleri ticari Protein A reisins49DBC aynı kaybı için gerekli ise . Ancak, taşıyıcımızın henüz protein A ile aynı ölçüde optimize edilmemiş olduğunu belirtmek önemlidir, bu da son 40yılda kapsamlı bir şekilde araştırılmış ve geliştirilmiştir 8.
Şimdiye kadar düşük pH elüsyon tampon magnezyum klorür yüksek konsantrasyon (Şekil3),daha önceki çalışmalarda tavsiye 13 geçişyaparak rezorin stabilitesi ve ürün kurtarma geliştirdik. Yakınlık ligand karakteristik kırmızı renk 25 bind-ve-elute döngüleri sırasında önemli ölçüde solmaya vermedi, bu yüzden açıklık bitki özleri endojen bitki proteses31 kesilmiş olabilir ve böylece epitop inaktive ligand. Bu nedenle, taşıyıcı ve epitop bağlamak için proteaz dirençli bağlayıcılar tasarımı döngüleri uzun sayıda üzerinde ilk DBC korumak için yardımcı olabilir. DFE ligandının hızlı ve basit bir şekilde ifade edilip saflaştırılması, ticari kromatografi reçinelerine bağlanması ve mükemmel ürün verimi ve saflığı göz önüne alındığında, yöntemimizin Protein A'ya uygun bir alternatif sunduğuna inanıyoruz. özellikle taşıyıcı ve bağlayıcıdaki iyileştirmeler DBC ve ligand stabilitesini iyileştirebiliyorsa, Protein A'ya bağlanmayan mAb'lerin ve antikor türevlerinin saflaştırılması. Bu varsayım DFE saflaştırılmış ve Protein A-saflaştırılmış 2F5 antikor5dissosilasyon sabitindeki küçük fark tarafından desteklenerek, yeni yakınlık ligand'ımızın yüksek kaliteli mAbs'lerin geri kazanılmasına olanak sağladığını göstermiştir.
Yöntemin yararları ve mevcut sınırlamaları
Taşıyıcı protein ile genetik füzyon olarak yakınlık ligand üretmek sulu tamponlarda çözünürlüğü ve böylece tipik ligand kaplin koşulları ile uyumluluğu artırır. Buna karşılık, katı faz peptid sentezinden elde edilen boş peptidler,mAb tarafından tanınan epitopun amino asit dizisi tarafından dikte edildiği için değiştirilememiştir, 50 sırası nedeniyle bu koşullar altında sınırlı çözünürlüğe sahip olabilir. arındırılabilir. Diğerleri bu nedenle peptit ligands bir on-rekarne sentezi kullanmış51. Elde edilen reçinenin statik bağlama kapasitesi yüksekti (~80 g· L-1), ancak reçine hazırlama süreci uzundur, dinamik bir bağlama kapasitesi rapor edilmemiş ve elde edilen saflık ve geri kazanım yaklaşımımıza göre daha düşüktür. Laboratuvar ölçeğinde bir füzyon protein ligand ek bir avantajı ligand ve bunların varyantları hızla üretilebilir, saflaştırılmış ve kolay kullanımı yüksek ekspresyon sistemi52en az çaba ile test edilebilir.
Burada sunulan yöntemin iki güncel sınırlaması 3 g· düşük dinamik bağlama kapasitesidir. L-1 ve 25 bind-ve-elute döngüleri5boyunca% 90 azalma . Bu sınırlamalar gelecekte daha az sıkı yükleme koşulları uygulanarak ve geçerli DsRed taşıyıcısının sırasıyla tasarlanmış, daha kararlı bir varyantla değiştirilmesiyle giderilebilir. Örneğin, geçerli temas süresini 2 ila 4 dakika arasında iki katına çıkarmak, bazı Protein A reçinekleri26'dagösterildiği gibi dinamik bağlama kapasitesini iki katına çıkarma potansiyeline sahiptir.
Sorun giderme
Aşağıdaki tablo, bu protokol sırasında karşılaşılabilen olası sorunları vurgular ve bunlarınnasıl çözüleceğiniz hakkında ipuçları sağlar (Tablo 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tablo 1: Karşılaşılabilen olası sorunlar ve olası düzeltmeler.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokol adımı</td>
			<td>Sorun</td>
			<td>Sebebi</td>
			<td>Düzeltmek</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Bitkiler yetişmiyor</td>
			<td>Uzlaşmalı büyüme koşulları</td>
			<td>Gübrenin pH'sını ve iletkenliğini kontrol edin</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sıcaklık ve ışık koşullarını kontrol edin</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ve 3</td>
			<td>Ekstraksiyondan sonra büyük miktarlarda konak hücre proteinleri bulunur.</td>
			<td>Eksik yağış</td>
			<td>Beyazlatma sırasında sıcaklığı kontrol edin</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Beyazlatma banyosundaki ajitasyonu kontrol edin</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ve 3</td>
			<td>Bitki ekstresinde ürün bulunamadı</td>
			<td>Beyazlatma sıcaklığı çok yüksek</td>
			<td>Beyazlatma sırasında sıcaklığı ve pH'ı kontrol edin</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH beyazlatma tampon çok düşük</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Büyük sap veya yaprak parçaları çıkarmadan sonra kalır</td>
			<td>Blender'da eksik karıştırma</td>
			<td>Tesis malzemesinin blender'da fiş oluşturmadığından emin olun</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Derinlik filtrasyonu sırasında hızlı basınç artışı</td>
			<td>Yanlış filtre seçimi ve/veya yönlendirme</td>
			<td>Filtre türünü ve yönünü kontrol edin</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Elüzyon sırasında küçük füzyon proteini / akış yoluyla füzyon protein bir sürü</td>
			<td>IMAC reşini metal iyonları ile şarj edilmedi</td>
			<td>IMAC reşinini iyonlarla doğru şekilde şarj edip olmadığını kontrol edin</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Füzyon proteini afinite etiketini kaybetti</td>
			<td>Bitki yetiştiriciliği sırasında yoğun güneş ışığından ve yüksek sıcaklıklardan kaçının</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Konsantrasyon sırasında kaybedilen füzyon proteini</td>
			<td>Membrana bağlı füzyon proteini</td>
			<td>Membran türünü kontrol edin</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Konsantrasyon faktörünün çok yüksek olmadığından emin olun</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Düşük bağlantı verimi</td>
			<td>Bağlantı reaktifi ekinin yanlış sırası</td>
			<td>Reaktif etiketlerini ve ekleme sırasını kontrol edin</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Bağlantıdan önce sütunların yanlış hazırlanması</td>
			<td>Sütun preparaton koşullarını kontrol edin</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ve 6</td>
			<td>Düşük mAb verimi</td>
			<td>Bitki biyokütlesinde düşük mAb ekspresyonu</td>
			<td>Biyokütlede test mAb ekspresyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Düşük ligand yoğunluğu</td>
			<td>Füzyon protein preparatının saflığını kontrol edin</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Bradford satoklarında çok düşük/yüksek protein konsantrasyonları</td>
			<td>Pipetleme sırasında kabarcık oluşumu</td>
			<td>96-iyi palte kabarcıklar için kontrol edin</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>SPR ölçümü sırasında düşük mAb konsantrasyonu</td>
			<td>Tehlikeye Protein Bir çip</td>
			<td>Bilinen konsantrasyon ile standart mAb sonuçları ile karşılaştırın</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Yanlış numune seyreltme</td>
			<td>Seyreltme oranını ve tamponu kontrol edin</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Sorun giderme.

Biyofarmasötik ürünler tıbbın hemen hemen her dalında hastalıklarıngeniş bir yelpazede tedavisi için önemlidir 1. Monoklonal antikorlar (mAbs) biyofarmasötik pazarına hakim, dünya çapında satış 20202yılında yaklaşık 110 milyar € ulaşması bekleniyor. mAbs için tercih edilen ifade platformu Çin hamster over hücre hatları, genellikle kültür supernatant3,410 g'L-1 kadar yüksek mAb titreleri üretmek vardır. Ancak, memeli hücre kültürlerinde mAbs üretimi orta yüksek maliyet ve steril fermantasyonihtiyacı nedeniyle pahalı 5. Bitkiler gibi alternatif ifade platformları potansiyel endüstriyel üretim için daha hızlı, basit, daha az pahalı ve daha ölçeklenebilir bir yaklaşım sunuyoruz6,7.
Memeli hücre kültürleri ile ilgili maliyetlere ek olarak, protein a a affinity kromatografisinin ürün yakalamada yaygın kullanımı, mAbs'lerin endüstriyel üretimi için önemli bir maliyet itici gücüdür. Protein A doğal Staphylococcus aureus hücrelerinin yüzeyinde bulunan ve bazı murine ve insan antikorlarının parça kristalize (Fc) bölgeye bağlanır, bu nedenle mizahi bağışıklık sistemi kaçınmak için bir savunma mekanizması olarak hareket8. Protein A hücre kültürü supernatants mAbs yakalamak için sanayi altın standart haline gelmiştir ve aynı zamanda yaygın olarak araştırma topluluğu tarafından son derece seçici olduğu için kullanılır, genellikle tek bir adımda ~ 95% mAb saflıkları elde8. Beklendiği gibi, son yirmi yılda Protein A satışları yakından mAbs satış yansıtmıştır8. Üretim ölçeğine bağlı olarak, Protein A'nın maliyeti toplam proses maliyetlerinin %25'inden fazlasına karşılık gelebilir ve bu nedenle 2.000 € g-15,9€'yakadar olabilir terapötik mAbs, piyasa fiyatını etkileyebilir. Bu nedenle, benzer bir arıtma performansına sahip alternatif kromatografi reçinejleri üretim maliyetlerini önemli ölçüde düşürme potansiyeline sahiptir, bu da antikor bazlı tedavileri daha fazla sayıda hasta için erişilebilir hale getirir10,11 ,12. Bu tür alternatifler, düşük pH'daki sert elüsyon koşulları da dahil olmak üzere Protein A kromatografisinin dezavantajlarını da aşabilir (tipik olarak <3.5) mAbs'nin agregasyonu teşvik eden konformasyonel değişikliklere uğramasına neden olabilir13 . Daha da önemlisi, Protein A sadece belirli IgG alt sınıflarının Fc bölgesi için seçicidir, bu nedenle kesilen bağlayıcı etki alanları olan işlevsel olmayan moleküller bozulmamış ürün5ile birlikte arındırılabilir, oysa mAb tek zincirli değişken parçaları gibi türeyen Protein A'ya hiç bağlanmaz.
Burada, doğrusal epitop ELDKWA (bir harf amino asit kodu)5,14kullanarak HIV nötralize mAb 2F5 yakalamak için alternatif bir yakınlık kromatografi reçine açıklar. 2F5 epitopunu, taşıyıcı ve muhabir molekül olarak işlev gören floresan protein DsRed'in C-terminusuna genetik olarak erittin ve transgenik tütünde Ortaya çıkan DsRed-2F5-Epitop (DFE) proteinini ürettik ( Nicotiana tabacum) bitkiler. DFE tek adımlı immobilize metal-iyon afinite kromatografisi (IMAC) ile saflaştırılmıştı. Saflaştırılmış DFE afinite ligand bir çapraz bağlı agarose resin üzerine immobilizasyon n-hidroksisuccinimid kullanılarak kimyasal kaplin elde edildi (NHS)-aktive çapraz bağlı agarose sütunlar. İstatistiksel deneysel tasarımlar daha sonra immobilizasyon prosedürü ve kaplin verimliliği optimize etmek için kullanılmıştır15. mAb 2F5 için arınma stratejisi antikor saflığı, verim ve ligand stabilitesi açısından değerlendirilmiştir. Fc bölgesini bağlayan Protein A'nın aksine, DFE 2F5'in tamamlayıcılık belirleyici bölgesine bağlı karak, moleküllerin sağlam bir paratopla arınmasını sağlar. Konseptimiz herhangi bir mAb'ye doğrusal epitop ile veya mikrodizi çalışmaları ile kolayca tespit edilebilen diğer peptid bazlı afinite ligandlara kolayca adapte edilebilir16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> Şekil 1: Ham bitki özlerinden veya hücre kültürü süpernatantlarından mAbs yakalama için kullanılabilecek epitop afinite reçinelerinin hazırlanması için proses akış şeması. (A) Transgenik tütün bitkilerinde ligand DFE yakınlığı ifade edilebistir. Hasat edilenyapraklar homojenize edilmeden önce bir ısı yağış adımı (B) dahil edilmiştir (C). (D) Ham bitki özü torba filtrasyon, derinlik filtrasyon ve 0,2 μm steril filtrasyon ile açıklığa kavuşturulmuştur. (E) DFE daha sonra IMAC tarafından arındırıldı. (F, G) Saflaştırılmış DFE yakınlık ligand EDC / NHS-aktif çapraz bağlı agarose sütunlar üzerinde immobilize edildi. (H) T-DNA kodlayıcı antikor 2F5 taşıyan bakteri kültürleri, fitotronda yetişen N. benthamiana bitkilerindegeçiciifade için kullanılmıştır. (J) N. benthamiana yaprakları hasat edildi ve D. (K) mAb 2F5'te açıklandığı gibi işlendi, DFE yakınlık sütunları (L) kullanılarak açıklık ekstresinden arındırıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10L/20L Bucket</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td>Hach</td>
			<td>4650000</td>
			<td>Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTApure</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 2G12</td>
			<td>Fraunhofer IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standard for SPR quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-410</td>
			<td>Fuhr</td>
			<td>2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CanoScan 5600F</td>
			<td>Canon</td>
			<td>2925B009</td>
			<td>Scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td>Labomedic</td>
			<td>1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose FF</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0575-01</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cond 3320</td>
			<td>WTW</td>
			<td>EKA 3338</td>
			<td>Conductometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design-Expert(R) 8</td>
			<td>Stat-Ease, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Compfort</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F81029</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4984.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diverse bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Glas bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block DB8</td>
			<td>Techne</td>
			<td>Z381373</td>
			<td>Heat block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Fraunhofe IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2390-0000</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHG-912</td>
			<td>Oregon Scientific</td>
			<td>086L001499-230</td>
			<td>Thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9-C</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29027743</td>
			<td>Fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferty 2 Mega</td>
			<td>Kammlott</td>
			<td>5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma -86C ULT freezer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>2400</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0716-01</td>
			<td>Chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3899.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K700</td>
			<td>Pall</td>
			<td>5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KM02 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KS50P 60D</td>
			<td>Pall</td>
			<td>B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S 24</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda E300</td>
			<td>Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td>Z90010</td>
			<td>Immersion circulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>Filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>Vacuum filtration of SPR buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel sulphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T111.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0336BOX</td>
			<td>LDS-PAA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex X-cell Mini Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>PAGE chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 20x running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Buffer concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein ladder (10-180 kDa)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26616</td>
			<td>Protein standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated bucked</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH 3110</td>
			<td>WTW</td>
			<td>2AA110</td>
			<td>PH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Electrophoresis module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7837-5MG</td>
			<td>Coating of SPR chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17003301</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spoon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>Gel staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6773.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X891.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>HN13.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>243973-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosophate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T877.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>SPR-AS-HCA</td>
			<td>SPR chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>n/a</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSM3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>10034264</td>
			<td>Mini Gyro-rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated vessel, 20 L</td>
			<td>Clatronic</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes, 2 mL</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe adpter (Union Luer F)</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>181112-51</td>
			<td>Syringe adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE6101</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>TE6101</td>
			<td>Precision scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polysorbate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8170721000</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn 6.4</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29056102</td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>203.392.84</td>
			<td>Plant storge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VelaPad 60</td>
			<td>Pall</td>
			<td>VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK-26/20 column housing</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>28-9889-48</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study

Monoklonal antikorların (mAbs) saflaştırılması genellikle protein A affinity kromatografisi ile elde edilir, bu da genel proses maliyetlerinin %25'ini karşılayabilir. Alternatif, uygun maliyetli yakalama adımları bu nedenle, tek bir mAb büyük miktarlarda üretilen endüstriyel ölçekli üretim için değerlidir. Burada, Protein A kullanmadan, HIV nötralize edici antikor 2F5'in ham bitki özlerinden seçici olarak yakalanmasına olanak tanıyan çapraz bağlantılı agarose reçine DsRed tabanlı epitop ligand'ın immobilizasyonu için bir yöntem salıyoruz. Lineer epitop ELDKWA ilk olarak genetik olarak floresan protein DsRed ile kaynaşmış ve füzyon proteini transgenik tütün(Nicotiana tabacum)bitkilerinde immobilize metal-iyon afinite kromatografisi ile saflaştırmadan önce ifade edilmiştir. Ayrıca, aktif çapraz bağlı agarose dayalı bir yöntem yüksek ligand yoğunluğu, verimli bağlantı ve düşük maliyetler için optimize edilmiştir. PH ve tampon bileşimi ve çözünür ligand konsantrasyonu, deneylerin tasarımı yaklaşımı kullanılarak geliştirilmiş olan bağlantı işlemi sırasında ki en önemli parametrelerdi. Ortaya çıkan afinite reşin seçici bir ham bitki ekstresi hedef mAb bağlamak için yeteneği için test edildi ve elüsyon tampon yüksek mAb kurtarma, ürün aktivitesi ve yakınlık reşin istikrar için optimize edilmiştir. Bu yöntem doğrusal epitopslarla diğer antikorlara kolayca adapte edilebilir. Yeni reçinler Protein A'dan daha nazik elüsyon koşullarına izin verir ve aynı zamanda mAb üretimi için ilk yakalama adımının maliyetini azaltabilir.

İfade ve yakınlık ligand arınma
Füzyon proteinI DFE bir serada yetiştirilen transgenik tütün bitkileri ifade edildi. Verim ~ 120 mg·kg-1 yaprak kütlesi bitki başına ~ 130 g ortalama biyokütle idi. DFE saflığı beyazlatma dan önce ham bitki özlerinde TSP'nin %5'i ydi ancak 70 °C'de ısıl işlemden sonra 1,5 dakika boyunca ~%40'a yükseldi ve bu da konak hücre proteinlerinin %97'sini çöktürdü. Beyazlatma adımı kolayca hasat ve çıkarma rutin entegre edildi (Şekil1) ve su banyosu kurma da dahil olmak üzere ekstra zaman az 2 saat sürdü. DFE'nin genel geri kazanımı 23.5 mg kg1 ve saflık >%90 idi. Ürün kaybından sorumlu adımlar beyazlatma, derinlik filtrasyon ve IMAC idi ve bunlar sırasıyla %40, %27 ve %45'lik özel kayıplara neden oldu. Derinlik filtre kapasitesi ortalama 135 ± 36 L m-2 (±SD, n=3) ve böylece literatürde bildirilen değerlerin üst aralığında21idi. Bitki yaşı ile birlikte DFE verimi artmıştır (Şekil 2).
NHS-aktive kromatografi kolonlarında afinite ligandın immobilizasyonu
İlk kaplin testlerinde HEPES tamponu (pH 8.3) kaplin verimliliğini %89 ± 6 'ya (±SD, n=3) yükselttiği, üretici tarafından önerilen bikarbonat tamponu için %78 ± 9 (±SD, n=3) olduğunu bulduk. Bu nedenle, HEPES sonraki tüm bağlantı deneyleri için kullanılmıştır. DFE'nin NHS tarafından etkinleştirilen çapraz bağlantılı agarose regin'e bağlantı verimliliğini optimize etmek için bir DoE yaklaşımı seçildi. Reçine üzerinde hareketsiz dfe mutlak miktarı sütuniçine enjekte ve ~ 15 g· platolanmış DFE kütlesi ile arttı L-1 ise daha fazla DFE enjekte edildikçe kaplin verimi sürekli olarak azalmıştır (Şekil 2). Kaplin verimi de >50% daha düşük bir asidik tampon, bir vaka-by-case bazında her ligand için uygun kaplin koşulları için ekran ihtiyacı gösteren oldu. DoE yazılımının sayısal optimizasyon aracı kullanılarak bağlantı verimi açısından ideal koşullar, hareketsiz DFE ve sütun maliyetlerinin mutlak miktarı belirlenmiştir. En çok arzu edilen koşullar (pH 9.0 ve 7.0 mg DFE 1 mL çapraz bağlı agarose reçine) büyük bir plato üzerinde yer almakta ve bu nedenle sağlamdı. DFE molekülleri kaplinden sonra bile kırmızı floresanlarını korudular ve renk yoğunluğu hareketsiz DFE'nin toplam miktarına karşılık gelirdi (Şekil 2). Bu nedenle, sütun rengi bağlantı verimliliğini ve sütun kalitesini tahmin etmek için basit bir kalite kontrol parametresi olarak kullanılabilir. Floresan ayrıca DFE füzyon proteininin tetramerik olarak biraraya geldiğini doğruladı.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> Şekil 2: DFE immobilizasyonunun NHS tarafından aktive edilen çapraz bağlantılı agarose regin'e optimizasyonu. (A) LDS-PAA jel homojen ve elüsiyon örnekleri nin batı leke blay ile unblanched ve blanched transgenik DFE bitki özleri. Bitkilerin hasadı tohumlamadan 38, 45 veya 52 gün sonra yapıldı. Batı lekeleri bir anti-His6-antikorlar kullanılarak yapıldı5. (B) NHS tarafından aktive edilen çapraz bağlı agarose sütunlarına enjekte edilen pH ve saflaştırılmış DFE'nin toplam kütlesi nin bağlı olduğu toplam dfe afinite ligand miktarı. Kırmızı noktalar, yanıt yüzeyi modelini oluşturmak için yapılan gerçek deneyleri gösterir. (C) Bağlama işleminden sonra DFE yakınlık sütunları. Sayılar panel B. dps = gün sonrası tohumlama vurgulanan kaplin koşullarına karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
DFE afinite reçiyinkullanarak 2F5 izolasyontest
Rekombinant 2F5 antikor geçici bir fitotron5yetiştirilen Nicotiana benthamiana bitkilerde üretildi. Ham bitki ekstresinden 2F5'in ele geçirilmesi ~ 7.0 mg saflaştırılmış DFE (adım 6) ile birleştiğinde yakınlık sütunları kullanılarak test edilmiştir. Protein A reisinler elution genellikle asidik bir tampon içerir (pH ~ 3.3)13. Bu nedenle, başlangıçta DFE sütunları için farklı düşük pH elüsasyon arabelleklerini (pH 6.0-3.25) değerlendirdik. 2F5'in elüsasyonu 4.5'in altındaki pH değerlerinde başarılı oldu ve pH 3.25'te ~%35'lik en yüksek iyileşme ile başarılı oldu. Ancak, düşük pH elution hem antikor (SPR spektrometresi tarafından doğrulandı) ve DFE ligand (renk kaybı ve alt DBC ile gösterildiği gibi, Şekil3) inaktive. İkincisi, pH <4.022,23de yerli DsRed denatüre verilen beklenen oldu . Ürün ve ligand denatürasyonu önlemek için, daha önce diğer affinity reçine 24 mAbs eute için kullanılan çünküalternatif bir elüsülasyon ajanı olarak magnezyum klorür test etti. Magnezyum klorür konsantrasyonu 1.25 M'lik bir magnezyum klorür konsantrasyonu DFE afinite rekarinin 2F5'i 105 ± %11 (±SD, n=3) ve %97 ± 3 saflık (±SD, n=3) ile yakınlaştırmaya yeterliydi. Bu performans Protein A reisins25,26karşılaştırılabilir oldu. DFE saflaştırılmış 2F5 antikorve sentetik ligand Fuzeon denge dissosilasyon sabiti (K D) 791 pM ise Protein A-saflaştırılmış muadili 763 pM5idi . Ayrıca reçinde toplam 25 bağlama ve elute döngüsünde önemli bir renk kaybı gözlenmedi. DFE yakınlık reseninin DBC değeri %10 2F5 atılımı ile 25 döngü boyunca doğrusal olarak gerilerekbaşlangıç değerinin ~%15'ine düşmüştür (Şekil 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> Şekil 3: DFE afinite reçinelerini kullanarak 2F5'in açıklıklı bitki özlerinden izolasyonunun test edilmesi. (A) DFE yakınlık, 4.0-3.0 aralığında farklı pH değerlerine sahip arabellekler ve pH 6.0'da nötralizasyon adımından sonra aynı reçiyleri kullanarak bir elüsyon döngüsünden sonra reçiyit reçiner. (B) DFE yakınlık eluent olarak 1,25 M veya 4,00 M magnezyum klorür kullanarak 2F5 arıtma bir ve altı döngüsonra reçines. (C) DFE reçinesinin elüent olarak magnezyum klorür kullanarak çevrime bağlı dinamik bağlama kapasitesini belirlemek için frontal yükleme deneylerinin (break-through eğrileri) kromatogramları. Kırılma eğrileri 4.0 M ve 1.25 M magnezyum klorür elüsyon tamponları ve çeşitli çevrim numaraları için ölçüldü. (D) DFE'nin çevrime bağlı dinamik bağlama kapasitesi 1,25 M magnezyum klorür eluent olarak kullanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Bu prosedürde, Bir DsRed tabanlı epitop ligand protein A alternatif olarak, ham bitki özleri veya hücre kültürü supernatants monoklonal antikorların yakalanması için son derece seçici afinite reçine üretmek için immobilize edilir.

Affinity Kromatografi Reçiyatlarının Hızlı Gelişimi İçin Aktif Çapraz Bağlantılı Agarose - Örnek Olay Olarak Antikor Yakalama

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Monoklonal antikorlar biyofarmasötik pazara hakimdir ve tipik olarak Protein A kromatografisi ile saflaştırılır. Buna göre reçine antikor bazlı terapötik fiyatını etkileyen üretim sırasında önemli bir maliyet sürücüsüdür. Burada yeni bir yakınlık ligand hiv nötralize antikor 2F5 doğrusal epitop için bir taşıyıcı olarak okunur floresan protein dayalı açıklar.Genel olarak yöntemimiz monoklonal antikorların yakalanmasında kullanılabilecek afinite kromatografi reislerinin hızlı bir şekilde üretilmesine olanak sağlar. Bu yeteneği ham bitki ekstresinden antikor 2F5 yakalayarak gösterdik. Dinamik bağlama kapasitesini ve reçine yeniden kullanılabilirliğini iyileştirmek için yakalama koşullarını ve çözüm arabelleğini optimize ettik.Rezorinimiz Protein A'dan daha genel olarak daha gevşek koşullara izin verir ve monoklonal antikorların saflaştırma maliyetlerini azaltma potansiyeline sahiptir. Ayrıca, rezorin kolayca lineer epitoplar bağlamak diğer antikorlara adapte edilebilir. Bu prosedüre başlamak için, hazırlanan afinite ligand çözeltisinin konsantrasyonuna, deneylerin tasarımında tanımlandığı şekilde litre başına 5 ila 15 gram aralığında olacak şekilde ayarlayın.Bağlantı reaksiyonu hazır olana kadar çözümü buzüzerinde saklayın. Sonra, dfe çözeltisi ile bir iki mililitreşli şırınga doldurun. Ve bir mililitre yatak hacmi ile NHS-aktive çapraz bağlantı agarose sütunlar üzerinde şırıngamonte monte etmek için bir adaptör hazırlayın.Bağlantı için kullanılan her 10 sütun için 30 mililitre devre dışı bırakma çözeltisi, 30 mililitre düşük pH çözeltisi ve bir mililitre depolama çözeltisi hazırlayın. Sonra bir tüp içinde bir milimolar hidroklorik asit 20 mililitre hazırlayın. Ve en az 20 dakika buzda kuluçkaya yatırın.Bağlantı reaksiyonu sırasında ki tüm adımlar için kesirler üzerinden akışını izlemek için hassas bir ölçek hazırlayın. Bundan sonra, mühürlü bir NHS-şifreli crosslinked agarose sütun açın. Havanın sütuna girmesini önlemek için bağdaştırıcı girişine bir damla arabellek uygulayın.Şırınga adaptörlerini sütun girişine monte edin. Altı mililitre buz soğuk bir milimolar hidroklorik asit ile sütun yıkayın, bir akış hızı daha az dakikada bir mililitre. İki mililitrelik şırınga kullanarak, dakikada bir mililitreden daha az bir akış hızında n1,5 mililitre DFE çözeltisi enjekte edin.Ve sonraki analiz için hassas bir ölçekte fraksiyonüzerinden akış toplamak. Her iki ucunda ki kolon mühür ve 22 santigrat derece, 15 ila 45 dakika kuluçka. Sonraki aktivasyon çözeltisi altı mililitre enjekte, düşük pH çözeltisi altı mililitre takip, dakikada bir mililitreden daha az bir akış hızında, reçine olmayan kovalent bağlı ligands kaldırın.Altı mililitre aktivasyon solüsyonu enjekte edin ve kolonda 15 dakika kuluçkaya yatın. Bundan sonra, sütuniçine altı mililitre düşük pH çözeltisi enjekte edin. Ardından altı mililitre aktivasyon çözümü.Sonra sütuna altı mililitre daha düşük pH çözeltisi enjekte edin. Sütuna iki mililitre depolama çözeltisi enjekte edin ve dört santigrat derecede saklayın. İlk 2F5 içeren açıklık bitki ekstresi ya 100 mililitre hazırlamak, ya da tercih edilen hücre tabanlı ifade sistemi için supernatant, aynı zamanda 2F5 içeren.Sonraki eşitlik arabelleği hazırlamak ve yüksek demir X mukavemeti yanılsama tampon, metin protokolünde belirtildiği gibi. Renkbilim sistemini tamponlarla temizle. Kromatografi sistemine bir DFE yakınlık sütunu monte edin.Ve dakikada bir mililitre akış hızında, denge tampon beş CV ile dengeleyin. UV emiciliğini 280 nanometreden izleyin. Daha sonra 80 mililitre ya açıklık bitki ekstresi, ya da dakikada 5 mililitre akış hızında sütun üzerine supernatant yükleyin.İki dakikalık bir temas süresini garanti etmek için. İki mililitrek veya atılım eğrisi rekonstrüksiyonörnekleri üzerinden akış toplamak. Hemen numune analizi mümkün değilse, numuneler üzerinden akışı dört santigrat derecede saklayın.Bu yıkamadan sonra equilibr tampon 6CV ile sütun yıkayın. Yıkamanın başında, ortasında ve sonunda bir örnek toplayın. MAB2F5'i beş cilt yüksek iyonik mukavemet liyasürü tamponuyla seyreltin.280 nanometredeki UV sinyali taban çizgisinin üzerinde beş milimetrelik emici üniteye yükseldiğinde DFE fraksiyonu toplayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi, her epitop-antikor çifti için yanılsama arabelleği optimize edin. Füzyon proteinI DFE transgenik tütün bitkileri, bir serada yetiştirilen ifade edilir.DFE'nin toplam toparlanması kilogram başına 23,5 miligramdır. %90'ın üzerinde bir saflıkla reçineüzerinde hareketsiz hale getirilen mutlak DFE miktarı, sütuna enjekte edilen DFE kütlesi ile artar ve litre başına yaklaşık 15 gram olan platolar, daha fazla DFE enjekte edildikçe kaplin verimi sürekli olarak azalır. DFE molekülleri, kaplin sonra bile, kırmızı floresan korumak için görülür.Renk yoğunluğu, hareketsiz DFE'nin toplam miktarına karşılık gelir. Bu nedenle sütun rengi, bağlantı verimliliğini ve sütun kalitesini tahmin etmek için basit bir kalite kontrol parametresi olarak kullanılabilir. Rekombinant 2F5 antikor geçici bir fitotron yetiştirilen Nicotiana benthamiana bitkilerde üretilir.Ham bitki özü 2F5 yakalama, saflaştırılmış DFE yaklaşık yedi miligram ile birleştiğinde, yakınlık sütunları kullanılarak test edilir. Magnezyum klorür konsantrasyonu 1.25 molar bir iyileşme yakın bir iyileşme ile DFE afinite rezorneden 2F5 elute için yeterlidir 100%ve protein A resinile karşılaştırılabilir yaklaşık% 97 saflık. DFE yakınlık resen10%2F5 atılım dbc, ilk değerinin yaklaşık% 15, 25 döngüleri boyunca doğrusal azalır.Yakınlık ligandımızın bağlantı kapasitesini optimize etmek için bir deney tasarımı yaklaşımı kullandık. Bu koşullar gelecekte diğer ligandlar için ince ayarlı olabilir. Yöntemimiz ürüne özgü ligand için bir alt taşıyıcı protein iplik floresan protein kullanır.Aynı zamanda sadece operatöre anında ve sezgisel geribildirim sağlayarak, seferberlik prosedürügörsel bir kalite göstergesi olarak işlevleri ekleyin.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Kromatin İmmunopresipitasyon için Çapraz Bağlı İskelet Kasında Yüksek Kaliteli Nükleerlerin Hazırlanması İçin Filtrasyona Dayalı Bir Yöntem

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Kitle Fotometrisi ile Antikor-Antijen Affinitesinin Hızlı Tayini

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membran Proteinlerini Hedefleyen Fonksiyonel Analiz ve Antikor Gelişimi için Proteolipozomların Hücresiz Üretimi

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Küçük Molekül Bileşiklerinin Hızlı ve Nicel Tespiti için Yanal Akış İmmünokromatografik Şeridinin Geliştirilmesi

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...