Name: high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00
Duration: 11 min 22 s
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这项工作得到了奥地利科学基金(FWF赠款P23797、P27275和P30596)和瑞士国家科学基金会(格兰特#PBBEP2_146174)的支持。

1. 微阵列设计
<ol><li>在文本编辑器中编写要合成的序列,每个序列 5'*3',一行。对于质量控制 25mer,请使用序列"GTCATCATCATACCCTCT"。对DNA核苷酸使用A、C、G和T字母,对RNA核苷酸使用5、6、7和8个编号。</li>
	<li>在库准备的情况下,在每个序列的 3' 末尾添加一个额外的数字(即 9)。这将对应于基敏单体耦合。</li>
	<li>每个序列后面必须跟一个逗号。在逗号之后为每个序列指定一个名称,并验证每个通道是否遵循 [序列,#sequence_name]格式(不带括号)。将序列列表另存为 .txt 文件。</li>
	<li>启动 MatLab 然后加载程序芯片设计.m.运行程序。</li>
	<li>在"属性面板"窗口中,加载微阵列整个Chip布局文件。如果目标是在四个相同的位置合成整个数组,则加载MilliChip布局文件。</li>
	<li>在"属性面板"窗口中,在"芯片规格"下,选择"选择容器然后合成区域"。在"模式"下,选择产生正确数量的可寻址特征的模式,计算序列数 = 复制数。对于质量控制 25mer,选择 25:36 模式。</li>
	<li>在"选择容器"下,选择"基准"。基准特征通常在合成区域的角落合成,用于提取杂交数据。选择基准时,编写一个序列(5'+3'),该序列将在基准特征上合成,并可作为正控制。对于25mer实验,使用相同的DNA序列。</li>
	<li>在"序列"下加载包含所有已写入序列的文本文件。确保选择了"随机化"。在项目标题中为实验提供标题,并在链接序列中写入TTTTT(对应于 T5链接器)。</li>
	<li>按"生成",然后查找MaskGen_delta_rc1/设计文件夹下的数组设计文件和掩码(图2)。 确保它包含显示脚本、流序列和设计文件。</li>
	<li>有关库准备,打开显示脚本。在显示脚本底部添加一行,以精确复制脚本的第一行(例如,显示 First_Mask.bmp 150)。这将删除所有寡核苷酸的5'端的终端光保护组。</li>
	<li>启动作业创建者AutoJob程序,通过单击"加载模板"加载模板加载模板,然后单击"显示脚本"以加载由 MatLab 生成的显示脚本文件。 按"生成"。此步骤将创建一系列指令,称为作业文件,将控制计算机与微镜和 DNA 合成器的通信。</li>
</ol>2. 幻灯片准备和功能化
<ol><li>在与合成单元上入口和出口管位置相对应的两个位置钻一个滑块。在 CNC 路由器上使用 0.9 mm 金刚石钻头进行精确、可靠的钻孔。用超纯水冲洗钻孔的幻灯片,并将其放在滑架中。</li>
	<li>在含有5%的氨基特殊用途清洁剂的水浴中,在35°C下,将滑梯进行超声波处理,以清洁表面30分钟。用双蒸馏 H2O 冲洗幻灯片,并将其转移到干净干燥的机架中。</li>
	<li>在滑动机架中排列钻孔和未钻孔的显微镜幻灯片。在大的分级气缸中,通过将 475 mL 乙醇 (EtOH) 与 25 mL ddH2O、10 g 的硅化试剂(N-(3-三乙酰丙基)-4-羟基丁酰胺)和 1 mL 醋酸混合制备功能化溶液。搅拌良好,直到均匀,然后在一个合适的封闭容器中转移。</li>
	<li>将装载的机架放入容器中,合上盖子,让容器在室温下轻轻摇动轨道摇床 4 小时。</li>
	<li>4小时后,丢弃功能化溶液,用500 mL的洗涤溶液替换,包括475 mL的EtOH、25 mL的ddH2O和1 mL的醋酸。在室温下缓慢搅拌20分钟,然后丢弃并更换500 mL的新鲜洗涤液。</li>
	<li>在室温下再加20分钟后,丢弃溶液,用一串龙流干燥滑片,并在120°C的预热真空烤箱中固化。2 小时后,关闭烤箱和真空泵,但将滑轨放在减压下过夜。然后,将烤箱带回大气压力,并将滑片存放在干燥器中,直到进一步使用。</li>
</ol>3. 合成试剂和反应物的制备
<ol><li>将磷酰胺粉末(图1)从储存温度(-25或-45°C)带入干燥器室温。</li>
	<li>当磷酰胺达到室温时,用一体积超干醋酸酯(<30 ppm H2O)溶解粉末,以达到标准DNA和RNA磷酰胺的30 mM浓度,基敏dT单体(50 mM)库准备)。加入一个小的分子筛袋,以捕捉任何湿度的痕迹。</li>
	<li>在 DMSO 中制备 1% (w/w) 的 imidazole 溶液,将 11 克的 imidazole 溶解到 1 L 的干 DMSO 中。摇匀,直到完全溶解。将溶液连接到DNA合成器的辅助端口。这将是完全去除5°光保护组所需的暴露溶剂。</li>
	<li>对于库的合成,通过在10 mL的二氯甲烷中溶解100mgβ-胡萝卜素,制备二氯甲烷中1%(w/v)β-胡萝卜素的溶液。在琥珀色玻璃瓶中摇匀,然后用铝箔包裹。</li>
</ol>4. 编制和监测微阵列合成。
<ol><li>在微阵列制造室记录温度和湿度,并确保DNA合成器在足够的氦压下。</li>
	<li>打开 UV-LED 及其冷却风扇。将紫外线强度计连接到进入紫外线的焦平面,然后将其打开(图 3A)。</li>
	<li>在计算机上,启动作业文件/微镜/合成文件控制器软件(名为WiCell)。打开然后初始化微镜设备,并通过右键单击DMD加载全白掩码文件,然后选择加载图像。</li>
	<li>右键单击 UVS 图标并选择UV 快门打开。读取强度计的功率值(以 mW/cm2)并计数 60 s。60 s 后,再次读取功率值,并记下开始和结束值。通过选择 UV快门关闭快门并关闭强度计。计算平均紫外线强度值(以 mW/cm2 )。</li>
	<li>计算5'-NPPOC光解保护(DNA和RNA微阵列)的辐射能达到6J/cm2和3 J/cm2为5'-BzNPPOC光解保护(DNA库)所需的暴露时间,只需遵循关系<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936eq1.jpg">即可。</li>
	<li>在DNA合成器工作站软件中,通过复制和粘贴 MatLab 生成的流序列的内容,在序列编辑器中创建序列文件。在 3' 端(默认循环字母:"s")上添加额外的两个洗涤步骤,以在移动到第一个耦合之前清洗基板表面。保存并导出序列文件。</li>
	<li>在工作站软件的协议编辑器中,创建一个包含以序列文件中每个字母和数字命名的专用周期的协议(例如,如果序列文件仅包含字母 A、C、G 和 T,则协议文件必须包含四个周期,名为 A、C、G 和 T)。</li>
	<li>将DNA磷酰胺(周期A、C、G和T)的耦合时间设置为15s,将rU磷酰胺(周期8)设置为120s,将rA、rC和rG磷酰胺(周期5、6和7)设置为300s。对于库准备,将基敏、可夹合的 dT 单体耦合设置为 2 × 120 s(表 1和表 2)。</li>
	<li>确保每个周期中的两个事件 2 Out通信事件之间的等待时间与计算出的紫外线照射时间相对应,以达到必要的辐射能量。对于序列文件,保存并导出协议文件。</li>
	<li>在 WiCell 软件中,将作业、序列和协议文件加载到其各自的子窗口中,然后单击"发送"将序列和协议文件发送到 DNA 合成器。</li>
	<li>在序列文件中,计算每个磷酰胺的耦合数。</li>
	<li>要测量执行每次合成所需的磷酰胺溶液的所需体积(μL),请将耦合数乘以60。在每个体积中加入 250 μL,以确保 DNA 合成器上生产线的安全性和启动性。对于只需要单个耦合的磷酰胺石,使用 250 μL 的基本体积。</li>
	<li>快速将溶液传输到DNA合成器上的小瓶中,该小瓶与协议周期中的端口字母/编号相对应。</li>
	<li>用磷酰胺溶液为端口加注,每个脉冲有10个主脉冲,以便用试剂填充生产线。在连接反应细胞之前,给醋酸酯洗涤线充血。</li>
	<li>要组装合成电池,请先在电池的石英块上放置一个厚(250 μm)全氟弹性体 (FFKM) 垫片。将钻孔的、功能化的显微镜幻灯片放在第一个垫片的顶部,并验证滑片上的孔与合成单元的进气口和出口管连接。</li>
	<li>将第二个薄 (50 μm) 聚四氟乙烯 (PTFE) 垫片放在钻孔滑道上,环绕两个孔。最后,在第二个垫片上放置第二张功能化但未钻孔的幻灯片(图3B)。将 4 螺钉金属框架放在组装的双基质单元顶部,并使用扭矩螺丝刀将螺钉拧紧至相同的夹紧力 (0.45 Nm)。</li>
	<li>将入口和出口管连接到 DNA 合成器。为乙酰乙酰化洗涤管进行充注,并验证乙酰乙酰乙酯 (ACN) 是否通过基板正常流动。如果在此阶段观察到 ACN 的任何泄漏,则拆卸并重新组装电池。经过 7 个 ACN 注油周期后,测量废物管线的 ACN 体积。此卷应为 2 mL。</li>
	<li>将合成单元连接到进入紫外线的焦点面。在库准备的情况下,在电池背面附加一个额外的入口和出口线,用β-胡萝卜素溶液填充后室(2 mL溶液就足够了)。确保没有泄漏 (图 3C) 。</li>
	<li>首先单击"在 WiCell软件中运行"开始合成。在作业文件中的第一个 WAIT 命令中,按 DNA 合成器上的"开始"。</li>
	<li>在合成过程中,定期验证蒙版文件的显示与紫外线照射和快门的打开一致。</li>
	<li>合成常规微阵列后,断开细胞与合成器的连接,拆解细胞并使用金刚石笔将合成数蚀刻到玻璃玻片上。蚀刻每张幻灯片的非合成面上的数字。将滑片转移到 50 mL 离心管中,并存放在干燥区域,直到进一步使用。</li>
	<li>在合成库微阵列后,首先将β-胡萝卜素溶液排出腔室,然后通过流动2~5 mL的CH2 Cl2将其洗涤,然后排出。按照步骤 4.21 进行拆卸。合成的数组可能是肉眼可见的 (图4)。</li>
</ol>5. DNA微阵列解保护
<ol><li>用20 mL的EtOH和20 mL的乙烯胺(EDA)填充染色玻璃罐。将仅脱氧核糖核酸的微阵列垂直放入罐中,合上盖子,然后让幻灯片在室温下脱保护2小时。 注意:EDA是一种剧毒、腐蚀性和易燃的液体。在通风良好的通风罩中使用手套。</li>
	<li>2 小时后,使用钳子取回幻灯片,并用双蒸馏 H2O 彻底冲洗。</li>
	<li>在微阵列离心机中干燥幻灯片几秒钟,然后存放在干燥器中。</li>
</ol>6. RNA微阵列脱保护
<ol><li>在50 mL离心管中,制备2:3三乙胺/ACN(分别为20 mL和30 mL)的干溶液。将一个RNA微阵列滑入离心管,合上盖子,然后用塑料密封膜包裹。在室温下,轻轻摇动轨道摇床上的离心管 1 小时和 30 分钟。</li>
	<li>1小时30分钟后,取出幻灯片,用2×20 mL干ACN清洗,然后在微阵列离心机中干燥几秒钟。 注意:三乙胺是一种剧毒、腐蚀性和易燃的液体。醋酸酯是有毒和易燃的。在通风良好的通风罩中使用手套。 注:第一个取消保护步骤完成。</li>
	<li>在3:2丙氨酸/醋酸中制备0.5M氢化物水合物溶液。首先,在分级气缸中混合20 mL的醋酸和30 mL的丙氨酸。等待溶液冷却后再加入1.21 mL的氢化物水合物。将产生的溶液的约 40 mL 转移到 50 mL 的离心管中。 注意:水合物是一种剧毒和腐蚀性液体。苯丙胺是高度易燃和剧毒的。醋酸是易燃和腐蚀性的。在通风良好的通风罩中使用手套。</li>
	<li>第一次脱保护步骤后,将RNA滑移到水合物溶液中,合上盖子,用塑料密封膜包裹。在室温下,轻轻摇动轨道摇床2小时。2小时后,取出幻灯片,用2×20 mL的干ACN清洗,然后在微阵列离心机中干燥几秒钟。 注:第二个取消保护步骤完成。</li>
	<li>如果RNA微阵列也含有DNA核苷酸,则继续进行第三个去保护步骤。在 50 mL 离心管中,将 20 mL 的 EDA 与 20 mL 的 EtOH 混合。将DNA/RNA微阵列加入1:1 EDA/EtOH溶液,在室温下保持5分钟。</li>
	<li>5分钟后,取出滑轨,用2×20 mL的无菌水清洗,然后在微阵列离心机中干燥,并存放在干燥器中。</li>
</ol>7. 荧光标记互补链的杂交
<ol><li>解冻乙酰化牛血清白蛋白(10mg/mL)和Cy3标记的互补链(100 nM),并加热至室温。</li>
	<li>在1.5 mL无菌微离心管中, 将 150 μL 的 2x MES 缓冲液(200 mM 2-(N -异丙醇) 乙酸酸; 1.8 M NaCl; 40 mM EDTA; 0.02% Tween-20) 与 26.7 μL 的 Cy3 标记 DNA, 13.4 μL 的乙酰化 BSA 和 110 μL 无菌 H2O 混合和.涡。如果两个幻灯片都用于混合,则将卷翻倍。</li>
	<li>将混合炉预热至双工Tm以下的温度,但足够高,以确保完全匹配序列和非匹配序列之间的良好区分。对于质量控制 25mer,将温度设置为 42°C(Tm为 59°C)。</li>
	<li>在上述混合溶液中,小心地将自粘300μL杂交室放在每张幻灯片上的合成区域和移液上。用粘合点盖住造型室的孔,用铝箔包裹整个幻灯片。</li>
	<li>将微阵列幻灯片放入杂交炉中,盖上盖子,让它在选定的杂交温度下轻轻旋转 2 小时。</li>
	<li>2 小时后,拆下滑轨,拆下铝箔并小心地撕下混合室。将滑片转移到含有30mL非严格洗涤缓冲液(NSWB;0.9M NaCl,0.06 M磷酸盐,6mM EDTA,0.01%Tween20,pH 7.4)的离心管中,并在室温下剧烈摇动2分钟。</li>
	<li>将滑片转移到含有 30 mL 严格洗涤缓冲液(SWB;100 mM MES、0.1 M NaCl、0.01% Tween20)的离心管中,并剧烈摇动 1 分钟。</li>
	<li>最后,将滑片转移到含有30mL最终洗涤缓冲液(FWB;0.1x盐酸钠)的离心管中,摇几秒钟。在微阵列离心机中干燥幻灯片。</li>
	<li>将干燥的微阵列、合成区域朝下放置在微阵列扫描仪的滑动支架中。对于 Cy3 标签双工,以 5 μm 分辨率扫描,具有 532 nm 激发波长、575 nm 滤波器和 350 倍光倍增器。将高分辨率扫描另存为 .tif 图像文件 (图 5A)。</li>
</ol>8. 数据提取和分析
<ol><li>在提取数据之前,在图像编辑器中旋转保存的阵列扫描,以便将最长的基准要素链定位在扫描的左上角。保存旋转的图像。</li>
	<li>启动NimbleScan,然后按文件|打开并加载阵列扫描。然后,通过单击"设计文件"小节中的"浏览",加载 。在微阵列实验设计过程中自动生成的ndf设计文件。然后单击"打开"。</li>
	<li>在视图中,单击"自动对比度/亮度"。单击扫描上方手动对齐的图标。在扫描的四个角放置四个方形标记,然后再次单击现在的绿色图标。通过单击"分析",报告然后探测报告来提取杂交数据。</li>
	<li>打开 .在电子表格编辑器中探测报表文件。保留列 B 和 I,在继续计算从提取的数据中计算平均值和标准偏差之前丢弃其余列(图 5B)。</li>
</ol>9. 图书馆去保护、裂解和恢复
<ol><li>要消除保护和切下DNA库,在50 mL离心管中制备1:1干EDA/苯基苯溶液。将滑移浸入裂解溶液中,关闭滑块,用塑料密封膜包裹,然后在室温下在轨道摇床中轻轻旋转 2 小时。</li>
	<li>2 小时后,取下滑轨,用 2 × 20 mL 的严格干燥 ACN 清洗。拆下滑轨,使其风干。</li>
	<li>使用移液器,在现在可识别的合成区域上涂抹 100 μL 无菌 H2O。将溶液上下移动几次,然后再将其转移到1.5 mL微离心管中。重复此过程,并将微阵列 eluate 结合到同一管中 (图 6)。</li>
	<li>将2×100 μL的芯片洗至干燥,然后重新溶解成10μL的无核酸酶H2O。测量UV-Vis分光光度计的吸光度。</li>
	<li>在配备 C18 树脂的 10 μL 移液器尖端上脱盐 DNA 库。首先,将芯片改液化为0.1M醋酸三乙酸三乙酸(TEAA)缓冲溶液。</li>
	<li>通过 H2O/ACN 1:1 的 3 x 10 μL 来润湿树脂,并通过使用 3 x 10 μL 的 0.1 M TEAA 缓冲液洗涤来平衡树脂。通过树脂上下移液10次,结合DNA。用 3 x 10 μL 的 0.1 M TEAA 缓冲液清洗树脂,使用 3 x 10 μL 的 H2O 清洗树脂。</li>
	<li>用 10 μL 的 H2O/ACN 1:1 清洗树脂,从尖端洗脱盐的 DNA。将脱盐溶液干燥并重新溶解成10μL无菌H2O.测量UV-Vis分光光度计的吸光度(图7)。将库蒸发至干燥状态,并储存在-20°C,直到进一步使用。</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetal+Levulinyl+Ester+(ALE)+Groups+for+2&#8242;-Hydroxyl+Protection+of+Ribonucleosides+in+the+Synthesis+of+Oligoribonucleotides+on+Glass+and+Microarrays.">Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2&#8242;-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).</li><li>Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+RNA+microarrays+synthesized+in+situ+by+photolithography.">High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).</li><li>Agbavwe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency,+Error+and+Yield+in+Light-Directed+Maskless+Synthesis+of+DNA+Microarrays.">Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays.</a> Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).</li><li>Sack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Express+photolithographic+DNA+microarray+synthesis+with+optimized+chemistry+and+high-efficiency+photolabile+groups.">Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).</li><li>Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+o-Nitrobenzyl+Photolabile+Groups+for+Light-Directed+Chemistry+and+Microarray+Synthesis.">Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).</li><li>Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Light-Directed+Synthesis+of+Mirror-Image+Microarrays+in+a+Photochemical+Reaction+Cell+with+Flare+Suppression.">Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression.</a> Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-cleavable+microarrays+for+the+characterization+of+DNA+and+RNA+oligonucleotides+synthesized+in+situ+by+photolithography.">Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography.</a> Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).</li><li>Krotz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+stability+and+degradation+pathway+of+deoxyribonucleoside+phosphoramidites+in+acetonitrile.">Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).</li><li>Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Degradation+of+Dg+Phosphoramidites+in+Solution.">The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).</li><li>McGall, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+light-directed+synthesis+of+DNA+arrays+on+glass+substrates.">The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).</li><li>Collett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+RNA+microarrays+for+high-throughput+screening+of+antiprotein+aptamers.">Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers.</a> Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).</li><li>Buenrostro, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Fabrication+of+High-Density+RNA+Arrays.">Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).</li><li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+multiplex+gene+synthesis+from+programmable+DNA+microchips.">Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips.</a> Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+affinity+landscape+of+Thrombin-binding+aptamers+on+2'F-ANA/DNA+chimeric+G-Quadruplex+microarrays.">Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).</li></ol>

作者证明他们与任何营利性组织没有任何关系。

固相DNA和RNA合成是每个核酸化学实验室的面包和黄油,尽管光刻学成分的添加被认为是一个复杂的操作,但由紫外光介导的微阵列制造也是一个非常可靠的过程.此外,它是微阵列上原位RNA合成的唯一可用方法。然而,正如在任何多阶段实验过程中一样,人为错误的空间也十分充足。
也许最关键的步骤是磷酰胺的耦合,因为它需要持续高产量的化学反应,才能承受很少合成误差的寡核苷酸。在我们的微阵列合成协议中,磷酰胺石耦合对于整体合成质量更为重要,因为制造过程绕过了封顶,防止了寡核苷酸纯化。对所有感光DNA和RNA磷酰胺石计算了超过99%的步进耦合效率,即使非常短的耦合时间(15 s)24,但偶尔也会出现较低的耦合率,特别是在dG酰胺石的情况下。在室温下溶解磷酰胺的稳定性已经研究过,并证明取决于核碱的性质,仅几天时间,就容易大量降解的葡素磷酰胺。 30.但是,当储存在-25°C时,dG磷酰胺在ACN中溶解,因为30 mM溶液在几周内保持稳定。然而,在室温下,dG磷酰胺溶液的相对不稳定性意味着它们不应在DNA合成器上连接数天。
对于RNA磷酰胺,耦合产量非常依赖于磷酰胺石的质量(可以通过31P NMR光谱法评估)和耦合时间。rA、rG、rC 和 2 分钟为 rU 的耦合时间为 5 分钟。事实上,我们发现,将所有RNA磷酰胺的冷凝时间缩短到2分钟,可显著降低杂交信号。
DNA合成器本身,以及试剂和溶剂,当然需要尽可能清洁,以实现寡核苷酸合成的最高产量。然而,不溶性物质、盐或颗粒会随着时间的推移在输送系统的管材和管中积累,导致试剂和反应物的消耗逐渐减少。如果对合成器进行一般清洁不能解决低输出体积,则增加脉冲数量可能是另一种解决方案。在低磷酰胺石消耗的情况下特别有用,耦合协议中对应于磷酰胺和活化剂混合物的泵送的线路(表1和表2中耦合子节的第三行)可以修改,从6到9脉冲,对合成质量没有任何明显的负面影响。此外,将甲胺石/活化剂混合物引入合成基板所需的活化器脉冲数(目前耦合子节中的 6,第四行,见表1和表2)取决于 DNA 合成器本身以及合成细胞中的管长度。在用彩色溶液替换磷酰胺石并计算将彩色混合物推到玻璃基板以进行耦合所需的脉冲数后,可以调整此数量。
本文所述方法允许DNA和RNA合成在同一微阵列上同时进行。DNA 和 RNA 的杂交也可以在不改变阵列制造协议的情况下制备,只要遵循三步消除保护协议。然而,应该指出,仅RNA微阵列只需要两步去保护:先用E3N进行去异化,然后是羟基和基底脱保护。DNA核碱在这些条件下被发现不完全解除保护,需要在EDA中加入额外的步骤,以便完全去除苯乙酰(Pac)组。这种EDA的额外治疗比DNA微阵列31的标准去保护短(5分钟),但它足以推动它完成三乙胺和氢化物治疗后。此外,EDA反应时间短,可限制完全脱光的RNA寡核苷酸在基本条件下的暴露。
与替代方法(如斑点或 DNA 转录 32、33、34)不同,原位RNA阵列合成的优点是能够将合成的RNA微芯片以受保护的形式存储,直到使用,从而避免了潜在的RNA降解风险。另一方面,RNA的合成后程序确实意味着消耗品和试剂保持无菌状态,并且处理是在无RNA酶条件下进行的。值得注意的是,我们发现在杂交混合物中添加RNase抑制剂并没有为RNA特征产生更强的杂交信号。
在基敏单体上合成DNA库比合成表面上的一些控制序列更为复杂,因此当然更容易出现设计错误。但是,假设序列设计(即序列的性质和数量)是正确的,则将此列表转换为曝光掩码集合和有序的一系列耦合周期仍然是一个简单明了的过程。然而,标准微阵列合成存在重要差异,对于高密度库阵列的成功制造至关重要。
首先,基敏dT单体在合成链接器后作为第一磷酰胺石耦合。发现该单体(图1)的耦合收率相对较低,约为85%28,这就是为什么努力提高其加入率的原因,要么将其在ACN中的浓度从30mM提高到50 mM,或者通过重复耦合步骤:使用新鲜单体进行两次连续耦合反应,或两个独立但连续的耦合循环。
第二个变化是在合成细胞的后室中加入β-胡萝卜素溶液,方便地吸收365nm光。这是光刻设置的重要修改,因为它可以防止紫外线反射回阵列基板。事实上,在穿过基板之间的间隙介质后,进入的紫外线会穿过钻孔的滑道,到达电池的石英块。菲涅尔方程预测,4%的垂直相射紫外线将从三个下游空气玻璃接口(第二基板的出口侧和石英块的两侧)反射到合成基板上,导致意外曝光有光保护的寡核苷酸。衍射和散射也有助于"偏离目标"的光解保护,因此,对核苷酸的插入,直接影响合成的误差率,但这些贡献比反射小得多,主要可以通过降低合成密度(在特征之间留下间隙)。我们发现,在细胞下腔的β-胡萝卜素溶液水平仅在阵列合成的最初几分钟内才会略有下降,因此需要进行监测和重新调整。
最后,第三个变化是去保护解决方案,取代EtOH的肌胶烯,保持切块DNA库绑定到表面,大概是通过静电相互作用。在ACN洗涤后,将少量水涂到合成区,方便地收集库。然而,只有当EDA和苯基中的含水量极小时,这个过程才会成功,使核酸完全不溶于解保护鸡尾酒。或者,DNA库可以使用氨9、10、14、35从芯片上切开,然后通过隔夜将含DNA的氨溶液加热到55°C,进一步取消保护。然而,使用氨回收DNA库与RNA不相容。基底上的RNA寡核苷酸可以使用上述相同的EDA/苯基体程序从表面洗脱,但只能在E3N和hydrazine两步消除保护策略28之后的倒数第二阶段。
从微阵列中回收寡核苷酸池的替代策略,无需特定的基本处理,原则上与光刻学相容,并依赖于酶的使用。例如,单个脱氧核苷酸是尿素-DNA糖基酶(UDG)的目标,并从DNA序列的其余部分切除,或者单个RNA单位可以通过RNase H型2型酶和磷脂粘结5'到RNA分离,释放5'DNA部分23。
我们现在拥有一种强大、可靠和高密度的合成DNA、RNA和混合DNA/RNA微阵列的方法。它们不仅可用作杂交或结合测定36的平台,而且代表了一种快速而廉价的方式来生成复杂的核酸库。对于基于 DNA 的数字数据存储,微阵列光刻学可能成为解决"写入"瓶颈(即通过合成对信息进行编码)的潜在解决方案。DNA和de novo基因组装数字编码的成功取决于序列保真度,在合成水平上,序列保真度转化为误差率。我们当前阵列制造协议中的合成和光学误差将在其他地方进行讨论和报告。与此同时,目前正在努力进一步提高制造规模和产量。

DNA微阵列的实用应用历来是研究两个细胞群之间基因表达水平的变化,使用互补链和荧光作为检测方法1。有时,DNA微阵列冒险进入结合事件与非核酸配体,如蛋白质,与系统序列排列的策略,提供结合景观2,3的全面概述 4,5.这种方法有效地将微阵列从单纯的杂交表面转变为具有广泛序列覆盖的平台,这将是研究更丰富、更复杂的RNA结构和功能世界的资产。在极高效的磷酰胺耦合反应6的支持下,原位合成DNA阵列现在也可以被视为DNA 7的廉价来源,考虑到对DNA7日益增长的需求,这种DNA阵列正变得尤为重要。核酸材料用于基因组装8、9、基于DNA的纳米结构10、信息存储或测序11、12。同样,测序技术可能受益于产生RNA寡核苷酸13非常复杂混合物的方法的开发。在此背景下,允许原位和高密度合成寡核苷酸的阵列制造协议是理想的,以满足迅速扩大的核酸生物技术领域的需要。然而,在生物技术等不同领域,每种应用的目的都可能需要在高通量或合成误差极低的14、15或两者同时产生微阵列上的DNA,这需要仔细观察DNA微阵列的合成方案,从历史上看,这些方案主要针对杂交测定进行了优化。同时,RNA微阵列的原位合成被发现是一项具有挑战性的工作,与2'-OH功能的保护组相关的大多数困难,通常是标准固相合成中的硅基,与氟基试剂,与玻璃或硅表面不相容的化学品。这些问题和挑战在DNA和RNA微阵列合成最近一直是大量工作的主题,特别是光刻学方法16。
光刻学使用紫外光在耦合前疏通寡核苷酸,并要求蒙版构建紫外线照射模式,从而在空间上组织和控制寡核苷酸的生长。物理面罩已被计算机控制的微镜所取代,微镜的倾斜选择性地将紫外线反射到微阵列基板17、18、19上。作为紫外线源,我们使用来自高功率LED光源20的365nm光。目前的光刻设置配备了微镜阵列,包含 1024 × 768 反射镜,对应于 780,000 多个可单独寻址点("功能"),面积仅为 1.4 cm 2,或1080p,阵列为 1920 × 1080,或>200 万面镜。因此,器件中的每个镜像都直接控制了相应功能上生长的序列。除紫外光外,光刻成像功能类似于固相合成技术,采用循环磷酰胺化学。只有它需要完全不同的保护策略,RNA合成才能成功。我们开发了一系列新的光敏RNA磷酰胺,其携带氢化物保护组21。这些单体允许在不影响表面完整性的温和条件下对RNA进行脱光保护。第一个去保护步骤使用三乙胺去除氰化物磷化物保护组,而氢化物用于第二,单独的步骤,以去除那些在2'-OH和外生胺功能。这样,RNA寡核苷酸长度为30-nt,任何序列现在可以在微阵列22、23上原位合成。与此同时,我们最近也开始着手解决DNA和RNA光刻学的吞吐量、质量和速度问题。我们测量了所有DNA和RNA中环石的耦合效率>99%(图1),并调查了寡核苷酸伸长周期中的每一个步骤,从氧化时间到活化剂的选择和最佳紫外线照射24,25.我们引进了新的感光5'保护组,只需几秒钟即可去除,将数十万个100个生物的合成转化为几个小时的过程26。我们还通过同时暴露两个基板27,使阵列制造的产量增加了一倍。最后,我们介绍了一种含有基敏的苏基基基基基基基基基基基基基基的聚酰亚胺石,作为切块、收集和分析DNA和RNA寡核苷酸的便捷方法,这是库制备28的核心。
尽管DNA和RNA固相合成相对平凡,特别是对于核酸化学家来说,微阵列光刻学仍然是一个非同寻常的升级,需要复杂的设置、仔细的控制和监督过程,以及根据寡核苷酸的性质和应用类型,分别说明合成后处理。在本文中,我们希望详细介绍通过光刻法(从实验设计到数据分析)DNA和RNA微阵列原位合成的整个分步过程,重点是仪器和消耗品。然后,我们描述了符合微阵列制造预期目的(即杂交或核酸库恢复)的合成后脱保护方法。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:792px;" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Slide functionalization</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetic acid &#62;99.8%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">33209</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">CNC router</td>
			<td style="width:175px;">Stepcraft</td>
			<td style="width:119px;">300 CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">1.07017.2511</td>
			<td>For deprotection and functionalization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide</td>
			<td style="width:175px;">Gelest</td>
			<td style="width:119px;">SIT8189.5</td>
			<td>Silanizing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Nexterion Glass D microscope slides</td>
			<td style="width:175px;">Schott</td>
			<td style="width:119px;">1095568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Polymax 1040</td>
			<td style="width:175px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Proclean 507 Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:175px;">Ulsonix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z860086</td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Microarray synthesis</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.25 M dicyanoimidazole in ACN</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004712402BS</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.7 XGA DMD</td>
			<td style="width:175px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital Micromirror Device</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:332px;">20 mM I2 in pyridine/H2O/THF</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L860020-06</td>
			<td>Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">250 &#956;m thick Chemraz 584 perfluoroelastomer</td>
			<td style="width:175px;">FFKM</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Lower teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2&#39;-O-ALE RNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">365 nm high-power UV-LED</td>
			<td style="width:175px;">Nichia</td>
			<td style="width:119px;">NVSU333A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;BzNPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">Orgentis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;NPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">FlexGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0001205402BS</td>
			<td>For DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amidite Diluent for DNA synthesis</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L010010</td>
			<td>For dissolving phosphoramidites</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Cleavable dT</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Base-sensitive monomer for library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DMSO</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004474701BS</td>
			<td>As exposure solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DNA and RNA microarray deprotection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethylenediamine &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3550</td>
			<td>For deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Expedite 8909</td>
			<td style="width:175px;">PerSeptive Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA synthesizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">225819</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Imidazole</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Industrial Strength lower-density PTFE tape</td>
			<td style="width:175px;">Gasoila</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thin, upper teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Pyridine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P57506</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Triethylamine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0886</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#946;-carotene</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9750</td>
			<td>For library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization and scanning</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">20x Sodium Saline Citrate</td>
			<td style="width:175px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">1054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;Cy3-labelled complementary strand</td>
			<td style="width:175px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For duplex hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">R3961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">EDTA molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">GenePix 4100A</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:175px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:119px;">230500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES monohydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">69889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES sodium</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NaCl &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SecureSeal SA200 hybridization chamber</td>
			<td style="width:175px;">Grace BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">623503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Spectrafuge mini</td>
			<td style="width:175px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">C1301</td>
			<td>Microarray centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tween-20 molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Data extraction</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Excel</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For data extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MatLab</td>
			<td style="width:175px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NimbleScan 2.1</td>
			<td style="width:175px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Desalting and quantification</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Toluene</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">ZipTip C18</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ZTC18s008</td>
			<td>Desalting pipet tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries

光刻学是合成玻璃玻片上DNA寡核苷酸的有力技术,因为它结合了磷酰胺石耦合反应的效率与微米大小的反射镜反射的紫外线的精度和密度。光刻成像产生微阵列,可以容纳从几十万到数百万个不同的DNA序列,100nt或更长,只需几个小时。有了这个非常大的序列空间,微阵列是探索核酸-配体相互作用机制的理想平台,在RNA的情况下特别相关。我们最近报告了一组与原位光刻相容的RNA磷酰胺石的制备,随后用于生长RNA寡核苷酸、同质聚合物以及混合基序。在这里,我们详细介绍了RNA微阵列制造的过程,从实验设计到仪器设置、阵列合成、解保护以及最终杂交测定,使用模板25mer序列,包含所有四个碱基。同时,我们超越了基于杂交的实验,利用微阵列光刻作为进入复杂核酸库的廉价网关。为此,高密度DNA微阵列被制造在基体敏感的单体上,使DNA在合成和脱保护后能够方便地被提取和检索。对制造方案进行了优化,以限制合成误差的数量,并为此引入了一层β-胡萝卜素溶液来吸收紫外线光子,否则这些光子可能会反射回合成基板。我们逐步描述了图书馆准备的完整过程,从设计到裂解和量化。

DNA和RNA微阵列杂交 图5显示了在含有25mer序列的DNA和RNA版本的微阵列上进行的杂交测定的结果(5'-GTCATCATCATACACCTCTC-3'的DNA形式)。图 5 A中的扫描以与 Cy3 荧光的激发/发射光谱相对应的绿色刻度格式显示,荧光强度以任意单位记录在 0 和 65536 之间。阵列设计遵循协议部分中描述的 25:36 功能布局。扫描在数组的正确方向后显示,左上角填充了最长的基准要素链。在这里,基准特征包含25mer的DNA版本,原则上应始终发出正荧光信号,以便执行扫描对齐和数据提取。杂交微阵列应均匀明亮,但合成区域的边缘通常比中心亮(亮度高达 50%)。大量序列复制(随机分布于整个区域)减少了空间人工制品的影响。在这里,每个序列(DNA和RNA)在2000个随机位置被合成。在杂交测定中,通常有低荧光噪声(背景),<50 a.u.,这导致信号/噪声比在杂交测定中为200:1至800:1。数据提取后,对荧光强度进行求平均值并绘制[SD]。
实验之间的绝对荧光值有显著的变异性。在这里,我们展示使用相同制造参数和相同的合成后处理的三个独立合成的结果。25mer DNA,当杂交到其互补的Cy3标记的DNA链,将产生荧光信号范围从20,000到30,000,很少高于或低于。25mer RNA,当杂交到相同的Cy3标记的DNA补充,将给予荧光强度的相应功能范围从15,000到20,000。然而,RNA/DNA复式中的荧光强度偶尔会下降到8,000以下,当相应的DNA/DNA复式在20,000-30,000范围内仍然荧光。在这种情况下,RNA的结果可被视为次优。在扫描过程中,DNA或RNA的合成或杂交失败会立即从明显缺乏荧光中显现出来。RNA合成有多种失败或部分成功的机会,将在讨论部分中概述。
图书馆去保护、裂解和恢复 根据库的复杂性和密度,合成阵列的形状和轮廓可以在没有放大倍率的情况下看到,但在适当的光照下(图4),DNA仍然处于受保护的形式。使用 EDA/苯乙烯取消保护后,在添加水以收集切块库之前,包含现已取消保护的寡核苷酸的合成区域可能会作为亲水区出现,此时玻璃幻灯片的其余部分会出现覆盖着浑浊的疏水层。对合成面积的直接观测取决于用于合成寡核苷酸的总面积:更多地使用合成区将对应于表面上明显区分亲水区和疏水区的可能性。相反,使用较少的镜像和较小的要素合成的库可能无法立即观察到。
同样,脱盐后恢复的DNA数量与合成总面积成正比。如果所有特征都用于寡核苷酸合成,裂解和恢复过程应产生25至30pmol的DNA。因此,10%的合成区域将只提供约3pmol的DNA。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg"> 图 1.微阵列光刻学在寡核苷酸合成中使用的DNA和RNA磷酰胺的化学结构。5'-OH 的标准硝基丙氧基(NPPOC)感光保护组用于常规DNA和RNA微阵列合成,用于杂交目的。对于复杂DNA库的合成,在5'-OH中,更多的光基苯基-NPPOC(BzNPPOC)更受欢迎,因为BzNPPOC的去除速度是NPPOC的两倍,这大大减少了总微阵列合成时间。用于库的DNA寡核苷酸还需要在3'端耦合可夹合的dT单体。这种具有单体功能的单体在解保护期间将被切开,允许从微芯片中采集DNA。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg"> 图 2.蒙版作为在紫外线照射期间发送到微镜设备的图像文件的示例。白色像素对应于镜子,这些反射镜将在"ON"位置倾斜,将紫外线反射到合成单元上。黑色像素对应于"OFF"反射镜,其中紫外线将反射远离细胞。因此,白色像素将允许在玻璃基板上相应特征处找到的寡核苷酸上耦合下一个进料磷酰胺。然而,在此掩码文件中,在相应的镜像上合成的寡核苷酸在下次耦合事件中将保持惰性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg"> 图 3.微阵列光刻光学和合成设置的照片。(A) 用于紫外线照射的光学电路。紫外线 LED 的紫外线首先通过矩形横截面光管进行均质化,然后反射到微镜上。被倾斜到"OFF"位置的微镜会反射远离合成单元的紫外线,但处于"ON"位置的微镜会首先通过1:1的离合继电器将光线反射到位于焦点平面的合成细胞上。成像系统。(B) 合成单元一经组装,由先放置在电池石英块上的钻孔滑块组成,由厚厚的PTFE垫片隔开(未显示)。然后,第二张非钻孔滑块位于钻孔的滑轨上,由细的 PTFE 垫片隔开。金属框架(未显示)将组件固定在一起。(C. 对于库准备,一旦合成细胞附着在进入紫外线的焦平面上,位于石英块和钻孔滑块之间的腔室在 CH2Cl2中填充 1% 的 β-胡萝卜素溶液。为此,在石英块上附加了一个额外的入口和出口管,橙色溶液从最右侧流向最左侧位置。合成试剂和溶剂的流动以白色箭头显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg"> 图 4.合成区域通常是肉眼可见的。在这里,DNA库在合成后立即在玻璃表面看到,DNA仍然处于受保护的状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg"> 图 5.对在微阵列上原位合成的25mer DNA和RNA序列进行杂交测定。 (A) 整个杂交DNA和RNA微阵列的荧光扫描.25mer DNA和RNA寡核苷酸被杂交到其Cy3标记的互补链。以532nm激发波长,分辨率为5μm的激光扫描阵列。(B) DNA:DNA和RNA:DNA的荧光强度(任意单位)在三个单独的实验中。与相应DNA序列的荧光强度相比,原位合成RNA寡核苷酸的浅绿色数据可被视为不理想。错误栏是SD。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg"> 图 6.在微阵列上合成的DNA库的脱保护、裂解和恢复程序的原理表示。DNA序列生长在基敏可夹紧 dT 核苷上(显示在缩放区域中)。合成后,在EDA/苯乙烯中脱脱DNA寡核苷酸(碱保护组表示为红球)的脱保护使被消除保护的物质静电结合到表面,然后通过应用少量水到合成区域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg"> 图 7.具有代表性的吸光光谱(220 - 350 nm)的分片脱盐DNA库,包含4,000个不同的序列,长度为100nt。从单个阵列合成中共分离出 940 纳克的 DNA,相当于 DNA 总含量的 30 pmol,即每个玻璃基质 15 pmol。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg"> 表 1.假定相应的磷酰胺石已加载在端口"A"上,用于 5'-BzNPPOC-dA 耦合/氧化/光消除保护的代表性循环协议。耦合时间(以秒为单位)显示在"耦合单体"线路上。UV光解保护时间,这里对应于3J/cm 2(BzNPPOC光化学)的辐射能,计算为两个"事件2出"通信信号之间的时间。
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg"> 表2.假定相应的RNA磷酰胺在端口"A"上装载,用于5'-NPPOC-rA耦合/氧化/光消除保护的代表性循环协议。耦合时间(以秒为单位)显示在"耦合单体"线路上。UV光解保护时间,这里对应于6 J/cm 2(NPPOC光化学)的辐射能,计算为两个"事件2出"通信信号之间的时间。

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High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

高密度DNA和RNA微阵列.光刻合成、杂交和制备大型核酸库

本文提出并讨论了原位制造核酸微阵列的合成和应用的新进展。具体来说,我们展示了DNA合成的规程如何扩展到RNA,以及如何利用微阵列创建可检索的核酸库。

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

DNA和RNA微阵列对研究核酸和蛋白质之间的相互作用非常有用，但它们也是制备序列库的方便方法。光刻学允许数十万个独特的序列并行合成，是目前在微阵列上合成RNA的唯一直接方法。微阵列的原位光谱合成也可以扩展到化学改性寡核苷酸，例如具有两种肽核酸的原氟。查看微阵列制造和处理过程有助于了解这种复杂的机械是如何从众所周知的标准固相DNA合成中发展起来的。从文本协议中描述的微阵列设计和幻灯片功能化开始此过程。打开 DNA 合成器 UV LED 及其冷却风扇。在传入紫外光的聚焦点连接紫外线强度计并打开。在计算机上，启动 WiCell 控制器软件。打开并初始化微米设备。通过右键单击 DMD 然后选择加载图像来加载全白蒙版文件。右键单击 UVS 图标并选择 UV 快门打开。读取强度计上的功率值并计算 60 秒。60 秒后，再次读取电源值，并记下开始和结束值。通过选择 UV 快门关闭并关闭强度计关闭快门。计算平均紫外线强度值（以每厘米平方毫瓦为单位）。在 WiCell 软件中，在各自的子窗口中加载作业、序列和协议文件，然后单击"发送"以将序列和协议文件发送到 DNA 合成器。组装合成细胞，在细胞的石英块上放置一个厚厚的全氟弹性体垫片。然后在第一个垫片顶部放置钻孔、功能化显微镜幻灯片，并验证滑轨上的孔是否与合成单元的入口和出口管连接。将第二个薄聚四氟乙烯垫片放在钻孔滑轨上，围绕两个孔。最后，将第二个功能化但未钻出的幻灯片放在第二个垫片上。现在，在组装的双基板单元顶部放置一个 4 螺钉金属框架，使用扭矩螺丝刀将螺钉拧紧到相同的夹紧力。将进气管和出口管连接到DNA合成器。对乙酮洗涤线进行总理处理，并验证乙酮通过基材的正确流动。在经历了七个循环的乙酰三叶酸吸注后，测量废物线上的乙酮三叶的体积。此体积应为两毫升。将合成细胞连接到传入紫外光的焦平面上。在库准备的情况下，在细胞背面附加一个额外的入口和出口线，用贝塔胡萝卜素溶液的两毫升填充后室。首先单击 WiCell 软件中的"运行"开始合成。在作业文件中的第一个等待命令时，按开始执行 DNA 合成器。合成常规微阵列后，断开细胞与合成器的连接，然后拆解细胞。使用菱形笔将合成编号蚀刻在玻璃幻灯片上。蚀刻每张幻灯片的非合成面上的数字。将幻灯片转移到 50 毫升离心管中，并存放在干燥区域，直到进一步使用。合成库微阵列后，先将β胡萝卜素溶液排出腔室，然后通过将五毫升氯化甲基氯化物流过，然后洗涤室两次，然后排空。对于脱氧核糖核酸，用20毫升乙醇和20毫升EDA填充染色玻璃罐。将仅DNA微阵列垂直放在罐子中，合上盖子，在室温下让幻灯片脱保护两小时。两小时后，用钳子取回幻灯片，然后用双蒸馏水彻底冲洗。将幻灯片在微阵列离心机中干燥几秒钟，然后将它们存放在干燥器中。对于RNA微阵列脱保，在50毫升离心管中准备20毫升三乙胺和30毫升乙酮酸酯的干燥溶液。将一个RNA微阵列滑入离心管，合上盖子，用塑料密封膜包裹。在室温下轻轻摇动轨道摇床上的离心管1小时30分钟。接下来，取出幻灯片，用20毫升干乙酰三叶光洗洗涤两次，然后用微阵列离心机干燥几秒钟。在第一个去保护步骤后，将RNA滑入水合物溶液中，合上盖子，用塑料密封膜包裹。在轨道摇床上轻轻摇动两个小时后，取出滑梯，用20毫升干乙酰三叶光洗洗涤。然后在微阵列离心机中干燥几秒钟。如果RNA微阵列也含有DNA核苷酸，则继续执行第三个去保护步骤。将DNA/RNA微阵列加入含有一对一EDA乙醇溶液的50毫升管中，在室温下5分钟后，取出滑梯，用20毫升无菌水洗涤两次。将滑轨干燥在微阵列离心机中，并存放在干燥器中。在1.5毫升无菌微离心管中，准备含有Cy3标签DNA的杂交缓冲液，如文本协议中所述。混合和漩涡解决方案。小心地将自粘 300 微升杂交室放在混合溶液中每个滑轨和移液器的合成区域上。用粘合点盖住腔室的孔，用铝箔包裹整个幻灯片。将微阵列滑入杂交烤箱，盖上盖子，让它在选定的杂交温度下轻轻旋转两个小时。两小时后，拆下滑轨，取出铝箔，移液器取出杂交溶液，并小心地撕下杂交室。将幻灯片转移到装有 30 毫升非严格洗涤缓冲液的离心管中。在室温下大力摇动两分钟。将幻灯片转移到装有 30 毫升严格洗涤缓冲液的离心管中，然后大力摇动一分钟。最后，将幻灯片转移到一个离心管中，其中含有30毫升的最终洗涤缓冲液。摇几秒钟。在微阵列离心机中干燥幻灯片。现在，将干微阵列，合成区域朝下，放在微阵列扫描仪的滑动架上。要去保护并切割DNA库，请将滑入裂解溶液中，浸入50毫升的离心管中。关闭管子，用塑料密封膜包裹，然后轻轻旋转轨道摇床两小时，在室温下。两小时后，拆下滑梯，用20毫升的干醋酸盐洗涤两次，然后让其风干。使用移液器，在现在可辨识的合成区域应用100微升无菌水。将溶液上下移几下，然后将其转移到1.5毫升微离心管中。重复此过程，将微阵列水分露组合到同一管中。将芯片蒸发至干燥，然后重新溶解成10微升无核酸酶H2O。此处显示的是在含有 25mer 序列的 DNA 和 RNA 版本的微阵列上进行的杂交测定的结果。中的扫描以与 Cy3 荧光的激发、发射光谱相对应的绿色比例格式显示，荧光强度以任意单位为单位记录。实验之间绝对荧光值存在显著变异性。显示了三个独立合成的结果，使用相同的制造参数和相同的合成后处理。25mer DNA，当混合到其互补的Cy3标签DNA链，将产生荧光信号范围从2万到30，000，很少高于或低于。25mer RNA，当杂交到相同的Cy3标签DNA补充，将给相应的特征的荧光强度从15，000到20，000不等。然而，RNA/DNA双工的荧光强度偶尔会下降到8000以下，而相应的DNA/DNA双面体在2万到3万范围内仍然荧光。在这种情况下，RNA 的结果可被视为次优。与任何其他基于RNA的实验一样，重要的是要记住RNA微阵列对降解敏感，应在无菌条件下处理。从微阵列收集的核酸库可用于DNA或RNA测序以及DNA数字信息编码。NED 会产生强烈的紫外线，不应直接观察。因此，建议在仪器使用时佩戴护目镜。

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用 5-Bromouridine 标记和免疫沉淀 RNA 合成的研究

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

回顾性 MicroRNA 排序: 用福尔马林固定石蜡嵌入 RNA 标本补充 DNA 文库制备协议

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

基于纠错 DNA 和 RNA 测序的稀有事件检测方法

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

RNA原位杂交法定量分析小鼠脑切片中的替代前 mRNA 拼接方法

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...