Name: high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den østrigske videnskabs fond (FWF Grants P23797, P27275 og P30596) og den schweiziske National Science Foundation (Grant #PBBEP2_146174).

<ol>
	<li>Bumgarner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. 101, 22 (2013).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specificity+and+energy+landscapes+of+DNA-binding+molecules.">Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules.</a> Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).</li><li>Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+sequence+space+of+a+DNA+aptamer+using+microarrays.">Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).</li><li>Franssen-van Hal, N. L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Light-Directed+Synthesis+of+Aptamer+Microarrays.">Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).</li><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Chemistry+.4.+Synthesis+of+Deoxyoligonucleotides+on+a+Polymer+Support.">Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support.</a> Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li><li>Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Assembly+from+Chip-Synthesized+Oligonucleotides.">Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).</li><li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+gene+synthesis+by+selective+amplification+of+DNA+pools+from+high-fidelity+microchips.">Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips.</a> Nature Biotechnology. 28 (12), 1295 (2010).</li><li>Richmond, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+and+assembly+of+chip-eluted+DNA+(AACED):+a+method+for+high-throughput+gene+synthesis.">Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).</li><li>Schmidt, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+amplification+of+strand+subsets+from+chip-synthesized+oligonucleotide+libraries.">Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Chemical+Preservation+of+Digital+Information+on+DNA+in+Silica+with+Error-Correcting+Codes.">Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).</li><li>Erlich, Y., Zielinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Fountain+enables+a+robust+and+efficient+storage+architecture.">DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture.</a> Science. 355 (6328), 950-953 (2017).</li><li>Garalde, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+direct+RNA+sequencing+on+an+array+of+nanopores.">Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.</a> Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).</li><li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+complex+nucleic+acid+libraries+using+highly+parallel+in+situ+oligonucleotide+synthesis.">Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis.</a> Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).</li><li>LeProust, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+high-quality+libraries+of+long+(150mer)+oligonucleotides+by+a+novel+depurination+controlled+process.">Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).</li><li>Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M., Fern&#225;ndez-Lucas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives. , (2018).</li><li>Fodor, S. P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Addressable+Parallel+Chemical+Synthesis.">Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis.</a> Science. 251 (4995), 767-773 (1991).</li><li>Singh-Gasson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maskless+fabrication+of+light-directed+oligonucleotide+microarrays+using+a+digital+micromirror+array.">Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).</li><li>Pease, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Generated+Oligonucleotide+Arrays+for+Rapid+DNA-Sequence+Analysis.">Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).</li><li>Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Power+365+nm+UV+LED+Mercury+Arc+Lamp+Replacement+for+Photochemistry+and+Chemical+Photolithography.">High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography.</a> ACS Sustainable Chemistry &amp; Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).</li><li>Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetal+Levulinyl+Ester+(ALE)+Groups+for+2&#8242;-Hydroxyl+Protection+of+Ribonucleosides+in+the+Synthesis+of+Oligoribonucleotides+on+Glass+and+Microarrays.">Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2&#8242;-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).</li><li>Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+chemical+synthesis+of+rU-DNA+chimeras+on+chips+and+enzymatic+recognition.">In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition.</a> Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).</li><li>Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+RNA+microarrays+synthesized+in+situ+by+photolithography.">High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).</li><li>Agbavwe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency,+Error+and+Yield+in+Light-Directed+Maskless+Synthesis+of+DNA+Microarrays.">Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays.</a> Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).</li><li>Sack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Express+photolithographic+DNA+microarray+synthesis+with+optimized+chemistry+and+high-efficiency+photolabile+groups.">Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).</li><li>Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+o-Nitrobenzyl+Photolabile+Groups+for+Light-Directed+Chemistry+and+Microarray+Synthesis.">Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).</li><li>Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Light-Directed+Synthesis+of+Mirror-Image+Microarrays+in+a+Photochemical+Reaction+Cell+with+Flare+Suppression.">Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression.</a> Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-cleavable+microarrays+for+the+characterization+of+DNA+and+RNA+oligonucleotides+synthesized+in+situ+by+photolithography.">Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography.</a> Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).</li><li>Krotz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+stability+and+degradation+pathway+of+deoxyribonucleoside+phosphoramidites+in+acetonitrile.">Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).</li><li>Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Degradation+of+Dg+Phosphoramidites+in+Solution.">The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).</li><li>McGall, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+light-directed+synthesis+of+DNA+arrays+on+glass+substrates.">The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).</li><li>Collett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+RNA+microarrays+for+high-throughput+screening+of+antiprotein+aptamers.">Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers.</a> Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+RNA-protein+interactions+on+a+massively+parallel+array+reveals+biophysical+and+evolutionary+landscapes.">Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes.</a> Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).</li><li>Wu, C. -. H., Holden, M. T., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Fabrication+of+High-Density+RNA+Arrays.">Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).</li><li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+multiplex+gene+synthesis+from+programmable+DNA+microchips.">Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips.</a> Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+affinity+landscape+of+Thrombin-binding+aptamers+on+2'F-ANA/DNA+chimeric+G-Quadruplex+microarrays.">Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).</li></ol>

Forfatterne attesterer, at de ikke har nogen tilknytning til nogen for-profit organisation.

Solid-fase DNA og RNA syntese er brød og smør af hver nukleinsyre kemi Lab, og selv om tilsætning af litografiske komponenten er ganske vist en kompleks operation, mikroarray fabrikation medieret af UV-lys er også en meget pålidelig proces . Det er desuden den eneste tilgængelige metode til in situ-RNA-syntese på mikroarrays. Stadig, som i enhver flertrins eksperimenterende procedure, der er rigelig plads til menneskelige fejl.
Måske er det mest kritiske skridt koblingen af en phosphoramidite, da det skal være en konstant højtydende kemisk reaktion for at give oligonukleotider med få syntetiske fejl. I vores microarray syntese protokol, phosphoramidite kobling er endnu mere afgørende for den samlede syntese kvalitet, da fremstillingsprocessen omgår capping og forhindrer oligonucleotid rensning. Der er beregnet trinvis koblings effektivitet på over 99% for alle lysfølsomme DNA-og RNA-phosphoramiditer, selv for meget korte koblingstider (15 s)24 , men der kan lejlighedsvis forekomme lavere koblings udbytter, navnlig for GD amidites vedkommende. Stabiliteten af de solubilized phosphoramiditer ved stuetemperatur er blevet undersøgt før og blev påvist at afhænge af arten af nukleobasen, med guanosin phosphoramiditer tilbøjelige til omfattende nedbrydning i kun et spørgsmål om dage29, 30. Men ved opbevaring ved-25 °C blev GD phosphoramiditer opløst i ACN, da 30 mM opløsning fandtes at være stabile i flere uger. Den relative ustabilitet i GD phosphoramidite-opløsninger ved stuetemperatur betyder dog, at de ikke skal holdes fastgjort til DNA-synthesizeren i flere dage.
For RNA-phosphoramiditer er koblings udbyttet meget afhængigt af phosphoramidite-kvaliteten (som kan vurderes ved 31P NMR-spektroskopi) og koblings tiden. Koblingstider på 5 minutter for rA, rG, rC og 2 min for rU synes nødvendige. Faktisk fandt vi, at afkortning af kondensations tiden til 2 min for alle RNA phosphoramiditer førte til signifikant lavere hybridiserings signaler.
DNA-synthesizeren selv, såvel som reagenser og opløsningsmidler, skal helt sikkert være så ren som muligt for at opnå det højeste udbytte af oligonukleotidsyntesen. Imidlertid, uopløseligt materiale, salte eller partikler, kan ophobes over tid i linjer og slanger af leveringssystemet, hvilket fører til en gradvis fald i forbruget af reagenser og reactanter. Hvis en generel rengøring af synthesizeren ikke løser et lavt udgangsvolumen, kan en stigning i antallet af impulser være en alternativ løsning. Særlig nyttig i tilfælde af lavt phosphoramidit-forbrug kan linjen i koblings protokollen, der svarer til pumpning af en blanding af phosphoramidite og aktivator (tredje linje i koblings under afsnittet i tabel 1 og tabel 2), modificeret fra 6 til 9 impulser uden nogen mærkbar negativ virkning på syntese kvaliteten. Desuden er antallet af pulser af aktivator nødvendig for at bringe amidite/aktivator blandingen til syntesen substrat (i øjeblikket 6, fjerde linje i koblingen under afsnit, se tabel 1 og tabel 2) afhænger af DNA-synthesizer selv samt på slange længde i syntese cellen. Dette tal kan justeres efter udskiftning af phosphoramiditten med en farvet opløsning og tælle antallet af impulser, der er nødvendige for at skubbe den farvede blanding til glas substrat for kobling.
Den beskrevne metode gør det muligt for DNA og RNA-syntese at fortsætte samtidig, på samme mikroarray. Hybrider af DNA og RNA kan også forberedes uden ændring af array fabrikations protokollerne, og så længe tretrins-debeskyttelses protokollen følges. Det skal dog bemærkes, at kun RNA-mikroarrays kræver en to-trins debeskyttelse: en decyanoethylering først med et3N efterfulgt af hydroxyl og base deprotection med hydrazin. DNA-nukleobaser blev fundet ufuldstændigt debeskyttet under disse betingelser og har brug for yderligere trin i EDA for at gennemføre fuldstændig fjernelse af phenoxyacetyl (PAC) grupper. Denne ekstra behandling med EDA er kortere (5 min) end for standard debeskyttelse af DNA-mikroarrays31, men det er tilstrækkeligt at køre den til færdiggørelse efter triethylamin-og hydrazinbehandlinger. Desuden begrænser en kort reaktionstid med EDA eksponeringen af et fuldt debeskyttet RNA-oligonukleotid til grundlæggende betingelser.
En fordel af in situ RNA array syntese over alternative metoder som spotting eller DNA transkription32,33,34 er evnen til at opbevare den syntetiserede RNA mikrochip i beskyttet form indtil brug, og dermed undgå risiko for potentiel RNA-nedbrydning. Efter syntetiske procedurer for RNA betyder på den anden side, at forbrugsstoffer og reagenser holdes sterile, og at håndteringen udføres under RNase-frie forhold. Bemærk, vi fandt, at tilføjelsen af RNase-hæmmer til hybridiseringmixet ikke gav stærkere hybridiserings signaler til RNA-funktionerne.
Syntesen af DNA-biblioteker på en base-følsom monomer er mere kompleks end syntesen af et par kontrol sekvenser på en overflade, og som sådan er helt sikkert mere tilbøjelige til at designe fejl. Men under forudsætning af, at sekvens design (dvs. karakteren og antallet af sekvenser) er korrekt, omdanne denne liste til en samling af eksponerings masker og en bestilt serie af koblingscyklusser forbliver en ligetil proces. Men, vigtige variationer fra standard microarray syntese findes og er afgørende for en vellykket fabrikation af en high-density bibliotek array.
Først, en base-følsom dT monomer er koblet som den første phosphoramidite efter syntese af linker. Koblings udbyttet af denne monomer (figur 1) blev fundet at være relativt lav, omkring 85%28, hvilket er grunden til bestræbelserne på at forbedre sin iblanding, enten ved at øge sin koncentration i ACN fra 30 mm til 50 mm, eller ved at gentage koblings trin: to på hinanden følgende koblings reaktioner ved hjælp af friske monomerer eller to separate, men fortløbende koblingscyklusser.
Den anden ændring er tilføjelsen af en β-caroten opløsning i den bageste kammer af syntese cellen, som bekvemt absorberer 365 nm lys. Dette er en vigtig modifikation af fotolitografi opsætningen, da det forhindrer UV-lys i at reflektere tilbage på array substrat. Faktisk, efter at have krydset den interstitielle medium mellem substrater, indkommende UV-lys udgange gennemboret dias og når kvarts blok af cellen. Fresnel ligninger forudsige, at ~ 4% af vinkelret hændelse UV-lys vil afspejle fra hver af de tre downstream luft-glas interfaces (udgang side af 2nd substrat og begge sider af kvarts blokken) og tilbage på syntese substrat, som fører til utilsigtet eksponering af photoprotected oligonukleotider. Diffraktion og spredning bidrager også til "off-Target" foto beskyttelse og dermed til nukleotid indsættelse, som direkte påvirker fejlfrekvensen af syntese, men disse bidrag er meget mindre end refleksioner og kan primært løses ved reducere syntese tæthed (efterlader huller mellem funktioner). Vi har konstateret, at niveauet af β-caroten opløsning i det nedre kammer af cellen tendens til let falde kun i løbet af de første minutter af array syntese, og derfor skal overvåges og justeres.
Endelig er den tredje ændring den debeskyttelses løsning, der erstatter EtOH for toluen, som holder det kløvede DNA-bibliotek bundet til overfladen, formentlig gennem elektrostatiske interaktioner. Hvis du anvender en lille mængde vand til syntese området efter ACN-vask, kan biblioteket nemt samles. Processen er dog kun vellykket, hvis vandindholdet i EDA og toluen er minimal, hvilket gør nukleinsyre helt uopløseligt i deprotection cocktail. Alternativt kan DNA-biblioteker blive kløvet af chippen ved hjælp af ammoniak9,10,14,35og derefter yderligere debeskyttet ved at opvarme den DNA-holdige ammoniakopløsning til 55 °c natten over. Genopretning af DNA-biblioteker med ammoniak er dog ikke kompatibelt med RNA. RNA-oligonukleotider på et underlag med base-spaltning kan eluppes fra overfladen ved hjælp af den samme EDA/toluen-procedure, der er beskrevet ovenfor, men kun i den næstsidste fase efter et3N og hydrazin to-trins debeskyttelses strategi28.
Alternative strategier til at inddrive oligonucleotid puljer fra mikroarrays uden behov for en specifik grundlæggende behandling eksisterer, er i princippet forenelige med fotolitografi og stole på brugen af enzymer. For eksempel kan et enkelt deoxyuracil nucleotid være målet for uracil-DNA DNA (udg) og fjernet fra resten af DNA-sekvensen, eller en enkelt RNA-enhed kan genkendes af RNase H type 2-enzymer og fosfodiester-obligationen 5 ' til RNA-kløvet , frigivelse af 5 ' DNA del23.
Vi har nu en kraftfuld, pålidelig og high-density metode til syntese af DNA, RNA, og hybrid DNA/RNA-mikroarrays. Disse kan ikke kun fungere som platforme for hybridisering eller bindende assays36, men de repræsenterer også en hurtig og billig måde at producere komplekse nukleinsyre biblioteker. For DNA-baseret digital datalagring kan mikroarray fotolitografi blive en potentiel løsning på "skrivning" flaskehalsen (dvs. til kodning af oplysninger ved syntese). Succesen i digital kodning på DNA og i de Novo gensamling afhænger af sekvens troskab, som på syntese niveau, giver sig udslag i fejlfrekvensen. Syntetiske og optiske fejl i vores nuværende array fabrikations protokoller vil blive diskuteret og rapporteret på andre steder. Parallelt hermed er der nu bestræbelser på at øge fabrikations skalaen og-gennemstrømningen yderligere.

Den praktiske anvendelse af DNA-mikrosystemer har traditionelt været i studiet af variationerne i genekspressions niveauerne mellem to cellepopulationer ved hjælp af komplementære tråde og fluorescens som en detektionsmetode1. Lejlighedsvis, DNA-mikroarrays venture i bindende begivenheder med ikke-nukleinsyre ligands, såsom proteiner, med en strategi for systematisk sekvens permutation, der giver et omfattende overblik over det bindende landskab2,3, 4,5. Denne tilgang omdanner effektivt mikroarrays fra blotte hybridiserings flader til platforme med bred sekvens dækning, hvilket ville være et aktiv for studiet af den rigere og mere komplekse verden af RNA-struktur og-funktion. Understøttet af den ekstremt effektive phosphoramidite kobling reaktion6, in situ SYNTETISEREDE DNA-arrays kan nu også betragtes som en billig kilde til DNA7, som er ved at blive særlig relevant i betragtning af den stadigt stigende efterspørgsel efter nukleinsyre materiale til genmontering af genet8,9, DNA-baserede nanostrukturer10, informationslagring eller sekvensering11,12. Tilsvarende kan sekvensering teknologier forventes at drage fordel af udviklingen af metoder, der giver meget komplekse blandinger af RNA oligonukleotider13. I denne sammenhæng, array fabrikations protokoller, der giver mulighed for oligonukleotider at syntetiseres in situ og ved høj densitet er ideelt placeret til at opfylde behovene i det hastigt voksende område af nukleinsyre bioteknologi. Med et så mangfoldigt område som bioteknologi kan formålet med hver ansøgning dog kræve, at DNA på mikroarray produceres enten ved høj gennemløb eller med en meget lille mængde syntetiske fejl14,15eller begge, hvilket kræver en nærmere kig på de syntese protokoller af DNA-mikroarrays, som historisk set primært er blevet optimeret til hybridiseringassays. I mellemtiden, in situ syntese af RNA-mikroarrays har været fundet at være en udfordrende bestræbelse, med de fleste af de vanskeligheder forbundet med beskyttelse gruppe for 2 '-Oh funktion, normalt en af-delen i standard solid-fase syntese, der er fjernet med fluor baserede reagenser, kemikalier, der er uforenelige med glas-eller silicium-overflader. Disse problemer og udfordringer i DNA og RNA-mikroarray syntese har sidst været genstand for en stor mængde af arbejde, især med litografiske tilgang16.
Photolithography bruger UV-lys til at fjerne blokeringen af oligonukleotider før kobling og kræver masker til at konstruere et mønster af UV-eksponering, og dermed spatialt organisere og kontrollere væksten af oligonukleotider. Fysiske masker er blevet erstattet af computerstyrede micromirrorer, hvis hældning selektivt reflekterer UV-lys på mikroarray substratet17,18,19. Som en UV-kilde, bruger vi 365 nm lys fra en høj effekt LED kilde20. Nuværende fotolitografiske opsætninger er udstyret med betegnelsen Micromirror Device arrays, der indeholder 1024 × 768 spejle, svarende til mere end 780.000 individuelt adresserbare pletter ("funktioner") på et lille område på kun 1,4 cm2eller 1080p med arrays af 1920 × 1080, eller > 2 millioner spejle. Hver af spejlene i enheden har derfor direkte kontrol over den sekvens, som dyrkes på den tilsvarende funktion. Med undtagelse af UV-lys, fotolitografi funktioner som en solid-fase syntese teknik og vedtager cyklus-baserede phosphoramidite kemi. Kun det kræver en helt anden beskyttelse strategi for RNA syntese til at lykkes. Vi har udviklet en ny serie af lysfølsomme RNA-phosphoramiditter, der bærer hydrazin-labile beskytter grupper21. Disse monomerer gør det muligt for RNA at blive debeskyttet under milde forhold, der ikke påvirker integriteten af overfladen. Et første deprotection trin bruger triethylamin til at fjerne cyanoethyl fosfodiester beskyttende grupper, mens hydrazin anvendes i et andet, separat trin for at fjerne dem på 2 '-OH og exocyclic Amin funktioner. Derved kan RNA-oligonukleotider ~ 30-NT i længden og af enhver sekvens nu syntetiseres in situ på mikroarrays22,23. Parallelt hermed er vi også for nylig begyndt at behandle spørgsmålene om gennemløb, kvalitet og hastighed i DNA og RNA photolithography. Vi målte koblings effektivitet > 99% for alle DNA-og RNA-amiditter (figur 1) og undersøgte hvert enkelt trin i oligonukleotidforlængede cyklussen, fra oxidations tiden, til valg af aktivator og til optimal UV-eksponering24 , 25. vi har bragt i nye lys-følsomme 5 ' beskyttelse grupper, der kan fjernes i sekunder kun, omdanne syntesen af hundredtusinder af 100mers i et par timer-lang proces26. Vi har også fordoblet gennemløb af array fabrikation ved at udsætte to substrater samtidigt27. Endelig har vi introduceret en dT phosphoramidite, der indeholder en base-følsom succinyl gruppe som en bekvem måde at kløve, indsamle og analysere DNA og RNA-oligonukleotider, hvilket er centralt for Biblioteks forberedelse28.
På trods af den relativt verdsligt aspekt af DNA og RNA solid-fase syntese, især for nukleinsyre kemikere, mikroarray litografiske forbliver en ikke-triviel opgradering kræver en kompleks opsætning, omhyggelig kontrol og tilsyn med processen, og separate instruktioner for post-syntetisk håndtering afhængigt af arten af oligonukleotid og typen af ansøgning. I denne artikel ønsker vi at give en detaljeret præsentation af hele trin-for-trin procedure af in-situ syntese af DNA og RNA-mikroarrays ved photolithography, fra eksperimentel design til dataanalyse, med vægt på forberedelse af instrumenter og Forbrugsvarer. Vi beskriver derefter de post-syntetiske debeskyttelses metoder, der svarer til det tilsigtede formål med mikroarray fabrikation (dvs. enten hybridisering eller genopretning af nukleinsyre biblioteker).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:792px;" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Slide functionalization</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetic acid &#62;99.8%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">33209</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">CNC router</td>
			<td style="width:175px;">Stepcraft</td>
			<td style="width:119px;">300 CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">1.07017.2511</td>
			<td>For deprotection and functionalization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide</td>
			<td style="width:175px;">Gelest</td>
			<td style="width:119px;">SIT8189.5</td>
			<td>Silanizing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Nexterion Glass D microscope slides</td>
			<td style="width:175px;">Schott</td>
			<td style="width:119px;">1095568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Polymax 1040</td>
			<td style="width:175px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Proclean 507 Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:175px;">Ulsonix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z860086</td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Microarray synthesis</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.25 M dicyanoimidazole in ACN</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004712402BS</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.7 XGA DMD</td>
			<td style="width:175px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital Micromirror Device</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:332px;">20 mM I2 in pyridine/H2O/THF</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L860020-06</td>
			<td>Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">250 &#956;m thick Chemraz 584 perfluoroelastomer</td>
			<td style="width:175px;">FFKM</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Lower teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2&#39;-O-ALE RNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">365 nm high-power UV-LED</td>
			<td style="width:175px;">Nichia</td>
			<td style="width:119px;">NVSU333A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;BzNPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">Orgentis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;NPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">FlexGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0001205402BS</td>
			<td>For DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amidite Diluent for DNA synthesis</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L010010</td>
			<td>For dissolving phosphoramidites</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Cleavable dT</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Base-sensitive monomer for library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DMSO</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004474701BS</td>
			<td>As exposure solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DNA and RNA microarray deprotection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethylenediamine &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3550</td>
			<td>For deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Expedite 8909</td>
			<td style="width:175px;">PerSeptive Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA synthesizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">225819</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Imidazole</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Industrial Strength lower-density PTFE tape</td>
			<td style="width:175px;">Gasoila</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thin, upper teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Pyridine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P57506</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Triethylamine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0886</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#946;-carotene</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9750</td>
			<td>For library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization and scanning</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">20x Sodium Saline Citrate</td>
			<td style="width:175px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">1054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;Cy3-labelled complementary strand</td>
			<td style="width:175px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For duplex hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">R3961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">EDTA molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">GenePix 4100A</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:175px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:119px;">230500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES monohydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">69889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES sodium</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NaCl &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SecureSeal SA200 hybridization chamber</td>
			<td style="width:175px;">Grace BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">623503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Spectrafuge mini</td>
			<td style="width:175px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">C1301</td>
			<td>Microarray centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tween-20 molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Data extraction</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Excel</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For data extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MatLab</td>
			<td style="width:175px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NimbleScan 2.1</td>
			<td style="width:175px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Desalting and quantification</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Toluene</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">ZipTip C18</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ZTC18s008</td>
			<td>Desalting pipet tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries

Photolithography er en kraftfuld teknik til syntesen af DNA-oligonukleotider på glas skred, da det kombinerer effektiviteten af phosphoramidite kobling reaktioner med præcision og tæthed af UV-lys reflekteres fra mikrometer-størrelse spejle. Photolithography giver mikroarrays, der kan rumme fra hundredtusinder op til flere millioner forskellige DNA-sekvenser, 100-NT eller længere, på kun et par timer. Med denne meget store sekvens plads, er mikroarrays ideelle platforme til at udforske mekanismerne i nukleinsyre · ligand interaktioner, som er særligt relevante i tilfælde af RNA. Vi rapporterede for nylig om forberedelsen af et nyt sæt af RNA-phosphoramiditer, der er kompatible med in situ-fotolitografi, og som efterfølgende blev brugt til at dyrke RNA-oligonukleotider, homopolymere samt blandede base sekvenser. Her illustrerer vi i detaljer processen med RNA-mikroarray fabrikation, fra det eksperimentelle design, til instrumentelle setup, array syntese, deprotection og endelige hybridiseringassay ved hjælp af en skabelon 25mer sekvens, der indeholder alle fire baser som et eksempel. Parallelt, vi går ud over hybridization-baserede eksperimenter og udnytte microarray litografiske som en billig gateway til komplekse nukleinsyre biblioteker. For at gøre dette, er high-density DNA-mikroarrays fremstillet på en base-følsom monomer, der gør det muligt for DNA at være bekvemt spaltet og hentes efter syntese og debeskyttelse. Fabrikations protokollen er optimeret for at begrænse antallet af syntetiske fejl, og med henblik herpå introduceres et lag β-caroten-opløsning for at absorbere UV-fotoner, der ellers kan afspejle sig tilbage på syntese substrater. Vi beskriver i en trinvis måde den komplette proces af bibliotekets forberedelse, fra design til spaltning og kvantificering.

DNA-og RNA-mikroarray-hybridisering Figur 5 viser resultaterne af en hybridiserings analyse udført på et mikroarray, der indeholder DNA-og RNA-versionerne af en 25mer sekvens (5 '-GTCATCATCATGAACCACCCTGGTC-3 ' i DNA-form). Scanningen i figur 5a vises i et grønskala format svarende til excitation/emission spektrum af Cy3 fluorescens, med fluorescens intensitet registreres i vilkårlige enheder mellem 0 og 65536. Matrix designet fulgte det 25:36-funktions layout, der er beskrevet i afsnittet protokol. Scanningen vises efter korrekt orientering af arrayet, med det øverste venstre hjørne befolket med den længste kæde af fiducial funktioner. Her indeholder de fiducial funktioner DNA-versionen af 25mer og bør i princippet altid give et positivt fluorescens signal for at udføre scannings justering og dataudtræk. Det hybridiserede mikroarray skal fremstå ensartet lyse, og kanterne af det sammenfattende område er dog normalt lysere end midten (op til 50% lysere). Den store mængde sekvens replikater, tilfældigt fordelt i hele området, reducerer virkningen af rumlige artefakter. Her blev hver sekvens (DNA og RNA) syntetiseret ved 2.000 tilfældige steder. Der er typisk lav fluorescens støj (baggrund), < 50 a.u., hvilket fører til et signal/støjforhold i rækkefølgen 200:1 til 800:1 i hybridiseringassays. Efter dataudvinding, fluorescens intensiteter er gennemsnit ud og plottet ± SD.
Der er signifikant variation i absolutte fluorescens værdier mellem forsøgene. Her viser vi resultaterne for tre uafhængige synteser ved hjælp af de samme fabrikations parametre og den samme post-syntetisk håndtering. Den 25mer DNA, når hybridiseret til sin komplementære Cy3-mærkede DNA-streng, vil give fluorescens signaler spænder overalt fra 20.000 til 30.000, meget sjældent over eller under. Den 25mer RNA, når hybridiseret til samme Cy3-mærkede DNA-komplement, vil give fluorescens intensiteter på de tilsvarende funktioner spænder fra 15.000 til 20.000. Dog vil fluorescens intensitet af RNA/DNA-duplexer lejlighedsvis falde til under 8.000, når de tilsvarende DNA/DNA-duplexer stadig vil fluorescerer inden for 20000-30000-området. I sådanne tilfælde kan resultaterne for RNA betragtes som suboptimale. En syntese eller hybridisering fiasko, enten for DNA eller RNA, vil være umiddelbart mærkbar under scanningen fra den indlysende mangel på fluorescens. Der er flere muligheder for at RNA-syntesen enten mislykkes eller delvist lykkes, og de vil blive skitseret i diskussions delen.
Bibliotek debeskyttelse, kavalergang og nyttiggørelse Afhængigt af kompleksiteten og tætheden af biblioteket, formen og skitse af den syntetiserede array kan ses uden forstørrelse, men under ordentlig belysning (figur 4), med DNA stadig i beskyttet form. Efter debeskyttelse med EDA/toluen, og før tilsætning af vand for at indsamle det spaltet bibliotek, kan det syntese område, der indeholder de nu debeskyttede oligonukleotider, skille sig ud som en hydrofile zone, når resten af glas diaset vises dækket med et uklar hydrofobe lag. Den direkte observation af det sammenfattende område afhænger af det samlede areal, der anvendes til at syntetisere oligonukleotider: større brug af det sammenfattende område vil svare til en større chance for klar sondring mellem hydrofile og hydrofobe regioner på overfladen. Omvendt, biblioteker syntetiseres ved hjælp af færre spejle og med mindre funktioner kan ikke umiddelbart observerbare.
Tilsvarende er mængden af genvundet DNA efter afsaltningen direkte proportional med det samlede areal, der anvendes til syntese. Hvis alle funktioner anvendes til oligonukleotidsyntesen, skal spaltnings-og genvindings proceduren give mellem 25 og 30 pmol af DNA. En 10% anvendelse af det sammenfattende område vil derfor kun give ca. 3 pmol af DNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg"> Figur 1 . Kemiske strukturer af DNA og RNA phosphoramidites anvendes i oligonucleotid syntese af microarray photolithography. Standard nitrophenylpropyloxycarbonyl (NPPOC) lysfølsomme beskyttelse grupper på 5 '-OH bruges i regelmæssig DNA og RNA mikroarray syntese til hybridisering formål. For syntesen af komplekse DNA-biblioteker, den mere photolabile benzyl-NPPOC (BzNPPOC) foretrækkes på 5 '-OH, som BzNPPOC fjernes dobbelt så hurtigt som NPPOC, hvilket reducerer den samlede mikroarray syntese tid betydeligt. DNA-oligonukleotider til biblioteker kræver også kobling af en spalte dt monomer ved 3 ' ende. Denne monomer, som bærer en succinyl ester funktion, vil blive kløvet under debeskyttelse, gør det muligt for DNA, der skal indsamles fra mikrochip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg"> Figur 2 . Eksempel på en maske som en billedfil, der sendes til betegnelsen Micromirror Device enheden under UV-eksponering. De hvide pixels svarer til spejle, som vil blive vippes i positionen "on", hvilket afspejler UV-lys på syntese cellen. Sorte pixels svarer til "off" spejle, hvor UV-lys vil blive afspejlet væk fra cellen. Hvide pixels vil derfor give mulighed for koblingen af den næste indkommende phosphoramidite på oligonukleotider findes på de tilsvarende funktioner på glas substrater. Oligonucleotides syntetiseres på de funktioner, hvis tilsvarende spejle er, i denne maske fil, vil sorte pixels dog forblive inaktive under den næste koblings hændelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg"> Figur 3 . Fotografier af mikromatrixbilledlitografi optisk og syntese setup. (A) optisk kredsløb til UV-eksponering. UV-lys fra UV-LED er først homogeniseret gennem en rektangulær-tværsnit lys-pipe derefter reflekterer på micromirrors. Micromirrorer, der er blevet vippes ind i en "OFF" position vil afspejle UV-lys væk fra syntese cellen, men micromirrors i "ON" position vil afspejle lys på syntese cellen, beliggende på brændplanet, ved først at passere gennem en 1:1 Offner relæ billeddannelses system. B) den sammenfattende celle, når den er samlet, består af et boret dias placeret først på cellens kvarts blok, adskilt af en tyk PTFE-pakning (ikke vist). En anden, ikke-boret slide er derefter placeret over den borede slide, adskilt af en tynd PTFE pakning. En metal ramme (ikke vist) holder samlingen sammen. (C). for Biblioteks forberedelse, når syntese cellen er fastgjort på brændplanet for indkommende UV-lys, fyldes kammeret mellem kvarts blokken og den borede slide med en 1% opløsning af β-CAROTEN i LM2CL2. For at gøre dette, er en ekstra indløbs-og Udløbsslange fastgjort til kvarts blokken og den orange opløsning flyder fra højre til længst til venstre position. Strømmen af reagenser og opløsningsmidler til syntesen er vist i hvide pile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg"> Figur 4 . Syntese området er normalt synligt for det blotte øje. Her kan et DNA-bibliotek ses på glasoverfladen lige efter syntese, med DNA stadig i beskyttet form. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg"> Figur 5 . Hybridiseringassays til 25mer DNA og RNA-sekvenser syntetiseres in situ på mikroarrays. (A) Fluorescens scanning af hele hybridiseret DNA og RNA-mikroarray. 25mer DNA og RNA-oligonukleotider er hybridiseret til deres Cy3-mærkede komplementære tråde. Arrayet blev scannet med en laser ved en 532 nm excitation bølgelængde, ved 5 μm opløsning. B) Fluorescens intensiteter (vilkårlige enheder) af DNA: DNA og RNA: DNA-duplexer i tre separate eksperimenter. De lyse grønne data for in situ syntetiserede RNA-oligonukleotider kan betragtes som suboptimale sammenlignet med fluorescens intensiteten af de tilsvarende DNA-sekvenser. Fejllinjer er SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg"> Figur 6 . Skematisk gengivelse af debeskyttelse, spaltning og nyttiggørelse procedure for DNA-biblioteker syntetiseret på mikroarrays. DNA-sekvenser dyrkes på en base-følsom spalte dt nucleosid (vist i zoomet område). Efter syntese er debeskyttelse af DNA-oligonukleotider (base beskyttende grupper repræsenteret som røde sfærer) i EDA/toluen efterlader det debeskyttede materiale elektrostatisk bundet til overfladen og kan derefter pipetteres ved at anvende en lille mængde vand på det syntetiserede område. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg"> Figur 7 . Repræsentativt absorbans spektrum (220-350 nm) af et spaltet, antibiotikum DNA-bibliotek indeholdende 4.000 forskellige sekvenser, 100-NT i længden. I alt 940 ng af DNA blev isoleret fra en enkelt matrix syntese, svarende til 30 pmol af DNA i alt eller 15 pmol pr. glas substrat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg"> Tabel 1. Repræsentativ cyklus protokol for kobling/oxidation/foto debeskyttelse af 5 '-BzNPPOC-da, forudsat den tilsvarende fosforamidite blev indlæst på port "A". Koblings tiden (i sekunder) vises på linjen "par monomer". UV-fotodebeskyttelsestid, her svarende til en stråleenergi på 3 J/cm2 (bznppoc photochemistry), beregnes som den tid, der er gået mellem de to "Event 2 out"-kommunikationssignaler.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg"> Tabel 2. Repræsentativ cyklus protokol for kobling/oxidation/foto debeskyttelse af 5 '-NPPOC-rA, forudsat at den tilsvarende RNA phosphoramidite blev indlæst på port "A". Koblings tiden (i sekunder) vises på linjen "par monomer". UV-fotodebeskyttelsestid, her svarende til en stråleenergi på 6 J/cm2 (nppoc photochemistry), beregnes som den tid, der er gået mellem de to "Event 2 out"-kommunikationssignaler.

Watch this Scientific Journal Video about High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries at JoVE.com

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

High-density DNA og RNA-mikroarrays-Photolithographic syntese, hybridisering og fremstilling af store nukleinsyre biblioteker

I denne artikel præsenterer og diskuterer vi nye udviklinger i syntesen og anvendelser af nukleinsyre-mikroarrays, som er fabrikeret in situ. Konkret viser vi, hvordan protokollerne for DNA-syntese kan udvides til RNA, og hvordan mikromatricer kan bruges til at oprette hentes nukleinsyre-biblioteker.

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

DNA og RNA microarrays er meget nyttige til at studere samspillet mellem nukleinsyrer og proteiner, men de er også en bekvem metode til fremstilling af sekvensbiblioteker. Fotolitografi giver mulighed for hundredtusindvis af unikke sekvenser, der skal syntetiseres parallelt og er i øjeblikket den eneste direkte metode til RNA syntese på microarrays. Den in situ fotolitografiske syntese af microarrays kan også udvides til kemisk modificerede oligonukleotider, for eksempel med to prime fluoro af peptid nukleinsyrer.At se processen med microarray fabrikation og håndtering kan hjælpe med at forstå, hvordan denne komplekse maskiner blev udviklet fra den velkendte standard solid fase DNA syntese. Begynd denne procedure med microarray-design og diasfunktionalisering som beskrevet i tekstprotokollen. Tænd for DNA synthesizer UV LED og dens køleventilator.Fastgør en UV-intensitetsmåler i omdrejningspunktet for indgående UV-lys, og tænd den. Start WiCell Controller-softwaren på computeren. Tænd for og initialiser mikromereenheden.Indlæs en helt hvid maskefil ved at højreklikke på DMD og derefter vælge indlæse billede. Højreklik på UVS-ikonet, og vælg UV-lukkeren åben. Læs effektværdien på intensitetsmåleren, og tæl 60 sekunder.Efter 60 sekunder skal du læse effektværdien igen og notere start- og slutværdierne ned. Luk lukkeren ved at vælge UV-lukker tæt og slå intensitetsmåleren fra. Den gennemsnitlige UV-intensitetsværdi beregnes i milliwatt pr. centimeter kvadrat.I WiCell-softwaren skal du indlæse job-, sekvens- og protokolfilerne i deres respektive undervinduer og derefter klikke på Send for at sende sekvens- og protokolfilerne til DNA-synthesizeren. For at samle syntesecellen skal du placere en tyk perfluoroelastomerpakning på cellens kvartsblok. Placer derefter en boret, funktionaliseret mikroskop dias på toppen af den første pakning, og kontrollere, at hullerne på diasene forbinde med indløb og udløb slange af syntesecellen.Placer en anden, tynd polytetrafluorethylenpande over den borede rutsjebane, der omgiver de to huller. Endelig placere en anden, funktionaliseret, men udrillet dias oven på den anden pakning. Placer nu en 4-skrue metalramme oven på den samlede dobbeltunderlagscelle Stram skruen til den samme fastspændingskraft ved hjælp af en momentskruetrækker.Fastgør indløbs- og udløbsslangen til DNA-synthesizeren. Prime acetonitrile vask linje og kontrollere den korrekte strøm af acetonitril gennem substrater. Mål mængden af acetonitrile på affaldslinjen efter at have gennemgået syv cyklusser af acetonitrile priming.Dette volumen skal være to milliliter. Fastgør syntesecellen på fokale plan af indgående UV-lys. I tilfælde af biblioteksforberedelse fastgøres en ekstra indløbs- og udløbslinje på cellens bagende, og bagkammeret fyldes med betacarotens to milliliter.Start syntesen ved først at klikke på Kør i WiCell-softwaren. Ved den første ventkommando i jobfilen skal du trykke på start på DNA-synthesizeren. Efter syntese af regelmæssige microarrays, afbryde cellen fra synthesizer, og adskille cellen.Brug en diamantpen til at ætse syntesenummeret på glasdiasene. Æt nummeret på den ikke-syntetiserede ansigt af hvert dias. Rutsjebanerne overføres til 50 millilitercentrifugerør, og opbevares i et udtørret område indtil videre brug.Efter syntesen af bibliotekets mikroarrays skal betacarotenopløsningen først tømmes ud af kammeret to gange ved at flyde fem milliliter methylenchlorid igennem, før det drænes. For DNA mikroartri deprotection, fylde en farvning glaskrukke med 20 milliliter ethanol og 20 milliliter EDA. Placer DNA-only microarrays lodret i krukken, luk låget, og lad diasene afbeskytte i to timer ved stuetemperatur.Efter to timer, hente dias ved hjælp af en pincet og skyl dem grundigt med dobbelt-destilleret vand. Tør objektglassene i en mikroarraycentrifuge i et par sekunder, før de opbevares i en ekssiccator. Ved RNA microarray deprotection klargøres en tør opløsning på 20 milliliter triethylamin og 30 milliliter acetonitrile i et 50 milliliter centrifugerør.Overfør en RNA microarray slide ind i centrifugerøret, luk låget og wrap med plast forsegling film. Ryst forsigtigt centrifugerøret på en orbitalshaker i en time og 30 minutter ved stuetemperatur. Dernæst skal du fjerne diaset og vaske to gange med 20 milliliter tør acetonitril før tørring i en microarray centrifuge i et par sekunder.Efter det første afprotektionstrin overføres RNA-rutsjebanen ind i hydrazinhydratopløsningen, lukkes låget og paks med plastforseglingsfilm. Efter to timers forsigtigt omrystning på en orbital shaker, fjerne dias og vaske det to gange med 20 milliliter tør acetonitril. Tør derefter i en mikroarray centrifuge i et par sekunder.Hvis RNA mikroarray også indeholder DNA nukleotider, fortsætte med en tredje deprotection trin. Tilsæt DNA/RNA microarray til et 50 milliliterrør, der indeholder en til en EDA-ethanolopløsning Efter 5 min ved stuetemperatur fjernes diaset, og mikroarray to gange med 20 milliliter sterilt vand. Tør diaset i en mikroarray centrifuge og opbevares i en ekssiccator.I et 1,5 milliliter sterilt mikrocentrifugerør klargøres den hybridiseringsbuffer, der indeholder Cy3-mærket DNA, som beskrevet i tekstprotokollen. Bland og vortex løsningen. Placer forsigtigt et selvklæbende 300 mikroliterhybribiliseringskammer over synteseområdet på hvert dias og pipet i hybridiseringsopløsningen.Dæk hullerne i kammeret med selvklæbende prikker og pak hele diaset ind i aluminiumsfolie. Placer mikroarray dias i hybridisering ovnen, dække og lad det forsigtigt rotere ved den valgte hybridisering temperatur i to timer. Efter to timer, løsrive diaset, fjerne aluminiumsfolie, pipette ud hybridisering løsning, og forsigtigt rive hybridisering kammer.Overfør objektglassene til et centrifugerør, der indeholder 30 milliliter ikke-streng vaskebuffer. Ryst kraftigt i to minutter ved stuetemperatur. Skubet overføres til et centrifugerør med 30 milliliter streng vaskebuffer, og ryst kraftigt i et minut.Endelig overføres rutsjebanen til et centrifugerør, der indeholder 30 milliliter Final Wash Buffer. Ryst i et par sekunder. Tør rutsjebanen i en mikroarray centrifuge.Nu skal du placere den tørre microarray, syntese område vender nedad, i diasholderen af microarray scanneren. For at afbeskytte og kløve DNA-biblioteker nedsænkes diaset i spaltningsopløsningen i et 50 milliliter centrifugerør. Luk røret og wrap med plast forsegling film, før forsigtigt roterende i en orbital shaker i to timer ved stuetemperatur.Efter to timer fjernes rutsjebanen og vaskes to gange med 20 milliliter tør acetonitril, før det lufttørres. Med en pipette, anvende 100 mikroliter sterilt vand over den nu mærkbar syntese område. Rør opløsningen op og ned et par gange, før den overføres til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Gentag processen og kombinere microarray eluat i samme rør. Spånelekluatet til tørhed og genså derefter i 10 mikroliter nukleosfri H2O. Vist her er resultaterne af en hybridisering analyse udført på en microarray indeholder DNA og RNA versioner af en 25mer sekvens.Scanningen i vises i et grønskalaformat, der svarer til excitation, emissionsspektret af Cy3 fluorescens, med fluorescensintensitet registreret i vilkårlige enheder. Der er signifikant variation i absolutte fluorescensværdier mellem eksperimenter. Resultaterne for tre uafhængige synteser ved hjælp af de samme fabrikationsparametre og den samme post syntetiske håndtering vises.Den 25mer DNA, når hybridiseret til sin komplementære Cy3-mærket DNA-streng, vil give fluorescens signaler spænder overalt fra 20, 000 til 30, 000, meget sjældent over eller under. 25mer RNA, når hybridiseret til samme Cy3-mærket DNA supplement, vil give fluorescens intensiteter på de tilsvarende funktioner fra 15, 000 til 20,000. Fluorescensintensiteten af RNA/DNA-duplexerne vil dog af og til falde til under 8.000, når de tilsvarende DNA/DNA-dupleks stadig vil fluorescere inden for intervallet 20.000 til 30.000.I sådanne tilfælde kan resultaterne for RNA betragtes som suboptimale. Som med alle andre RNA-baserede forsøg er det vigtigt at huske, at RNA microarrays er følsomme over for nedbrydning, og bør håndteres under sterile forhold. Nukleinsyre biblioteker indsamlet fra microarrays kan anvendes i DNA eller RNA sekventering samt i kodning af digitale oplysninger om DNA.NED producerer et intenst UV-lys, som ikke bør ses direkte på. På grund af dette tilrådes det at bære beskyttelsesbriller, mens instrumentet er i brug.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetik af efterslæb-DNA Synthesis<em&gt; In vitro</em&gt; Af bakteriofagen T7 replikationsproteiner

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering af DNA forurening i RNA prøver baseret på ribosomale DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation af indfødte kromatin Immunoprecipitation sekventering biblioteker for Nucleosome tæthed analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

En universel protokol for storstilet gRNA bibliotek produktion fra enhver kilde, DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse af transskription faktor bindende, transskription, Translation og omsætning skal vises Global begivenheder under aktivering af cellulære

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Undersøgelse af RNA syntese ved hjælp af 5-Bromouridine mærkning og Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekventering: Supplerende DNA bibliotek forberedelse protokollen ved hjælp af Formalin-fast Paraffin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjælden begivenhed registrering ved hjælp af fejl-korrigeret DNA og RNA sekventering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse af Alternative Pre-mRNA-Splicing i mus hjernen sektioner ved hjælp af RNA In Situ hybridisering Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...