Name: high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries at JoVE.com

עבודה זו הייתה נתמכת על ידי הקרן האוסטרית למדעים (FWF מענקים P23797, P27275 ו P30596) ואת הקרן הלאומית למדע השוויצרי (גרנט #PBBEP2_146174).

<ol>
	<li>Bumgarner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. 101, 22 (2013).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specificity+and+energy+landscapes+of+DNA-binding+molecules.">Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules.</a> Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).</li><li>Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+sequence+space+of+a+DNA+aptamer+using+microarrays.">Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).</li><li>Franssen-van Hal, N. L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Light-Directed+Synthesis+of+Aptamer+Microarrays.">Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).</li><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Chemistry+.4.+Synthesis+of+Deoxyoligonucleotides+on+a+Polymer+Support.">Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support.</a> Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li><li>Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Assembly+from+Chip-Synthesized+Oligonucleotides.">Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).</li><li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+gene+synthesis+by+selective+amplification+of+DNA+pools+from+high-fidelity+microchips.">Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips.</a> Nature Biotechnology. 28 (12), 1295 (2010).</li><li>Richmond, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+and+assembly+of+chip-eluted+DNA+(AACED):+a+method+for+high-throughput+gene+synthesis.">Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).</li><li>Schmidt, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+amplification+of+strand+subsets+from+chip-synthesized+oligonucleotide+libraries.">Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Chemical+Preservation+of+Digital+Information+on+DNA+in+Silica+with+Error-Correcting+Codes.">Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).</li><li>Erlich, Y., Zielinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Fountain+enables+a+robust+and+efficient+storage+architecture.">DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture.</a> Science. 355 (6328), 950-953 (2017).</li><li>Garalde, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+direct+RNA+sequencing+on+an+array+of+nanopores.">Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.</a> Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).</li><li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+complex+nucleic+acid+libraries+using+highly+parallel+in+situ+oligonucleotide+synthesis.">Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis.</a> Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).</li><li>LeProust, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+high-quality+libraries+of+long+(150mer)+oligonucleotides+by+a+novel+depurination+controlled+process.">Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).</li><li>Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M., Fern&#225;ndez-Lucas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives. , (2018).</li><li>Fodor, S. P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Addressable+Parallel+Chemical+Synthesis.">Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis.</a> Science. 251 (4995), 767-773 (1991).</li><li>Singh-Gasson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maskless+fabrication+of+light-directed+oligonucleotide+microarrays+using+a+digital+micromirror+array.">Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).</li><li>Pease, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Generated+Oligonucleotide+Arrays+for+Rapid+DNA-Sequence+Analysis.">Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).</li><li>Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Power+365+nm+UV+LED+Mercury+Arc+Lamp+Replacement+for+Photochemistry+and+Chemical+Photolithography.">High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography.</a> ACS Sustainable Chemistry &amp; Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).</li><li>Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetal+Levulinyl+Ester+(ALE)+Groups+for+2&#8242;-Hydroxyl+Protection+of+Ribonucleosides+in+the+Synthesis+of+Oligoribonucleotides+on+Glass+and+Microarrays.">Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2&#8242;-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).</li><li>Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+chemical+synthesis+of+rU-DNA+chimeras+on+chips+and+enzymatic+recognition.">In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition.</a> Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).</li><li>Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+RNA+microarrays+synthesized+in+situ+by+photolithography.">High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).</li><li>Agbavwe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency,+Error+and+Yield+in+Light-Directed+Maskless+Synthesis+of+DNA+Microarrays.">Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays.</a> Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).</li><li>Sack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Express+photolithographic+DNA+microarray+synthesis+with+optimized+chemistry+and+high-efficiency+photolabile+groups.">Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).</li><li>Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+o-Nitrobenzyl+Photolabile+Groups+for+Light-Directed+Chemistry+and+Microarray+Synthesis.">Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).</li><li>Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Light-Directed+Synthesis+of+Mirror-Image+Microarrays+in+a+Photochemical+Reaction+Cell+with+Flare+Suppression.">Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression.</a> Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-cleavable+microarrays+for+the+characterization+of+DNA+and+RNA+oligonucleotides+synthesized+in+situ+by+photolithography.">Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography.</a> Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).</li><li>Krotz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+stability+and+degradation+pathway+of+deoxyribonucleoside+phosphoramidites+in+acetonitrile.">Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).</li><li>Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Degradation+of+Dg+Phosphoramidites+in+Solution.">The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).</li><li>McGall, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+light-directed+synthesis+of+DNA+arrays+on+glass+substrates.">The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).</li><li>Collett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+RNA+microarrays+for+high-throughput+screening+of+antiprotein+aptamers.">Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers.</a> Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+RNA-protein+interactions+on+a+massively+parallel+array+reveals+biophysical+and+evolutionary+landscapes.">Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes.</a> Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).</li><li>Wu, C. -. H., Holden, M. T., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Fabrication+of+High-Density+RNA+Arrays.">Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).</li><li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+multiplex+gene+synthesis+from+programmable+DNA+microchips.">Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips.</a> Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+affinity+landscape+of+Thrombin-binding+aptamers+on+2'F-ANA/DNA+chimeric+G-Quadruplex+microarrays.">Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).</li></ol>

המחברים מאשרים שאין להם זיקה לארגון למטרת רווח.

בשלב מלא DNA סינתזה RNA הוא הלחם והחמאה של כל מעבדת הכימיה חומצות גרעין, ולמרות התוספת של הרכיב פוטוליטוגרפיה הוא מודה פעולה מורכבת, ייצור microarray מתווכת על ידי אור UV הוא גם תהליך אמין מאוד . זה, בנוסף, השיטה היחידה הזמינה לסינתזה של RNA באתרו במיקרו-מערכים. עדיין, כמו בכל הליך ניסיוני רב שלבית, יש מקום מספיק לטעות אנוש.
אולי הצעד הקריטי ביותר הוא זיווג של זרחניות, כפי שהיא צריכה להיות תגובה כימית מניב כל הזמן על מנת להרשות לעצמו מחלת האלרגיה עם כמה טעויות סינטתיים. בפרוטוקול סינתזה של המיקרו-מערך שלנו, מצמד זרחניות הוא אפילו יותר מרכזי לאיכות הסינתזה הכוללת מאז תהליך הייצור עוקף את הסגירה ומונע טיהור והאטה. הזיווגים מצמד היעילות למעלה 99% חושבו עבור כל ה-DNA הרגישים לאור היום ו-RNA זרחנות, אפילו עבור צימוד זמני מאוד קצר (15 s)24 אך תשואות הצימוד התחתון יכול להתרחש מדי פעם, במיוחד במקרה של dG am,. היציבות של זרחתי מסיסות בטמפרטורת החדר נחקר לפני והוצגה תלויה בטבעו של הנוקלאוטיסיס, עם guanosine זרחיות מועדים להשפלה נרחבת רק בעניין של ימים29, . בסדר, 30 אבל כאשר מאוחסן ב-25 ° c, מומס dG amאידיטים התפרקה ACN כמו 30 מ"מ פתרון נמצאו יציבים במשך מספר שבועות. חוסר היציבות היחסית של הפתרונות של dG הזאמאידיט בטמפרטורת החדר עושה זאת אומר כי הם לא צריכים להיות מחוברים הסינתיסייזר DNA במשך כמה ימים.
לקבלת זרחתן של RNA, התשואה הצימוד תלויה מאוד באיכות זרחהמטרית (אשר ניתן להעריך על ידי 31P nmr ספקטרוסקופיית) וזמן צימוד. שעות צימוד של 5 דקות עבור rA, rG, rC ו-2 דקות עבור rU מופיעים כנדרש. אכן, מצאנו כי קיצור זמן העיבוי ל 2 דקות עבור כל זרחני ה-RNA הובילו לסימני הכלאה נמוכים באופן משמעותי.
הסינתיסייזר DNA עצמו, כמו גם את הריאגנטים ואת ממיסים, בהחלט צריך להיות נקי ככל האפשר על מנת להשיג את התשואה הגבוהה ביותר של סינתזה olig, הגאות. עם זאת, חומר בלתי מסיסים, מלחים או חלקיקים, יכול להצטבר לאורך זמן בקווים ואבובים של מערכת המסירה, המוביל ירידה הדרגתית בצריכת של ריאגנטים ומגיב. כאשר ניקוי כללי של הסינתיסייזר אינו פותר נפח פלט נמוך, עלייה במספר הפולסים יכולה להיות פתרון חלופי. שימושי במיוחד במקרה של צריכת זרחני נמוכה, הקו בפרוטוקול הצימוד המתאים לשאיבה של שילוב של זרחני וactivator (השורה השלישית של סעיף קטן בטבלה 1 ושולחן 2) יכול להיות שונה, מ 6 עד 9 פולסים ללא כל השפעה שלילית ניכרת על איכות סינתזה. יתר על כן, מספר פולסים של activator הצורך להביא את התערובת am,/activator למצע סינתזה (כיום 6, הקו הרביעי בסעיף הקטן הצימוד, לראות את שולחן 1 ואת הטבלה 2) תלוי הסינתיסייזר DNA עצמו, כמו גם על אורך אבובים בתא הסינתזה. מספר זה יכול להיות מותאם לאחר החלפת זאמדיום עם פתרון צבעוני לספור את מספר פולסים הדרושים כדי לדחוף את תערובת צבעונית למצע זכוכית עבור צימוד.
השיטה המתוארת כאן מאפשרת לסינתזה של DNA ו-RNA להמשיך בו זמנית, על אותו מיקרו-מערך. כלאיים של דנ א ו-RNA עשוי להיות מוכן ללא כל שינוי לפרוטוקולי ייצור מערך, וכל עוד פרוטוקול deprotection שלושה שלבים מעקב אחריו. עם זאת, יש לציין כי מיקרומערכי RNA בלבד דורשים הגנה בשני צעדים בלבד: decyanoלציה ראשון עם Et3N ואחריו הידרוקסיל והבסיס deprotection עם הידראזין. נוקלאואוטיות DNA נמצאו לא מוגנים לחלוטין תחת תנאים אלה, וצריך את הצעד הנוסף ב-EDA כדי להשפיע על ההסרה המלאה של הקבוצות פניאוקסימרחקסיל (Pac). טיפול נוסף זה עם EDA הוא קצר יותר (5 דקות) מאשר עבור ההגנה הסטנדרטית של ה-DNA מיקרו-מערכים31, אבל זה מספיק כדי להסיע אותו להשלמה לאחר הטיפולים triethylamine והידראזין. בנוסף, זמן תגובה קצר עם EDA מגביל את החשיפה של רנ א מלאה הגנה מפני RNA לתנאים בסיסיים.
יתרון של סינתזה באתרו rna מערך על שיטות חלופיות כמו לזהות או שעתוק DNA32,33,34 היא היכולת לאחסן את שבב ה-rna מסונתז בצורה מוגנת עד השימוש, ובכך הימנעות ה סיכון של השפלה פוטנציאל RNA. לאחר הליכים סינתטיים עבור RNA עושה, מצד שני, לרמוז כי מתכלים וריאגנטים נשמרים סטרילי, כי הטיפול מבוצע בתנאים RNase-free. של הערה, מצאנו כי תוספת של RNase מעכב לערבב הכלאה לא להניב אותות הכלאה חזק יותר עבור תכונות RNA.
הסינתזה של ספריות DNA על מונומר רגיש בסיס הוא מורכב יותר מאשר סינתזה של רצפים שליטה כמה על פני השטח, וככזה הוא בהחלט נוטה יותר שגיאות עיצוב. עם זאת, בהנחה שעיצוב הרצף (כלומר, הטבע ומספר הרצפים) נכון, הפיכת רשימה זו לאוסף של מסיכות חשיפה וסידרה מסודרת של מחזורי צימוד נשארת תהליך פשוט. עם זאת, וריאציות חשובות של סינתזה מיקרוarray סטנדרטית קיימים והם קריטיים לייצור מוצלח של מערך ספרייה בצפיפות גבוהה.
ראשית, dT מוניומר בסיס רגיש ביחד כמו זרחבידיום הראשון לאחר סינתזה של המקשר. התשואה הצימוד של מונומר זה (איור 1) נמצאה נמוכה יחסית, בסביבות 85%28, ולכן מאמצי מאמצים לשפר את שיעור ההתאגדות שלה, אם על ידי הגברת הריכוז שלה ב-acn מ 30 מ"מ ל 50 מ"מ, או על ידי חזרה על שלב צימוד: שתי תגובות צימוד רצופות באמצעות מונמרים טריים, או שני מחזורי צימוד נפרד אך רציפים.
השינוי השני הוא תוספת של פתרון β-קרוטן בחדר האחורי של תא הסינתזה, אשר באופן נוח סופג אור 365 ננומטר. זהו שינוי חשוב של ההתקנה פוטוגרפיה כפי שהוא מונע אור UV משתקפים בחזרה על מצע המערך. ואכן, לאחר שעברו את המדיום הבין-ביניים בין הסובסטרטים, הרמזור הנכנס יוצא דרך שקופית הקדח ומגיע לבלוק הקוורץ של התא. משוואות פרנל לחזות כי ~ 4% של האירוע ניצב אור UV ישקף מכל אחד שלוש במורד ממשקי זכוכית אוויר (בצד היציאה שלהמצע 2 ושני הצדדים של בלוק קוורץ) ובחזרה על מצע סינתזה, המוביל לחשיפה לא מכוונת. של פוטוונואואני עקיפה ופיזור גם תורמים "off-target" הגנה מפני התמונה, ולכן, כדי נוקלאוטיד ההכנסה, אשר משפיע ישירות על שיעור השגיאות של סינתזה, אבל תרומות אלה הם הרבה יותר קטן מאשר השתקפויות ניתן בעיקר להתייחס על ידי צמצום צפיפות הסינתזה (השארת פערים בין התכונות). מצאנו כי רמת הפתרון β-קרוטן בחדר התחתון של התא נוטה מעט להקטין רק במהלך הדקות הראשונות של סינתזה המערך, ולכן צריך להיות מנוטרים ולקרוא מראש.
לבסוף, השינוי השלישי הוא פתרון deprotection, החלפת אטואה עבור toluene, אשר שומר את ספריית ה-DNA ביקח מאוגד אל פני השטח, ככל הנראה באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטית. החלת כמות קטנה של מים לאזור הסינתזה לאחר השטיפה ACN מאפשר לספרייה להיות בנוחות נאסף. התהליך הוא אולם מוצלח רק אם תוכן המים ב-EDA ו טולואן הוא מינימלי, עיבוד חומצת גרעין מסיסים לחלוטין בקוקטייל deprotection. לחילופין, ספריות DNA יכול להיות ביקדה את השבב באמצעות אמוניה9,10,14,35, ולאחר מכן deprotected נוסף על-ידי חימום ה-DNA המכיל פתרון אמוניה מימית כדי 55 ° c לילה. ההתאוששות של ספריות DNA באמצעות אמוניה היא עם זאת לא תואם RNA. ה-RNA פורוזימטר על מצע בסיס הניתן לביטול יכול להיות חומק מן המשטח באמצעות אותו הליך EDA/toluene המתואר לעיל, אבל רק בשלב לפני אחרון לאחר Et3N ו הידראזין אסטרטגיה בשני שלבים הגנה28.
אסטרטגיות חלופיות לשחזור מאגרי המידע בבריכות שונות ממיקרו-מערכים ללא צורך בטיפול בסיסי מסוים, הינם בעקרון תואמים לליתוגרפיה ומסתמכים על שימוש באנזימים. למשל, נוקלאוטיד בודד יכול להיות היעד של uracil-DNA גליסיקלז (UDG) והוא מגורש משאר רצף ה-DNA, או יחידה RNA אחת ניתן לזהות על ידי RNase H סוג 2 אנזימים ואת הקשר פוספדודיסטר 5 ' אל RNA ביקח , משחררים את. ה -5-DNA חלק23
עכשיו יש לנו עוצמה, אמין וצפיפות גבוהה שיטה לסינתזה של DNA, RNA, ו-DNA היברידית/RNA מיקרומערכים. אלה לא יכולים רק לשמש פלטפורמות היברידיזציה או קשירה בחני36, אבל הם גם מייצגים דרך מהירה וזולה לייצר ספריות גרעין מורכבות חומצות. עבור אחסון נתונים דיגיטליים מבוססי DNA, פוטוגרפיה של microarray עשוי להפוך לפיתרון פוטנציאלי לצוואר בקבוק הכתיבה (כלומר, לקידוד מידע באמצעות סינתזה). ההצלחה בקידוד דיגיטלי ב-DNA ו בהרכבה גנטית של דה נובו תלוי בנאמנות רצף אשר, ברמת הסינתזה, מיתרגם את קצב השגיאה. שגיאות סינטתיים ואופטיים בפרוטוקולי ייצור המערך הנוכחיים שלנו יידונו וידווחו במקום אחר. במקביל, המאמצים מתבצעת כעת כדי להגדיל את היקף ייצור ותפוקה.

השימוש המעשי של מיקרומערכים DNA היתה באופן מסורתי במחקר של וריאציות ברמות הביטוי גנים בין שתי אוכלוסיות תאים, באמצעות קווצות משלימים וזריחה כמו שיטה לזיהוי1. מדי פעם, DNA מיקרו מערכים מיזם לתוך אירועים מחייב עם ליגנדס חומצה שאינם גרעין, כגון חלבונים, עם אסטרטגיה של תמורה רצף שיטתי המציעה סקירה מקיפה של נוף הכריכה2,3, 4,5. גישה זו משנה ביעילות מיקרומערכים ממשטחים היברידיים גרידא לפלטפורמות עם כיסוי רצף רחב, אשר יהיה נכס לחקר העולם עשיר יותר מורכב יותר של מבנה RNA ותפקוד. נתמך על ידי התגובה היעילה ביותר זרחהאמידיום6, מערכי ה-dna באתרו מסונתז יכול עכשיו גם להיחשב כמקור זול של ה-dna7, אשר הופכת רלוונטית במיוחד בהתחשב בביקוש הולך וגובר עבור חומצה גרעין חומר עבור הרכבה גנטית8,9, DNA מבוססי ננו מבנים10, אחסון מידע או רצף11,12. כמו כן, הטכנולוגיות ברצף עשויים להפיק תועלת מפיתוח שיטות שיניבו תערובות מורכבות מאוד של RNA פורוזימטר13. בהקשר זה, מערך הייצור פרוטוקולים המאפשרים oligונודיאודים להיות מסונתז באתרו ובצפיפות גבוהה ממוקמים באופן אידיאלי כדי לענות על הצרכים של השדה המתרחב במהירות של חומצות גרעין ביוטכנולוגיה. עם זאת, עם שדה מגוונות כמו ביוטכנולוגיה, המטרה של כל יישום עשוי לדרוש כי ה-DNA על microarray להיות מיוצר בתפוקה גבוהה או עם כמות נמוכה מאוד של שגיאות סינתטי14,15, או שניהם, דרישת מבט מקרוב על פרוטוקולי הסינתזה של מיקרומערכים DNA אשר, היסטורית, כבר אופטימיזציה בעיקר עבור היברידיזציה assays. בינתיים, סינתזה באתרו של מיקרומערכים RNA נמצא מאמץ מאתגר, עם רוב הקושי הקשור הקבוצה הגנה עבור 2 '-הו פונקציה, בדרך כלל moiety silyl בסינתזה בשלב אחיד רגיל כי הוא הוסר עם פלואור מבוססי ריאגנטים, כימיקלים שאינם תואמים עם זכוכית או סיליקון משטחים. אלה בעיות ואתגרים ב-DNA ו-RNA סינתזה microarray יש לאחרונה הנושא של גוף גדול של עבודה, במיוחד עם הגישה הפוטוגרפיה16.
פוטוליתוגרפיה משתמשת באור אולטרא סגול כדי לבטל את חסימת מחלת החמצן לפני הצימוד ודורשת מסכות לבניית תבנית של חשיפה אולטרא-סגול, ובכך לארגן ולשלוט בצמיחת הגידול של האוליונו, והשימוש בהם. מסיכות פיזיות הוחלפו על ידי מיקרומטר שבשליטת המחשב, שהטיה בררנית משקפת אור UV על מצע המיקרו-מערך17,18,19. כמקור UV, אנו משתמשים באור 365 ננומטר ממקור כוח גבוה LED20. הגדרות פוטוגרפיות נוכחיות מצוידות במערכים micromirror המכילים 1024 × 768 מראות, מתאים יותר מ 780,000 כתמים למיעון בנפרד ("תכונות") על שטח קטן של רק 1.4 ס"מ2, או 1080p עם מערכים של 1920 × 1080, או . > 2 מיליון מראות לכן כל המראות במכשיר יש שליטה ישירה על הרצף גדל על התכונה המתאימה. למעט אור UV, הפונקציות ליתוגרפיה כמו טכניקת סינתזה בשלב אחיד ומאמצת את הכימיה מבוססי מחזור זרחניאידיט. רק זה דורש אסטרטגיית הגנה שונה לחלוטין כדי סינתזה RNA להצליח. פיתחנו סדרה חדשה של זאמאידיטים RNA בעלי רגישות קלה הנושאת הידראזין-לבנה הגנה על קבוצות21. ונומרים אלה מאפשרים RNA להיות deprotected תחת תנאים קלים שאינם משפיעים על השלמות של פני השטח. הצעד הראשון הגנה משתמש triethyine כדי להסיר את ההגנה מפוספלי זרחן, בעוד הידראזין משמש בשלב השני, צעד נפרד כדי להסיר את אלה ב 2 '-או והפונקציות של אמין. בכל זאת עושה, רנ א פורוזימטר ~ 30-nt באורך ואת כל רצף יכול עכשיו להיות מסונתז באתרו על מיקרו מערכים22,23. במקביל, התחלנו גם לאחרונה לטפל בשאלות של תפוקה, איכות ומהירות ב-DNA ו-RNA photolithography. אנו מדדו יעילות צימוד > 99% עבור כל ה-DNA ו-RNA amidites (איור 1) וחקר כל צעד בודד במחזור התארכות olig, החל מזמן חמצון, לבחירה של activator ולחשיפה אופטימלית של UV24 , 25. הבאנו לקבוצות חדשות רגישות לאור 5, שניתן להסירם בתוך שניות בלבד, להפוך את הסינתזה של מאות אלפי מנות של 100 מיליון למשך שעות ספורות של תהליך26. הכפילו גם את תפוקת המערך של הייצור על ידי חשיפת שני מצעים בו27. בסופו של דבר, הצגנו זרחניות dT am, המכיל בסיס רגיש לקבוצה מאוד רגישה כדרך נוחה לקליב, לאסוף ולנתח DNA ו-RNA olig, שהוא מרכזי הכנה לספרייה28.
למרות ההיבט הארצי יחסית של DNA ו-RNA סינתזה שלב מוצק, במיוחד עבור חומצות גרעין כימאים, מיקרולוגרפיה microarray נשאר שדרוג לא טריוויאלי המחייב התקנה מורכבת, שליטה זהירה ופיקוח על התהליך, ו הוראות נפרדות לטיפול פוסט-סינתטי בהתאם לאופי השימוש בסוגי היישומים ולסוג היישום. במאמר זה, אנו רוצים לספק מצגת מפורטת של ההליך כולו צעד אחר צעד של סינתזה באתרו של DNA ו-RNA מיקרומערכים על ידי פוטוגרפיה, מתוך עיצוב ניסיוני לניתוח נתונים, עם דגש על הכנת מכשירים ו מתכלים. לאחר מכן נתאר את השיטות הפוסט-סינטתיים למניעת הגנה המתאימות למטרה המיועדת של ייצור microarray (כלומר, היברידיזציה או התאוששות מספריות חומצות גרעין).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:792px;" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Slide functionalization</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetic acid &#62;99.8%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">33209</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">CNC router</td>
			<td style="width:175px;">Stepcraft</td>
			<td style="width:119px;">300 CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">1.07017.2511</td>
			<td>For deprotection and functionalization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide</td>
			<td style="width:175px;">Gelest</td>
			<td style="width:119px;">SIT8189.5</td>
			<td>Silanizing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Nexterion Glass D microscope slides</td>
			<td style="width:175px;">Schott</td>
			<td style="width:119px;">1095568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Polymax 1040</td>
			<td style="width:175px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Proclean 507 Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:175px;">Ulsonix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z860086</td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Microarray synthesis</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.25 M dicyanoimidazole in ACN</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004712402BS</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.7 XGA DMD</td>
			<td style="width:175px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital Micromirror Device</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:332px;">20 mM I2 in pyridine/H2O/THF</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L860020-06</td>
			<td>Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">250 &#956;m thick Chemraz 584 perfluoroelastomer</td>
			<td style="width:175px;">FFKM</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Lower teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2&#39;-O-ALE RNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">365 nm high-power UV-LED</td>
			<td style="width:175px;">Nichia</td>
			<td style="width:119px;">NVSU333A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;BzNPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">Orgentis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;NPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">FlexGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0001205402BS</td>
			<td>For DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amidite Diluent for DNA synthesis</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L010010</td>
			<td>For dissolving phosphoramidites</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Cleavable dT</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Base-sensitive monomer for library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DMSO</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004474701BS</td>
			<td>As exposure solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DNA and RNA microarray deprotection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethylenediamine &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3550</td>
			<td>For deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Expedite 8909</td>
			<td style="width:175px;">PerSeptive Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA synthesizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">225819</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Imidazole</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Industrial Strength lower-density PTFE tape</td>
			<td style="width:175px;">Gasoila</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thin, upper teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Pyridine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P57506</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Triethylamine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0886</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#946;-carotene</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9750</td>
			<td>For library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization and scanning</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">20x Sodium Saline Citrate</td>
			<td style="width:175px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">1054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;Cy3-labelled complementary strand</td>
			<td style="width:175px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For duplex hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">R3961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">EDTA molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">GenePix 4100A</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:175px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:119px;">230500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES monohydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">69889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES sodium</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NaCl &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SecureSeal SA200 hybridization chamber</td>
			<td style="width:175px;">Grace BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">623503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Spectrafuge mini</td>
			<td style="width:175px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">C1301</td>
			<td>Microarray centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tween-20 molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Data extraction</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Excel</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For data extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MatLab</td>
			<td style="width:175px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NimbleScan 2.1</td>
			<td style="width:175px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Desalting and quantification</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Toluene</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">ZipTip C18</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ZTC18s008</td>
			<td>Desalting pipet tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries

פוטוליתוגרפיה היא טכניקה רבת-עוצמה לסינתזה של דנ א באמצעות שקופיות זכוכית, כפי שהיא משלבת את היעילות של תגובות מצמד זרחתית עם דיוק וצפיפות של אור UV המשתקף ממראות מיקרומטר בגודל. ליתוגרפיה מניב מיקרומערכים שיכולים להכיל מאות אלפי עד כמה מיליוני רצפי DNA שונים, 100-nt או יותר, בתוך שעות ספורות בלבד. עם מרחב זה גדול מאוד הרצף, microarrays הם פלטפורמות אידיאלי לחקור את המנגנונים של חומצת גרעין · ligand אינטראקציות, אשר רלוונטיים במיוחד במקרה של RNA. אנו דיווחו לאחרונה על הכנת קבוצה חדשה של זרחניות של RNA מתואם לפוטוגרפיה באתרו ואשר שימשו לאחר מכן כדי לגדל RNA olig, מhomopolymers כמו גם רצפי בסיס מעורב. כאן, אנו ממחישים בפרוטרוט את התהליך של ייצור מיקרוarray RNA, החל מהעיצוב הניסיוני, הגדרה אינסטרומנטלית, סינתזה מערך, הגנה ושיטת היברידיזציה סופית באמצעות רצף 25mer תבנית המכילה את כל ארבעת הבסיסים כדוגמה. במקביל, אנו הולכים מעבר לניסויים המבוססים על הכלאה ולנצל פוטוליתוגרפיה מיקרולוגרפיה כשער זול לספריות מורכבות של חומצות גרעין. כדי לעשות זאת, מיקרו-DNA בצפיפות גבוהה מיוצרים על מונומר רגיש בסיס המאפשר DNA להיות באופן נוח ביקע וחזר לאחר סינתזה והגנה. הפרוטוקול הייצור הוא ממוטב כדי להגביל את מספר השגיאות הסינטתיים לאפקט, שכבה של β-קרוטן הפתרון מוצג לקלוט פוטונים UV שעשויים אחרת לשקף בחזרה על מצעים סינתזה. אנו מתארים באופן צעד אחר צעד את התהליך המלא של הכנת הספרייה, מתוך עיצוב למחשוף וכימות.

היברידיזציה של המיקרו-DNA ו-RNA איור 5 מראה את התוצאות של שיטת היברידיזציה שבוצעה על מיקרוarray המכיל את ה-dna ו-RNA גרסאות של רצף 25mer (5 '-gtcatcatcatcctttttttttttttttttttttttttttttt הסריקה באיור 5מופיע בפורמט greenscale המתאים לספקטרום עירור/פליטה של Cy3 פלואורסצנטית, עם עוצמה פלואורסצנטית הקליט ביחידות שרירותיות בין 0 ו 65536. עיצוב המערך עקב אחר פריסת התכונות 25:36 המתוארת בסעיף הפרוטוקול. הסריקה מוצגת לאחר כיוון מתאים של המערך, כאשר הפינה השמאלית העליונה מאוכלסת בשרשרת הארוכה ביותר של תכונות fiducial. כאן, תכונות fiducial מכילות את גירסת ה-DNA של 25mer וצריך, בעיקרון, תמיד לתת אות זריחה חיובית כדי לבצע יישור סריקה וחילוץ נתונים. הוכלא microarray צריך להופיע בהיר אחיד, עם קצוות של אזור סינתזה להיות עם זאת בדרך כלל בהיר יותר מהמרכז (עד 50% בהיר). כמות גדולה של משכפל רצף, המופצים באופן אקראי ברחבי האזור, מפחית את ההשפעה של חפצים מרחביים. כאן, כל רצף (DNA ו-RNA) היה מסונתז ב 2,000 מיקומים אקראיים. יש בדרך כלל רעש של זריחה נמוכה (רקע), < 50 a.u., אשר מוביל ליחס אות/רעש בסדר של 200:1 אל 800:1 בתוך הכלאה assays. לאחר חילוץ נתונים, עוצמות של כוונת הזריחה הם הממוצע והתווה ± SD.
יש שינויים משמעותיים בערכי הקרינה המוחלטת בין ניסויים. כאן, אנו מראים את התוצאות עבור שלוש סינתזות עצמאיות באמצעות אותם פרמטרים הייצור ואת אותו טיפול לאחר סינתטי. ה-DNA 25mer, כאשר הוכלא המשלים שלה Cy3 המסומנת ה-DNA, תניב אותות פלואורסצנטית הנע בכל מקום מ 20,000 אל 30,000, לעתים רחוקות מאוד מעל או מתחת. ה-RNA 25mer, כאשר הוכלא אותו Cy3-DNA משלים את אותו, ייתן עוצמות כוונות הזריחה על התכונות המתאימות החל מ 15,000 אל 20,000. עם זאת, עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית ו-dna דופלקסים לפעמים ירידה מתחת 8,000, כאשר המקביל ה-dna ו-dna דופלקסים עדיין זרוח תוך טווח 20000-30000. במקרים כאלה, התוצאות עבור RNA עשוי להיחשב תת אופטימלית. סינתזה או כישלון הכלאה, גם עבור DNA או RNA, יהיה מורגש מיד במהלך סריקה מהעדר הברור של זריחה. ישנן מספר הזדמנויות לסינתזה של RNA להיכשל או להצליח באופן חלקי והם יהיו מתוארים בחלק הדיון.
הגנה מפני הספרייה, המחשוף וההתאוששות בהתאם למורכבות ולצפיפות הספרייה, ניתן לראות את הצורה והמתאר של המערך המסונתז ללא הגדלה, אך תחת תאורה נכונה (איור 4), עם הדנ א עדיין בצורה מוגנת. לאחר ביטול הגנה עם EDA/toluene, ולפני התוספת של מים כדי לאסוף את הספרייה ביקעת, את האזור סינתזה המכיל את מחלת הלוואי ה, הגנה מפני השטח עשוי להתבלט כאזור הידרופילי, כאשר שאר שקופית הזכוכית יופיע מכוסה בשכבת הידרופובי מטורבית. ההתבוננות הישירה באזור הסינתזה תלויה בשטח הכולל המשמש לסינתזה של האוקליונואודים: שימוש גדול יותר באזור הסינתזה יתאים לסיכוי רב יותר להבחנה ברורה בין אזורי הידרופיפילית והידרופובי על פני השטח. לעומת זאת, ספריות המעוצבות באמצעות פחות מראות ובתכונות קטנות יותר לא יהיו מיידי.
באופן דומה, את כמות ה-DNA התאושש לאחר התפלה הוא פרופורציונלי ישירות לאזור כולל המשמש סינתזה. אם כל התכונות משמשות לסינתזה של מחלת השמש, את המחשוף ואת ההתאוששות צריך להניב בין 25 ו 30 pmol של דנ א. 10% שימוש באזור סינתזה ולכן להרשות לעצמו רק סביב 3 pmol של ה-DNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg"> איור 1 . מבנים כימיים של DNA ו-RNA זרחניות המשמשים לסינתזה של מיקרוונואוגרפיה על ידי מיקרו-מערך. (Nאפון) הגנה מפני הקבוצות ב-5 '-OH משמשות בסינתזה של דנ א רגיל ו-RNA מיקרוarray למטרות הכלאה. לגבי סינתזה של ספריות DNA מורכבות, photolabile בנזיל-Nאפון (בייפופוס) מעדיפים ב 5 '-או, כמו B, כפי שהוסר באופן משמעותי פי שניים כמו Nאפון c, אשר מפחית בצורה משמעותית את זמן סינתזה מיקרו מערך הכולל. מחלת ה-DNA לספריות מחייב גם את הזיווג של dT מונומר בקלישים בסוף 3. מונומר זה, אשר נושאת פונקציה אסתר סוקסיל, יהיה לעבור במהלך deprotection, המאפשר DNA לאסוף מן השבב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg"> איור 2 . דוגמה למסיכה כקובץ תמונה שנשלח להתקן המיקרומימד במהלך חשיפה לקרני UV. הפיקסלים הלבנים מקבילים למראות אשר יהיו מוטה בתנוחת "ON", המשקף אור UV על תא הסינתזה. פיקסלים שחורים מתאימים "OFF" מראות, שבו אור UV ישתקפו הרחק מתא. לפיכך, פיקסלים לבנים יאפשרו לזיווג של הזרחניות הנכנסות הבאות על מצעים הזכוכית שנמצאו בתכונות המתאימות. מחלת האוגורונואז מסונתז על התכונות שמראות המקביל שלהן, בקובץ מסיכה זה, פיקסלים שחורים יישארו לא פעילים במהלך אירוע הצימוד הבא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg"> איור 3 . תמונות של ההתקנה האופטית והסינתזה של המיקרומערך. (א) מעגל אופטי לחשיפה לקרינת UV. אור UV מ UV-LED הוא הומוגניים הראשון באמצעות צינור אור מלבני-חוצה-חתך אז משקף על מיקרומטר. יקרו אשר כבר מוטה לתוך מיקום "OFF" ישקף אור UV מן התא סינתזה, אבל יקרו ב "על" מיקום ישקף אור על תא סינתזה, ממוקם במישור המוקד, על ידי הראשון עובר דרך ממסר 1:1 offner מערכת הדמיה. (ב) תא הסינתזה, שנאסף לאחר, מורכב משקופית קדח הממוקמת תחילה על בלוק הקוורץ של התא, מופרדים על ידי אטם עבה (לא מוצג). שקופית שנייה, שאינה מקדנית ממוקמת לאחר מכן על שקופית הקדח, ומופרדת באמצעות אטם דק. מסגרת מתכת (לא מוצגת) מחזיקה את ההרכבה יחד. (ג). עבור הכנה לספרייה, לאחר שתא הסינתזה מחובר במישור המוקד של אור UV הנכנס, החדר הממוקם בין בלוק הקוורץ לבין השקופית הקדח מתמלא בתמיסה של 1% של β-קרוטן ב-CH2Cl2. כדי לעשות זאת, אבובים לשקע נוספים מוצמד לבלוק קוורץ והפתרון הכתום זורם מהשמאלית ביותר למיקום השמאלי ביותר. זרם של ריאגנטים וממיסים עבור סינתזה מוצג חצים לבנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg"> איור 4 . אזור הסינתזה הוא בדרך כלל גלוי לעין בלתי. כאן, ספריית דנ א ניתן לראות על פני הזכוכית מיד לאחר סינתזה, עם ה-DNA עדיין בצורה מוגנת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg"> איור 5 . היברידיזציה הספר ל-DNA 25 מר ו-RNA רצפים מסונתז באתרו על מיקרו מערכים. (A) לסרוק את הקרינה הפלואורסצנטית של כל הוכלא DNA ו-RNA microarray. ה-DNA של 25mer ו-RNA oligהוכלא משלימים את החוטים המשלימים הCy3 שלהם. המערך נסרק עם לייזר ב-532-גל עירור ננומטר, ברזולוציה של 5 יקרומטר. (ב) כוונות הקרינה הפלואורסצנטית (יחידות שרירותיות) של ה-DNA: dna ו-RNA: דופלקסים ב-dna בשלושה ניסויים נפרדים. הנתונים הירוקים באור עבור מסונתז RNA oligונודיאודים באתרו יכול להיחשב תת אופטימלית, כאשר בהשוואה לעוצמת הזריחה של רצפי ה-DNA המתאימים. קווי שגיאה הם SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg"> איור 6 . ייצוג סכמטי של הליכי ההגנה, המחשוף וההתאוששות של ספריות DNA המסונתז במיקרו מערכים. רצפי DNA הם גדלו על בסיס רגיש לביקוד dT נוקלאוטיד (מוצג באזור מוגדלת). לאחר הסינתזה, הגנה על ה-DNA olig, בסיס קבוצות הגנה מיוצגים כספירות אדומות) ב-EDA/toluene מותיר את החומר המוגן באופן סטטי מאוגד לפני השטח ולאחר מכן יכול להיות מיוצר מצינורות על ידי החלת כמות קטנה של מים על האזור הסונתז. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg"> איור 7 . הספקטרום של ספיגת הנציגים (220-350 nm) של ספריית DNA, התפלה, הכוללת 4,000 רצפים שונים, 100-nt באורך. סך של 940 ng של ה-dna היה מבודד סינתזה מערך יחיד, המתאים 30 pmol של ה-dna סך, או 15 pmol לכל המצע הזכוכית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg"> . שולחן 1 פרוטוקול מחזור מייצג עבור צימוד/חמצון/הגנה מפני 5 '-בהזאפון-דא, בהנחה שהזרחנות המקבילה היתה טעונה ביציאה "א". זמן צימוד (בשניות) מוצג בשורת "הזוג מונומר". הזמן הגנה מפני צילום UV, כאן המתאים לאנרגיה קורנת של 3 J/cm2 (באור התמונה), מחושב כאשר חלף הזמן בין שני "אירוע 2 Out" אותות תקשורת.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg"> . שולחן 2 פרוטוקול מחזור מייצג עבור צימוד/חמצון/photodeprotection של 5 '-Nאפון-rA, בהנחה את המקבילה RNA זרחהאידידיום נטען על היציאה "A". זמן צימוד (בשניות) מוצג בשורת "הזוג מונומר". הזמן צילום UV הגנה, כאן מתאים לאנרגיה קורנת של 6 J/cm2 (כימיה n, כימיית התמונה), מחושב כמו הזמן שחלף בין שני "אירוע 2 Out" אותות תקשורת.

Watch this Scientific Journal Video about High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries at JoVE.com

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

בצפיפות גבוהה DNA ו-RNA מיקרומערכים-פוטוליתוגרפיה סינתזה, היברידיזציה והכנת ספריות גרעין גדול חומצות

במאמר זה, אנו מציגים ולדון התפתחויות חדשות סינתזה ויישומים של חומצות גרעין מיקרומערכים מפוברק באתרו. באופן ספציפי, אנו מראים כיצד הפרוטוקולים לסינתזה DNA ניתן להרחיב RNA וכיצד מיקרו מערכים ניתן להשתמש כדי ליצור לאחזור ספריות גרעין של חומצה.

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

DNA ו- RNA microarrays הם מאוד שימושי כדי ללמוד את האינטראקציות בין חומצות גרעין וחלבונים, אבל הם גם שיטה נוחה להכנת ספריות רצף. פוטוליטוגרפיה מאפשרת לסנתז מאות אלפי רצפים ייחודיים במקביל והיא כיום השיטה הישירה היחידה לסינתזת רנ"א על מיקרו-ריי. סינתזה פוטוליתוגרפית במקום של microarrays ניתן גם להאריך אוליגונוקלאוטידים שעברו שינוי כימי, למשל עם שני פלואורו ראשוני של חומצות גרעין פפטיד.לראות את התהליך של ייצור microarray וטיפול יכול לעזור להבין איך זה מכונות מורכבות פותחה מן סינתזת DNA שלב מוצק סטנדרטי ידוע. התחל הליך זה עם עיצוב microarray ופונקציונליזציה של שקופיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הפעל את ה-DNA סינתיסייזר UV LED ומאוורר הקירור שלה.חבר מד עוצמת UV בנקודת המוקד של אור UV נכנס ולהדליק אותו. במחשב, הפעל את תוכנת בקר WiCell. הפעל ואתחל את התקן המיקרו-מיר.טען קובץ מסיכה לבנה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על DMD ולאחר מכן בחירת תמונת טעינה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על סמל UVS ובחר תריס UV פתוח. קרא את ערך הה הספק במד האינטנסיביות וספיר 60 שניות.לאחר 60 שניות, קרא שוב את ערך צריכת החשמל ושים לב לערכי ההתחלה והסיום. סגור את התריס על ידי בחירת תריס UV סגור ולכבות את מד האינטנסיביות. חשב את ערך עוצמת UV הממוצע במילי וואט לריבוע סנטימטר.בתוכנת WiCell, טען את קבצי המשימה, הרצף והפרוטוקול בחלונות המשנה המתאימים שלהם, ולאחר מכן לחץ על שלח כדי לשלוח את קבצי הרצף והפרוטוקול לסינתיסייזר ה- DNA. כדי להרכיב את תא הסינתזה מניחים אטם perfluoroelastomer עבה על בלוק הקוורץ של התא. לאחר מכן מקם מגלשת מיקרוסקופ פונקציונלית שנקדחה על גבי אטם האגם הראשון, וודא כי החורים במגלשות מתחברים עם צינורות השקע והשקע של תא הסינתזה.מניחים אטם polytetrafluoroethylene שני, דק מעל המגלשה שנקדחה, המקיף את שני החורים. לבסוף, מניחים שקופית שנייה, פונקציונלית אך לא מסולסולת על גבי אטם השני. כעת הנח מסגרת מתכת של 4 ברגים על גבי תא המצע הכפול שהורכב הדק את המברג לאותו כוח הידוק באמצעות מברג מוטו.חבר את צינורות השקע והשקע לסינתיסייזר הדנ"א. ראש קו שטיפת אצטוניטריל ולאמת את הזרימה הנכונה של אצטוניטריל דרך המצעים. למדוד את נפח האצטוניטריל בקו הפסולת לאחר שעבר שבעה מחזורים של priming אצטוניטריל.נפח זה צריך להיות שני מיליליטר. חבר את תא הסינתזה במישור המוקד של אור UV נכנס. במקרה של הכנת הספרייה, לצרף עוד inlet קו שקע בחלק האחורי של התא ולמלא את התא האחורי עם שני מיליליטר של פתרון betacarotene.התחל את הסינתזה על ידי לחיצה ראשונה על הפעל בתוכנת WiCell. בפקודת ההמתנה הראשונה בקובץ המשימה, לחץ על התחל בסינתיסייזר הדנ"א. לאחר סינתזה של microarrays רגיל, לנתק את התא מן הסינתיסייזר, ולפרק את התא.השתמש בעט יהלום כדי תחריט את מספר הסינתזה על מגלשות הזכוכית. תחריט את המספר על הפנים הלא מסונתזות של כל שקופית. מעבירים את השקופיות לצינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר ולאחסן באזור מיובש עד לשימוש נוסף.לאחר הסינתזה של microarrays הספרייה, תחילה לנקז את פתרון betacarotene מתוך התא ולאחר מכן לשטוף את התא פעמיים על ידי זורם חמישה מיליליטר של מתילן כלוריד דרך לפני ניקוז. לקבלת דנ"א microarry deprotection, למלא צנצנת ויטראז'ים עם 20 מיליליטר של אתנול ו 20 מיליליטר של EDA. מניחים את המיקרו-ארקים של הדנ"א בלבד אנכית בצנצנת, סוגרים את המכסה ומשאירים את המגלשות כדי להתרכך במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר שעתיים, לאחזר את המגלשות באמצעות פינצטה ולשטוף אותם ביסודיות עם מים מזוקקים כפול. יבש את השקופיות בצנטריפוגה microarray במשך כמה שניות לפני אחסון אותם במייבש. עבור RNA microarray deprotection, להכין פתרון יבש של טריאתילאמין 20 מיליליטר ו 30 מיליליטר אצטוניטריל בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.מעבירים מגלשת RNA microarray אחת לתוך צינור הצנטריפוגה, סוגרים את המכסה ועוטפים בסרט איטום מפלסטיק. לנער בעדינות את צינור הצנטריפוגה על שייקר מסלולית במשך שעה ו -30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להסיר את השקופית ולשטוף פעמיים עם 20 מיליליטר של אצטוניטריל יבש לפני ייבוש צנטריפוגה microarray במשך כמה שניות.לאחר שלב deprotection הראשון להעביר את השקופית RNA לתוך פתרון הידרצין הידראט, לסגור את המכסה לעטוף עם סרט איטום פלסטיק. לאחר שעתיים של טלטול עדין על שייקר מסלולית, להסיר את המגלשה ולשטוף אותו פעמיים עם 20 מיליליטר של אצטוניטריל יבש. ואז להתייבש בצנטריפוגה microarray במשך כמה שניות.אם RNA microarray מכיל גם נוקלאוטידים DNA, להמשיך עם שלב deprotection שלישי. מוסיפים את ה-DNA /RNA microarray לצינור 50 מיליליטר המכיל פתרון אחד לאחד EDA-אתנול לאחר 5 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר את המגלשה, ולשטוף את microarray פעמיים עם 20 מיליליטר של מים סטריליים. יבש את השקופית בצנטריפוגה microarray ולאחסן במייבש.בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר, הכן את מאגר ההכלאה המכיל DNA המסומן ב- Cy3, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מערבבים ומערבולת את הפתרון. בזהירות למקם תא הכלאה עצמית דבק 300 microliter מעל אזור הסינתזה על כל שקופית pipet בתסמת ההכלאה.מכסים את חורי התא בנקודות דבק ועוטפים את כל השקופית בנייר אלומיניום. מניחים את המיקרו-ריי מחליקים לתנור ההכלאה, מכסים ומניחים לו להסתובב בעדינות בטמפרטורת ההכלאה שנבחרה למשך שעתיים. לאחר שעתיים, לנתק את השקופית, להסיר את רדיד אלומיניום, pipette את פתרון ההכלאה, בזהירות לקרוע את תא ההכלאה.העבר את השקופיות לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 30 מיליליטר של מאגר שטיפה לא מחמירות. יש לנער במרץ במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את השקופית לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 30 מיליליטר של חיץ שטיפה מחמירה לנער במרץ במשך דקה אחת.לבסוף, להעביר את השקופית לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 30 מיליליטר של חיץ לשטוף הסופי. לנער לכמה שניות. ייבש את המגלשה בצנטריפוגה מיקרו-ריי.עכשיו, למקם את microarray יבש, אזור סינתזה פונה כלפי מטה, במחזיק השקופית של סורק microarray. כדי להפוך את ספריות הדנ"א לחסימות ולחשוף אותן, טבול את הגלישה בתסכול המחשוף, בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. סוגרים את הצינור ועוטפים בסרט איטום מפלסטיק, לפני שמסתובבים בעדינות בשייקר מסלולי למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר שעתיים, להסיר את המגלשה ולשטוף פעמיים עם 20 מיליליטר של אצטוניטריל יבש בקפידה לפני לתת לו אוויר יבש. עם פיפטה, להחיל 100 microliters של מים סטריליים על אזור הסינתזה עכשיו ניכר. צינור את הפתרון למעלה ולמטה כמה פעמים לפני העברתו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.חזור על התהליך ולשלב את microarray eluate לתוך אותו צינור. להתאדות את השבב להתרומם עד יובש ולאחר מכן להתיז מחדש לתוך 10 microliters של H2O ללא גרעין. להלן תוצאות בדיקת הכלאה המבוצעת על מיקרו-ריי המכילה את גרסאות הדנ"א וה-RNA של רצף של 25 מ"ר.הסריקה מופיעה בפורמט ירוק התואם את העירור, ספקטרום הפליטה של פלואורסצנטיות Cy3, עם עוצמת פלואורסצנטיות נרשמת ביחידות שרירותיות. קיימת שונות משמעותית בערכי הפלואורסצנטיות המוחלטת בין הניסויים. התוצאות עבור שלושה סינתזות עצמאיות באמצעות אותם פרמטרי ייצור ואותו טיפול פוסט סינתטי מוצגות.הדנ"א 25mer, כאשר היברידית לגדיל ה-DNA המשלים שלה Cy3 שכותרתו, תניב אותות פלואורסצנטיים הנעים בין 20, 000 ל 30, 000, לעתים רחוקות מאוד מעל או מתחת. RNA 25mer, כאשר היברידית לאותה השלמה DNA Cy3 שכותרתו, ייתן שפע פלואורסצנטי על התכונות המתאימות הנעות בין 15, 000 עד 20, 000. עם זאת, עוצמת הפלואורסצנטיות של דופלקסים RNA / DNA יירד מדי פעם מתחת 8, 000, כאשר דופלקס DNA / DNA המתאים עדיין פלואורסצנטי בטווח 20, 000 עד 30, 000.במקרים כאלה, התוצאות עבור RNA עשוי להיחשב תת אופטימלי. כמו בכל ניסוי אחר המבוסס על RNA חשוב לזכור כי מיקרו-ריי RNA רגישים להשפלה, ויש לטפל בהם בתנאים סטריליים. ניתן להשתמש בספריות חומצות גרעין שנאספו ממיקרו-ריי ברצף DNA או RNA וכן בקידוד מידע דיגיטלי על דנ"א.NED מייצר אור UV אינטנסיבי אשר לא צריך להיות הסתכל ישירות. בגלל זה, מומלץ ללבוש משקפי מגן בזמן המכשיר נמצא בשימוש.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי חלבונים שכפול bacteriophage T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...