Name: high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00
Duration: 11 min 22 s
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この研究は、オーストリア科学基金(FWF助成金P23797、P27275およびP30596)とスイス国立科学財団(グラント#PBBEP2_146174)によって支援されました。

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著者は、彼らが任意の営利団体と提携していないと証明します。

固相DNAとRNA合成は、すべての核酸化学実験室のパンとバターであり、フォトリソグラフィー成分の添加は明らかに複雑な操作であるが、紫外線によって媒介されるマイクロアレイ製造も非常に信頼性の高いプロセスである。.さらに、マイクロアレイ上のオンシチュRNA合成において利用可能な唯一の方法である。それでも、他の多段階実験手順と同様に、ヒューマンエラーの余地は十分にあります。
おそらく最も重要なステップは、合成誤差の少ないオリゴヌクレオチドを与えるために常に高収量の化学反応である必要があるので、リンの結合です。当社のマイクロアレイ合成プロトコルでは、製造プロセスがキャッピングをバイパスし、オリゴヌクレオチド精製を防止するため、リンアミド結合は全体的な合成品質にさらに重要です。99%を超えるステップワイドカップリング効率は、非常に短い結合時間(15s)24であっても、すべての感光性DNAおよびRNAリンアミドに対して計算されているが、特にdGアミドの場合には、より低い結合収率が時折発生する可能性がある。室温での可溶化リンアミド化物の安定性は以前に調査され、ヌクレオベースの性質に依存することが示され、グアノシンリンアミドミド質は29日の間に広範囲に分解されやすくなり、 30.しかし-25°Cで保存すると、30mM溶液としてACNに溶解したdGリンアミドミドが数週間安定であることが判明した。しかし、室温でのdGリンアミダン化溶液の相対的な不安定性は、DNAシンセサイザーに数日間付着してはならないことを意味する。
RNAリンアミド化物の場合、結合収率はリンアミド質の品質(31 P NMR分光法で評価可能)およびカップリング時間に大きく依存する。rA、rG、rC、rUの場合は5分間のカップリング時間が必要と思われます。実際、すべてのRNAリンアミド化物の凝縮時間を2分に短縮すると、ハイブリダイゼーションシグナルが有意に低下することがわかりました。
DNAシンセサイザー自体、ならびに試薬および溶媒は、オリゴヌクレオチド合成の最高収率を達成するために、確かに可能な限りクリーンである必要があります。しかしながら、不溶性材料、塩または粒子は、送達システムのラインおよびチューブに時間をかけて蓄積し、試薬および反応物の消費量の徐々に減少する。シンセサイザーの一般的な洗浄が低出力ボリュームを解決しない場合、パルス数の増加は代替ソリューションになる可能性があります。低リンアミド化の場合に特に有用であり、リンアミドミサイトと活性化剤の混合物のポンピングに対応するカップリングプロトコル内のライン(表1および表2のカップリングサブセクションの第3行)を可能にすることができる。合成品質に大きな悪影響を及ぼすことなく、6~9パルスを変更します。さらに、アミディット/アクチベータミックスを合成基板に持ち込むのに必要な活性化剤のパルス数(現在、カップリングサブセクションの4行目、表1および表2参照)は、DNAシンセサイザー自体に依存し、合成細胞のチューブの長さ。この数は、リンアミドを着色溶液に置き換え、カップリング用のガラス基板に着色ミックスをプッシュするために必要なパルスの数をカウントした後に調整することができます。
ここに記載される方法は、DNAおよびRNA合成が同じマイクロアレイ上で同時に進行することを可能にする。DNAとRNAのハイブリッドは、アレイ製造プロトコルに変更を与えることなく、および3段階の保護解除プロトコルが続く限り調製されてもよい。しかし、RNAのみのマイクロアレイは、2段階の保護を必要とします:最初にEt3 Nでデシアノエチル化、続いてヒドロキシルとヒドラジンによる塩基保護を行います。DNA核酸塩基は、これらの条件下で完全に保護されていないことが判明し、フェノキシアセチル(Pac)基の完全な除去に影響を与えるためにEDAの追加ステップが必要です。EDAによるこの余分な治療は、DNAマイクロアレイ31の標準的な保護保護よりも短い(5分)であるが、トリエチルアミンおよびヒドラジン治療後に完了するためにそれを駆動するのに十分である。さらに、EDAとの短い反応時間は、完全に保護されたRNAオリゴヌクレオチドの暴露を基本条件に制限する。
スポッティングまたはDNA転写32、33、34のような代替方法に対するその代わりのRNAアレイ合成における利点は、合成されたRNAマイクロチップを使用するまで保護された形態で保存する能力であり、従って回避する。潜在的なRNA劣化のリスク。一方、RNAの合成後の手順は、消耗品や試薬が無菌に保たれ、RNaseフリー条件下で処理が行われることを意味します。なお、ハイブリダイゼーションミックスへのRNase阻害剤の添加は、RNA特徴に対してより強いハイブリダイゼーションシグナルを得られなかったことがわかった。
ベース感受性モノマー上のDNAライブラリの合成は、表面上のいくつかの制御配列の合成よりも複雑であり、そのため、確かに設計エラーが発生しやすくなります。しかし、シーケンス設計(すなわち、性質とシーケンス数)が正しいと仮定すると、このリストを露出マスクのコレクションに変換し、順序付けされた一連のカップリングサイクルは簡単なプロセスのままです。しかし、標準的なマイクロアレイ合成からの重要なバリエーションが存在し、高密度ライブラリアレイの製造を成功させるために重要です。
まず、基感受性dTモノマーは、リンカーの合成後の第1のリンオラミダイトとして結合される。このモノマー(図1)の結合収量(図1)は、ACN濃度を30mMから50mMに増加させることにより、または繰り返すことによって、その組み込み率を改善するための努力がなされる理由である。カップリングステップ:新鮮なモノマーを使用した2つの連続したカップリング反応、または2つの別々の連続したカップリングサイクル。
第2の変化は、365nmの光を便利に吸収する合成細胞の後部チャンバにβ-カロテン溶液を添加することです。これは、UV 光がアレイ基板に反射するのを防ぐため、フォトリソグラフィーセットアップの重要な変更です。実際に、基板間の間質媒体を横断した後、着信UV光は掘削されたスライドを通って出て、細胞の石英ブロックに達する。フレネル方程式は、垂直に入射された紫外線の約4%が、3つの下流のエアガラス界面(第2基板の出口側と石英ブロックの両側)から反射し、合成基板に戻ると予測しています。光保護オリゴヌクレオチドの意図しない暴露につながる。回折と散乱はまた、「オフターゲット」光消光に寄与し、したがって、合成の誤差率に直接影響を与えるヌクレオチド挿入に寄与するが、これらの寄与は反射よりもはるかに小さく、主に合成密度を減らす(特徴間のギャップを残す)。細胞の下部チャンバにおけるβ-カロテン溶液のレベルは、アレイ合成の最初の数分の間にのみわずかに減少する傾向があるため、監視し、再調整する必要があることがわかりました。
最後に、3番目の変化は、おそらく静電相互作用を介して、表面に結合した切り分けされたDNAライブラリーを保持するトルエンのEtOHを置き換える脱保護ソリューションです。ACN洗浄後に少量の水を合成領域に塗布することで、図書館を便利に回収することができます。しかし、このプロセスは、EDAおよびトルエン中の水分含有量が最小限であれば、核酸が保護解除カクテルに完全に不溶性を与える場合にのみ成功する。あるいは、DNAライブラリーは、アンモニア9、10、14、35を用いてチップを切断し、次いでDNA含有水性アンモニア溶液を一晩55°Cに加熱して更に非保護化してもよい。しかし、アンモニアを用したDNAライブラリーの回収はRNAと互換性がない。塩基板上のRNAオリゴヌクレオチドは、上述したのと同じEDA/トルエン手順を用いて表面から溶出することができるが、Et3Nおよびヒドラジン2段階脱保護戦略28の後の最終段階でのみである。
特定の基本的な治療を必要とせずにマイクロアレイからオリゴヌクレオチドプールを回収するための代替戦略が存在し、原理的にはフォトリソグラフィーと互換性があり、酵素の使用に依存する。例えば、単一のデオキシウラシルヌクレオチドは、ウラシルDNAグリコセラーゼ(UDG)の標的であり、DNA配列の残りの部分から切除することができ、または単一のRNA単位は、RNase H型酵素およびホスホジエステル結合5'によって、リーブされたRNAに認識することができる。、5' DNA パート23を解放します。
DNA、RNA、ハイブリッドDNA/RNAマイクロアレイの合成に対して、強力で信頼性の高い高密度手法を採用しました。これらは、ハイブリダイゼーションまたは結合アッセイ36のプラットフォームとして機能するだけでなく、複雑な核酸ライブラリーを生成するための迅速かつ安価な方法を表す。DNAベースのデジタルデータストレージの場合、マイクロアレイフォトリソグラフィーは「書き込み」のボトルネック(すなわち、合成による情報の符号化)に対する潜在的な解決策となる可能性があります。DNAおよびde novo遺伝子アセンブリにおけるデジタル符号化の成功は、合成レベルでエラー率に変換する配列忠実度に依存する。現在のアレイ製造プロトコルにおける合成エラーと光学エラーについて、他の場所で議論し、報告します。並行して、製造規模とスループットをさらに向上させる取り組みが進められています。

DNAマイクロアレイの実用化は、従来、2つの細胞集団間の遺伝子発現レベルの変動の研究において行われており、相補的な鎖および蛍光を検出方法1として用いた。時折、DNAマイクロアレイは、タンパク質などの非核酸リガンドとの結合イベントに進出し、結合風景の包括的な概要を提供する系統的配列順列の戦略を用いて、2、3、 4,5.このアプローチは、マイクロアレイを単なるハイブリダイゼーション表面から広範なシーケンスカバレッジを持つプラットフォームに効果的に変換し、RNA構造と機能のより豊かで複雑な世界の研究のための資産となります。非常に効率的なリンアミド結合反応6に支えられ、その中で合成されたDNAアレイは、DNA7の安価な供給源と見なされるようになった。遺伝子組み立て8、9、DNAベースのナノ構造体10、情報保存またはシーケンシング11、12用核酸材料。同様に、シーケンシング技術は、RNAオリゴヌクレオチド13の非常に複雑な混合物を生み出す方法の開発から利益を得る可能性が高い。この文脈では、オリゴヌクレオチドをその場で高密度で合成することを可能にするアレイ製造プロトコルは、核酸バイオテクノロジーの急速に拡大する分野のニーズを満たすために理想的に配置される。しかし、バイオテクノロジーと同じくらい多様な分野を持つ各アプリケーションの目的は、マイクロアレイ上のDNAを高スループットで、または非常に低い量の合成誤差14、15、またはその両方で生成する必要があり、DNAマイクロアレイの合成プロトコルを詳しく見ると、歴史的に、主にハイブリダイゼーションアッセイ用に最適化されています。一方、RNAマイクロアレイのその後の合成では、2'-OH機能の保護群に関連する難しさの大部分を有する困難が見られ、通常は標準的な固相合成においてシリル部分を除去する。フッ素系試薬、ガラスやシリコン表面と互換性のない化学物質。DNAおよびRNAマイクロアレイ合成におけるこれらの問題および課題は、最近、特にフォトリソグラフィーアプローチ16において、大きな研究の対象となっている。
フォトリソグラフィーは、結合前にUV光を使用してオリゴヌクレオチドのブロックを解除し、紫外線暴露のパターンを構築するためにマスクを必要とし、それによってオリゴヌクレオチドの成長を空間的に組織化し、制御する必要があります。物理マスクは、チルトが選択的にマイクロアレイ基板17、18、19に紫外線を反射するコンピュータ制御マイクロミラーに置き換えられました。UV源として、高出力LED源20から365nmの光を使用しています。現在のフォトリソグラフィのセットアップには、1024 × 768 ミラーを含むマイクロミラー アレイが装備されており、わずか 1.4 cm2の小さな領域で 780,000 個を超える個別にアドレス指定可能なスポット ("機能") に対応し、または 19200 の配列を持つ 1080p または>200万ミラー。したがって、デバイス内の各ミラーは、対応する機能で拡大されたシーケンスを直接制御できます。紫外線を除き、フォトリソグラフィーは固相合成技術のような機能を持ち、サイクルベースのリンアミドアミド化学を採用しています。RNA合成を成功させるためには、まったく異なる保護戦略が必要です。我々は、ヒドラジン-不他保護基21を有する光感受性RNAリンアミダントの新シリーズを開発した。これらのモノマーは、表面の完全性に影響を与えない穏やかな条件下でRNAを保護解除することを可能にします。最初の脱保護ステップは、チアノエチルホスホジエステル保護基を除去するためにトリエチルアミンを使用し、ヒドラジンは2'-OHおよびエキソサイクリックアミン機能でそれらを除去するために第2の別々のステップで使用される。そうすることで、RNAオリゴヌクレオチド〜30-ntの長さと任意の配列は、マイクロアレイ22、23上でその中で合成できるようになりました。並行して、我々はまた、最近、DNAとRNAフォトリソグラフィーのスループット、品質、速度の問題に取り組み始めました。全DNA及びRNAアミド(図1)の結合効率を測定し、酸化時間から活性化剤の選択、最適な紫外線曝露まで、オリゴヌクレオチド伸長サイクルにおける個々のステップを調査した24,25.我々は数秒で取り除くことができる新しい光感受性5'保護グループをもたらし、数十万人の100mersの合成を数時間の長いプロセス26に変換した。また、2つの基板を同時に27個公開することで、アレイ製造のスループットを倍増しました。最後に、ライブラリー調製の中心となるDNAおよびRNAオリゴヌクレオチドをクチク、収集、分析する便利な方法として、塩基感受性スクシニル基を含むdTホスホラミダイトを導入した。
DNAおよびRNA固相合成の比較的平凡な側面にもかかわらず、特に核酸化学者にとって、マイクロアレイフォトリソグラフィーは、複雑なセットアップ、プロセスの慎重な制御および監督を必要とする非些細なアップグレードのままであり、オリゴヌクレオチドの性質および適用の種類に応じて、合成後処理のための別々の指示。本稿では、実験設計からデータ解析まで、DNAとRNAマイクロアレイの合成におけるDNAとRNAマイクロアレイの全体のステップバイステップの手順を詳細に提示し、機器の調製に重点を置いて提供したいと考えています。消耗 品。次に、マイクロアレイ製造の目的(すなわち、ハイブリダイゼーションまたは核酸ライブラリーの回収)に対応する合成脱保護法について説明する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:792px;" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Slide functionalization</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetic acid &#62;99.8%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">33209</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">CNC router</td>
			<td style="width:175px;">Stepcraft</td>
			<td style="width:119px;">300 CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">1.07017.2511</td>
			<td>For deprotection and functionalization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide</td>
			<td style="width:175px;">Gelest</td>
			<td style="width:119px;">SIT8189.5</td>
			<td>Silanizing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Nexterion Glass D microscope slides</td>
			<td style="width:175px;">Schott</td>
			<td style="width:119px;">1095568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Polymax 1040</td>
			<td style="width:175px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Proclean 507 Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:175px;">Ulsonix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z860086</td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Microarray synthesis</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.25 M dicyanoimidazole in ACN</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004712402BS</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.7 XGA DMD</td>
			<td style="width:175px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital Micromirror Device</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:332px;">20 mM I2 in pyridine/H2O/THF</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L860020-06</td>
			<td>Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">250 &#956;m thick Chemraz 584 perfluoroelastomer</td>
			<td style="width:175px;">FFKM</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Lower teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2&#39;-O-ALE RNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">365 nm high-power UV-LED</td>
			<td style="width:175px;">Nichia</td>
			<td style="width:119px;">NVSU333A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;BzNPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">Orgentis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;NPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">FlexGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0001205402BS</td>
			<td>For DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amidite Diluent for DNA synthesis</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L010010</td>
			<td>For dissolving phosphoramidites</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Cleavable dT</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Base-sensitive monomer for library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DMSO</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004474701BS</td>
			<td>As exposure solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DNA and RNA microarray deprotection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethylenediamine &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3550</td>
			<td>For deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Expedite 8909</td>
			<td style="width:175px;">PerSeptive Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA synthesizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">225819</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Imidazole</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Industrial Strength lower-density PTFE tape</td>
			<td style="width:175px;">Gasoila</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thin, upper teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Pyridine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P57506</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Triethylamine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0886</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#946;-carotene</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9750</td>
			<td>For library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization and scanning</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">20x Sodium Saline Citrate</td>
			<td style="width:175px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">1054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;Cy3-labelled complementary strand</td>
			<td style="width:175px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For duplex hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">R3961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">EDTA molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">GenePix 4100A</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:175px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:119px;">230500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES monohydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">69889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES sodium</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NaCl &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SecureSeal SA200 hybridization chamber</td>
			<td style="width:175px;">Grace BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">623503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Spectrafuge mini</td>
			<td style="width:175px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">C1301</td>
			<td>Microarray centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tween-20 molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Data extraction</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Excel</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For data extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MatLab</td>
			<td style="width:175px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NimbleScan 2.1</td>
			<td style="width:175px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Desalting and quantification</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Toluene</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">ZipTip C18</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ZTC18s008</td>
			<td>Desalting pipet tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries

フォトリソグラフィーは、リンアミド結合反応の効率とマイクロメートルサイズのミラーから反射される紫外線の精度と密度を組み合わせたため、ガラススライド上のDNAオリゴヌクレオチドを合成するための強力な技術です。フォトリソグラフィーは、わずか数時間で数十万から数百万の異なるDNA配列、100-nt以上に対応できるマイクロアレイを生み出します。この非常に大きな配列空間を用いて、マイクロアレイは、RNAの場合に特に関連する核酸・リガンド相互作用のメカニズムを探索するための理想的なプラットフォームです。我々は最近、その場所のフォトリソグラフィーと互換性のあるRNAリンアミドイトの新しいセットの調製について報告し、その後、RNAオリゴヌクレオチド、ホモポリマー、および混合塩基配列を増成するために使用された。ここでは、実験設計から、インストゥルメンタルセットアップ、アレイ合成、保護解除、最終ハイブリダイゼーションアッセイに向けて、4つの塩基をすべて含むテンプレート25mer配列を例にしたRNAマイクロアレイ製造のプロセスを詳細に説明する。並行して、ハイブリダイゼーションベースの実験を超えて、複雑な核酸ライブラリーへの安価なゲートウェイとしてマイクロアレイフォトリソグラフィーを利用します。そのために、高密度DNAマイクロアレイはベース感受性モノマー上で製造され、合成および保護解除後にDNAを簡単に切断して回収することができます。製造プロトコルは、合成誤差の数を制限するように最適化され、その効果に、β-カロテン溶液の層は、そうでなければ合成基板に反射し得るUV光子を吸収するために導入される。設計から切断および定量化にまで、ライブラリ準備の完全なプロセスを段階的に説明します。

DNAおよびRNAマイクロアレイハイブリダイゼーション 図5は、25mer配列(5'-GTCATCATGAACCACCCTTC-3'DNA形態)のDNAおよびRNAバージョンを含むマイクロアレイ上で行われたハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す。図5Aのスキャンは、Cy3蛍光の励起/発光スペクトルに対応する緑色のフォーマットで現れ、蛍光強度は0〜65536の任意の単位で記録される。アレイの設計は、プロトコルセクションで説明されている25:36の機能レイアウトに従いました。スキャンは、アレイの適切な向きの後に表示され、左上隅には最も長い線維の一覧が設定されます。ここで、fiducial特徴は25merのDNAバージョンを含み、原理的には、スキャンアライメントおよびデータ抽出を行うために常に正の蛍光シグナルを与えるべきである。ハイブリダイズマイクロアレイは均一に明るく見え、合成領域のエッジは通常中心よりも明るく(最大50%明るい)。大量のシーケンスレプリケートは、領域全体にランダムに分散され、空間アーティファクトの影響を軽減します。ここで、各配列(DNAおよびRNA)を2,000のランダムな位置で合成した。一般的に低蛍光ノイズ(背景)、<50 a.u.があり、ハイブリダイゼーションアッセイでは200:1~800:1の順に信号/雑音比が生じる。データ抽出後、蛍光強度が平均化され±SDをプロットします。
実験間の絶対蛍光値には有意な変動があります。ここでは、同じ製造パラメータと同じ合成後処理を用いて、3つの独立した合成の結果を示す。25mer DNAは、相補的なCy3標識DNA鎖にハイブリダイズすると、20,000から30,000の範囲のどこにでも蛍光シグナルを生成します。25mer RNAは、同じCy3標識DNA補体にハイブリダイズすると、15,000から20,000までの対応する特徴に蛍光強度を与えます。しかし、RNA/DNA二重の蛍光強度は、対応するDNA/DNAデュプレックスが20,000-30,000の範囲内で蛍光を続けると、時折8,000を下回ります。このような場合、RNAの結果は最適でないものと見なされる可能性があります。DNAまたはRNAの合成またはハイブリダイゼーションの失敗は、明らかな蛍光の欠如からスキャン中にすぐに顕著になります。RNA合成が失敗するか部分的に成功する機会が複数あり、議論の部分で概説されます。
図書館の保護解除、切断および回復 ライブラリの複雑さと密度に応じて、合成された配列の形状と輪郭は、倍率なしで、適切な照明の下で見ることができます(図4)。EDA/トルエンによる保護解除後、および切除されたライブラリーを収集するために水を添加する前に、現在保護されていないオリゴヌクレオチドを含む合成領域は、ガラススライドの残りの部分が現れるとき、親水性ゾーンとして目立つ場合があります。濁った疎水性層で覆われてる。合成領域の直接観察は、オリゴヌクレオチドの合成に使用される総面積に依存します:合成領域のより大きな使用は、表面上の親水性領域と疎水性領域の明確な区別の大きなチャンスに対応します。逆に、より少ないミラーと小さな機能を使用して合成されたライブラリは、すぐには観察できない場合があります。
同様に、脱塩後に回収されたDNAの量は、合成に使用される総面積に直接比例する。すべての特徴がオリゴヌクレオチド合成に使用される場合、切断および回復手順はDNAの25と30 pmolの間で得るべきである。したがって、合成領域の10%の使用は、DNAの約3pmolのみの余裕があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg"> 図 1.マイクロアレイフォトリソグラフィーによるオリゴヌクレオチド合成に用いられるDNAおよびRNAリンアミドサイトの化学構造。5'-OHにおける標準的なニトロフェニルプロピルキシオキシカルボニル(NPPOC)感光保護基は、ハイブリダイゼーション目的で通常のDNAおよびRNAマイクロアレイ合成に使用されています。複雑なDNAライブラリーの合成では、BzNPPOCがNPPOCの2倍の速さで除去され、マイクロアレイ合成時間が大幅に短縮され、5'-OHでより多くの光ラビアルベンジル-NPPOC(BzNPPOC)が好ましい。ライブラリー用DNAオリゴヌクレオチドはまた、3'末端にクリータブルdTモノマーの結合を必要とする。コクナイルエステル機能を持つこのモノマーは、保護解除中に切り取り、マイクロチップからDNAを採取できるようにします。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg"> 図 2.紫外線露光中にマイクロミラーデバイスに送信される画像ファイルとしてのマスクの例。白いピクセルは、合成セルに紫外線を反射し、「ON」位置に傾くミラーに対応します。黒いピクセルは、UV 光がセルから反射される "OFF" ミラーに対応します。したがって、白いピクセルは、ガラス基板上の対応する特徴で見つかったオリゴヌクレオチド上の次の着信リンオラミダイトの結合を可能にする。対応するミラーがあるフィーチャに合成されたオリゴヌクレオチドは、このマスクファイルでは、次のカップリングイベント中に黒いピクセルが不活性のままです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg"> 図 3.マイクロアレイフォトリソグラフィー光学および合成セットアップの写真.(A) 紫外線露光用光回路。UV-LEDからの紫外線は、まず長方形断面ライトパイプを介して均質化され、マイクロミラーに反射します。「OFF」位置に傾いたマイクロミラーは合成細胞から離れた紫外線を反射しますが、「ON」位置のマイクロミラーは、最初に1:1オフナーリレーを通過することにより、焦点面に位置する合成セルに光を反射します。イメージングシステム。(B)合成細胞は、一旦組み立てられ、細胞の石英ブロック上に最初に配置されたドリルスライドから構成され、厚いPTFEガスケットで区切られた(図示せず)。次に、ドリルされていない2番目のスライドを掘削スライドの上に配置し、薄いPTFEガスケットで区切られています。金属フレーム(図示せず)は、アセンブリを一緒に保持します。(C)ライブラリー調製のために、合成細胞が入ってくる紫外線の焦点面に取り付けられると、クォーツブロックとドリルスライドの間に位置するチャンバは、CH2Cl2におけるβ-カロテンの1%溶液で満たされる。そうするために、追加の入口および出口の管は石英ブロックに付加され、オレンジ色の溶液は右端から左端に流れる。合成のための試薬および溶媒の流れは白い矢印で示される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg"> 図 4.合成領域は通常肉眼で見える。ここでは、DNAライブラリーは、合成直後にガラス表面に見ることができ、DNAはまだ保護された形で見ることができます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg"> 図 5.マイクロアレイ上でその中で合成された25mer DNAおよびRNA配列に対するハイブリダイゼーションアッセイ。 (A) ハイブリダイズDNAおよびRNAマイクロアレイ全体の蛍光スキャン。25mer DNAおよびRNAオリゴヌクレオチドは、Cy3標識された補体鎖にハイブリダイズされる。アレイは5μmの分解能で532nmの励起波長でレーザーでスキャンした。(B) DNA:DNAとRNA:DNA二重の蛍光強度(任意単位)を3つの別々の実験で行う。その現場で合成されたRNAオリゴヌクレオチドに関する薄緑色のデータは、対応するDNA配列の蛍光強度と比較した場合、最適でないと考えることができる。誤差バーはSDです<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg"> 図 6.マイクロアレイ上で合成されたDNAライブラリーの保護解除、切断および回収手順の概略表現。DNA配列は、ベース感受性のdTヌクレオシド(ズーム領域に示す)で成長する。合成後、EDA/トルエンにおけるDNAオリゴヌクレオチドの脱保護(塩基保護基は赤球として表される)は、脱光体物質を静電気的に表面に結合し、少量のペペテットアウトすることができる。合成された領域に水を入れます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg"> 図 7.4,000の異なる配列を含む切り分けされた脱塩DNAライブラリーの代表的な吸光スペクトル(220〜350nm)、長さは100-ntである。合計940ngのDNAを単一のアレイ合成から単一のアレイ合成から単離し、DNA合計の30pmol、またはガラス基板当たり15pmolに相当する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg"> 表 1.対応するリンオラミダイトがポート「A」にロードされたと仮定して、5'-BzNPPOC-dAの結合/酸化/光脱保護のための代表的なサイクルプロトコル。カップリング時間(秒単位)は「カップルモノマー」ラインに表示されます。UV光消光時間は、ここで3J/cm2(BzNPPOC光化学)の放射エネルギーに対応し、2つの「イベント2アウト」通信信号間の経過時間として算出される。
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg"> 表 2.対応するRNAリン化体がポート「A」にロードされたと仮定して、5'-NPPOC-rAの結合/酸化/光脱保護のための代表的なサイクルプロトコル。カップリング時間(秒単位)は「カップルモノマー」ラインに表示されます。UV光消光時間は、ここで6J/cm2(NPPOC光化学)の放射エネルギーに対応し、2つの「イベント2アウト」通信信号間の経過時間として算出される。

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High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

高密度DNAおよびRNAマイクロアレイ - 光リソグラフィー合成、ハイブリダイゼーション、大型核酸ライブラリーの調製

本稿では、その場で作製された核酸マイクロアレイの合成と応用に関する新たな展開について述べた。具体的には、DNA合成のプロトコルをRNAに拡張する方法と、マイクロアレイを用いて検索可能な核酸ライブラリーを作成する方法を示す。

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

DNAとRNAマイクロアレイは、核酸とタンパク質の相互作用を研究するのに非常に有用ですが、配列ライブラリの調製にも便利な方法です。フォトリソグラフィは、数十万のユニークな配列を並列に合成することを可能にし、現在マイクロアレイ上のRNA合成のための唯一の直接的な方法です。マイクロアレイのin in 光リソグラフィー合成は、例えばペプチド核酸の2つの素数フルオロを用いて、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドに拡張することもできる。マイクロアレイの製造と取り扱いのプロセスを見ることは、この複雑な機械がよく知られている標準的な固相DNA合成からどのように開発されたかを理解するのに役立ちます。テキスト プロトコルで説明されているように、マイクロアレイの設計とスライドの機能化からこの手順を開始します。DNAシンセサイザUV LEDとその冷却ファンをオンにします。UV 光の焦点に UV 強度メーターを取り付け、オンにします。コンピュータで、WiCell コントローラ ソフトウェアを起動します。マイクロメアデバイスの電源を入れ、初期化します。DMD を右クリックし、ロード イメージを選択して、すべての白いマスク ファイルを読み込みます。UVS アイコンを右クリックし、[UV シャッターを開く]を選択します。強度計の電源値を読み取り、60 秒をカウントします。60 秒後、電源の値をもう一度読み取り、開始値と終了値をメモします。UVシャッターを閉じると、近くにUVシャッターを選択し、強度計をオフにします。平均 UV 強度値をミリメートルあたり平方メートルのミリワットで計算します。WiCell ソフトウェアで、ジョブ、シーケンス、およびプロトコル ファイルをそれぞれのサブウィンドウに読み込み、[送信] をクリックしてシーケンス ファイルとプロトコル ファイルを DNA シンセサイザに送信します。合成細胞を組み立てるために、細胞の石英ブロック上に厚いパーフルオロエラストマーガスケットを置く。次に、最初のガスケットの上にドリルされた機能的な顕微鏡スライドを置き、スライド上の穴が合成セルの入口と出口チューブと接続することを確認します。2つの穴を囲む、掘削されたスライドの上に2番目の薄いポリテトラフルオロエチレンガスケットを置きます。最後に、2番目のガスケットの上に、機能化された未掘削スライドを2つ目のスライドに置きます。今組み立てられた二重基質セルの上に4スクリューの金属フレームを置くトルクドライバーを使用して同じクランプ力にスクリューを締めます。入口と出口チューブをDNAシンセサイザーに取り付けます。アセトニトリル洗浄ラインをプライムし、基材を通るアセトニトリルの適切な流れを確認します。アセトニトリルプライミングの7サイクルを経た後、廃棄物ラインでアセトニトリルの体積を測定します。このボリュームは2ミリリットルでなければなりません.着信UV光の焦点面に合成セルを取り付けます。ライブラリ調製の場合、余分な入口と出口線を細胞の背面に取り付け、バックチャンバに2ミリリットルのベタカロテン溶液を充填します。最初に WiCell ソフトウェアで実行をクリックして合成を開始します。ジョブファイルの最初の待機コマンドで、DNAシンセサイザーの start を押します。通常のマイクロアレイを合成した後、セルをシンセサイザーから切り離し、セルを分解します。ダイヤモンドペンを使用して、合成番号をガラススライドにエッチングします。各スライドの非合成面に番号をエッチングします。スライドを50ミリリットルの遠心管に移し、さらに使用するまで乾燥した領域に保管します。ライブラリーマイクロアレイの合成後、まずベタカロテン溶液をチャンバーから排出し、次いで、5ミリリットルの塩化メチレンを流してチャンバーを2回洗浄してから水切りします。DNAマイクロアーリー脱保護のために、染色ガラス瓶に20ミリリットルのエタノールと20ミリリットルのEDAを充填します。DNAのみのマイクロアレイを瓶の中に縦に入れ、蓋を閉め、スライドを残して室温で2時間保護を解除します。2時間後、ピンセットを使用してスライドを取り出し、二重蒸留水で十分に洗い流します。スライドを乾燥剤に保存する前に、マイクロアレイ遠心分離機で数秒乾かします。RNAマイクロアレイ脱保護のために、50ミリリットル遠心分離管に20ミリリットルトリエチルアミンと30ミリリットルのアセトニトリルの乾燥溶液を調製する。1つのRNAマイクロアレイスライドを遠心管に移し、蓋を閉じ、プラスチックシールフィルムで包みます。軌道シェーカーの遠心管を室温で1時間30分静かに振ります。次に、スライドを取り外し、20ミリリットルの乾燥アセトニトリルで2回洗浄してから、マイクロアレイ遠心分離機で数秒間乾燥させます。最初の脱保護ステップに続いて、RNAスライドをヒドラジン水和物溶液に移し、蓋を閉じ、プラスチックシールフィルムで包みます。軌道シェーカーで2時間静かに揺れた後、スライドを取り外し、20ミリリットルの乾燥アセトニトリルで2回洗います。その後、マイクロアレイ遠心分離機で数秒間乾燥します。RNAマイクロアレイにもDNAヌクレオチドが含まれている場合は、第3の脱保護工程を進める。1対1のEDAエタノール溶液を含む50ミリリットルチューブにDNA/RNAマイクロアレイを加え、室温で5分後にスライドを取り除き、20ミリリットルの滅菌水でマイクロアレイを2回洗浄します。マイクロアレイ遠心分離機でスライドを乾燥させ、デシケータに保管します。1.5ミリリットルの無菌マイクロ遠心チューブで、テキストプロトコルに記載されているように、Cy3標識DNAを含むハイブリダイゼーションバッファーを調製する。溶液を混ぜて渦を出します。自己接着性300マイクロリットルハイブリタイズチャンバーを、ハイブリダイゼーション液の各スライドおよびピペットの合成領域に慎重に配置します。粘着ドットでチャンバーの穴を覆い、スライド全体をアルミホイルで包みます。マイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションオーブンに入れ、蓋をして、選択したハイブリダイゼーション温度で2時間静かに回転させます。2時間後、スライドを取り外し、アルミホイルを取り出し、ハイブリダイゼーション溶液をピペットアウトし、ハイブリダイゼーションチャンバーを慎重に引き裂きます。30ミリリットルの非ストリンジェントウォッシュバッファーを含む遠心分離管にスライドを移します。室温で2分間激しく振ります。30ミリリットルのストリンジェントウォッシュバッファーを含む遠心分離管にスライドを移し、1分間激しく振ります。最後に、スライドを30ミリリットルの最終洗浄バッファーを含む遠心分離管に移します。数秒間振ります。マイクロアレイ遠心分離機でスライドを乾燥させます。さて、マイクロアレイスキャナーのスライドホルダーに、ドライマイクロアレイ、合成領域を下向きに置きます。DNAライブラリーを脱保護および切断するには、スライドを切断溶液に浸し、50ミリリットルの遠心分離チューブに入れる。チューブを閉じ、プラスチック製のシーリングフィルムで包み、軌道シェーカーで室温で2時間静かに回転させます。2時間後、スライドを取り外し、乾燥したアセトニトリルを20ミリリットルで2回洗ってから空気を乾燥させます。ピペットを使用して、100マイクロリットルの滅菌水を現在識別可能な合成領域に塗布します。1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移す前に、溶液を数回上下にピペトします。プロセスを繰り返し、マイクロアレイ溶出を同じチューブに結合します。チップを蒸発させて乾燥し、ヌクレアーゼを含まないH2Oの10マイクロリットルに再溶解します。ここに示されているのは、25mer配列のDNAおよびRNAバージョンを含むマイクロアレイに対して行われるハイブリダイゼーションアッセイの結果である。スキャンインは、励起に対応するグリーンスケール形式で表示され、Cy3蛍光の発光スペクトルは、任意の単位で記録された蛍光強度を有する。実験の間の絶対蛍光値には有意な変動がある。同じ製造パラメータと同じ合成後処理を使用した3つの独立した合成の結果が示されている。25mer DNAは、その相補的なCy3標識DNA鎖にハイブリダイズすると、20,000から30,000の範囲の蛍光シグナルを生み出します。25mer RNAは、同じCy3標識DNA補体にハイブリダイズした場合、15,000から20,000までの対応する特徴に蛍光強度を与える。しかし、RNA/DNA二重鎖の蛍光強度は、対応するDNA/DNA二重が20,000〜30,000の範囲内で蛍光を発する場合、時折8,000を下回ります。このような場合、RNAの結果は最適ではないとみなすことができます。他のRNAベースの実験と同様に、RNAマイクロアレイは分解に敏感であり、滅菌条件下で処理する必要があることを覚えておくことが重要です。マイクロアレイから収集された核酸ライブラリーは、DNAまたはRNAシーケンシング、およびDNAに関するデジタル情報のコード化に使用できます。NEDは、直接見るべきではない強烈なUV光を生成します。このため、楽器が使用中の間は保護ゴーグルを着用することをお勧めします。

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