Name: high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av den østerrikske Science Fund (FWF tilskudd P23797, P27275 og P30596) og Swiss National Science Foundation (Grant #PBBEP2_146174).

<ol>
	<li>Bumgarner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. 101, 22 (2013).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specificity+and+energy+landscapes+of+DNA-binding+molecules.">Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules.</a> Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).</li><li>Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+sequence+space+of+a+DNA+aptamer+using+microarrays.">Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).</li><li>Franssen-van Hal, N. L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Light-Directed+Synthesis+of+Aptamer+Microarrays.">Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).</li><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Chemistry+.4.+Synthesis+of+Deoxyoligonucleotides+on+a+Polymer+Support.">Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support.</a> Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li><li>Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Assembly+from+Chip-Synthesized+Oligonucleotides.">Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).</li><li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+gene+synthesis+by+selective+amplification+of+DNA+pools+from+high-fidelity+microchips.">Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips.</a> Nature Biotechnology. 28 (12), 1295 (2010).</li><li>Richmond, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+and+assembly+of+chip-eluted+DNA+(AACED):+a+method+for+high-throughput+gene+synthesis.">Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).</li><li>Schmidt, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+amplification+of+strand+subsets+from+chip-synthesized+oligonucleotide+libraries.">Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Chemical+Preservation+of+Digital+Information+on+DNA+in+Silica+with+Error-Correcting+Codes.">Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).</li><li>Erlich, Y., Zielinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Fountain+enables+a+robust+and+efficient+storage+architecture.">DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture.</a> Science. 355 (6328), 950-953 (2017).</li><li>Garalde, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+direct+RNA+sequencing+on+an+array+of+nanopores.">Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.</a> Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).</li><li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+complex+nucleic+acid+libraries+using+highly+parallel+in+situ+oligonucleotide+synthesis.">Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis.</a> Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).</li><li>LeProust, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+high-quality+libraries+of+long+(150mer)+oligonucleotides+by+a+novel+depurination+controlled+process.">Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).</li><li>Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M., Fern&#225;ndez-Lucas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives. , (2018).</li><li>Fodor, S. P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Addressable+Parallel+Chemical+Synthesis.">Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis.</a> Science. 251 (4995), 767-773 (1991).</li><li>Singh-Gasson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maskless+fabrication+of+light-directed+oligonucleotide+microarrays+using+a+digital+micromirror+array.">Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).</li><li>Pease, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Generated+Oligonucleotide+Arrays+for+Rapid+DNA-Sequence+Analysis.">Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).</li><li>Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Power+365+nm+UV+LED+Mercury+Arc+Lamp+Replacement+for+Photochemistry+and+Chemical+Photolithography.">High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography.</a> ACS Sustainable Chemistry &amp; Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).</li><li>Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetal+Levulinyl+Ester+(ALE)+Groups+for+2&#8242;-Hydroxyl+Protection+of+Ribonucleosides+in+the+Synthesis+of+Oligoribonucleotides+on+Glass+and+Microarrays.">Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2&#8242;-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).</li><li>Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+chemical+synthesis+of+rU-DNA+chimeras+on+chips+and+enzymatic+recognition.">In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition.</a> Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).</li><li>Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+RNA+microarrays+synthesized+in+situ+by+photolithography.">High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).</li><li>Agbavwe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency,+Error+and+Yield+in+Light-Directed+Maskless+Synthesis+of+DNA+Microarrays.">Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays.</a> Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).</li><li>Sack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Express+photolithographic+DNA+microarray+synthesis+with+optimized+chemistry+and+high-efficiency+photolabile+groups.">Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).</li><li>Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+o-Nitrobenzyl+Photolabile+Groups+for+Light-Directed+Chemistry+and+Microarray+Synthesis.">Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).</li><li>Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Light-Directed+Synthesis+of+Mirror-Image+Microarrays+in+a+Photochemical+Reaction+Cell+with+Flare+Suppression.">Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression.</a> Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-cleavable+microarrays+for+the+characterization+of+DNA+and+RNA+oligonucleotides+synthesized+in+situ+by+photolithography.">Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography.</a> Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).</li><li>Krotz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+stability+and+degradation+pathway+of+deoxyribonucleoside+phosphoramidites+in+acetonitrile.">Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).</li><li>Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Degradation+of+Dg+Phosphoramidites+in+Solution.">The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).</li><li>McGall, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+light-directed+synthesis+of+DNA+arrays+on+glass+substrates.">The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).</li><li>Collett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+RNA+microarrays+for+high-throughput+screening+of+antiprotein+aptamers.">Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers.</a> Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+RNA-protein+interactions+on+a+massively+parallel+array+reveals+biophysical+and+evolutionary+landscapes.">Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes.</a> Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).</li><li>Wu, C. -. H., Holden, M. T., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Fabrication+of+High-Density+RNA+Arrays.">Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).</li><li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+multiplex+gene+synthesis+from+programmable+DNA+microchips.">Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips.</a> Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+affinity+landscape+of+Thrombin-binding+aptamers+on+2'F-ANA/DNA+chimeric+G-Quadruplex+microarrays.">Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).</li></ol>

Forfatterne bekrefter at de ikke har noen tilknytning til noen for-profit organisasjon.

Solid-fase DNA og RNA syntese er brødet og smør av hver nukleinsyre acid kjemi lab, og selv om tillegg av foto litografi komponenten er riktignok en kompleks operasjon, Microarray fabrikasjon formidlet av UV-lys er også en svært pålitelig prosess . Det er i tillegg den eneste tilgjengelige metoden for in situ RNA syntese på Microarrays. Likevel, som i alle multi-Stage eksperimentell prosedyre, det er god plass for menneskelig feil.
Kanskje den mest kritiske trinnet er koblingen av en phosphoramidite, som det er behov for å være en stadig høy gir kjemisk reaksjon for å ha råd til oligonukleotider med få syntetiske feil. I vår Microarray syntese protokollen, er phosphoramidite kopling enda mer sentral til generell syntese kvalitet siden fabrikasjon prosessen omgår capping og forhindrer oligonukleotid rensing. Trinnvis koblings effektivitet over 99% er beregnet for alle fotosensitive DNA-og RNA-phosphoramidites, selv for svært korte koblingstider (15 s)24 , men lavere koblings kapasitet kan av og til forekomme, spesielt i tilfelle av dG-amidites. Stabiliteten av solubilized phosphoramidites ved romtemperatur har blitt undersøkt før og ble vist å avhenge av arten av nucleobase, med guanosin phosphoramidites utsatt for omfattende degradering i bare et spørsmål om dager29, 30i det. Men da det ble oppbevart ved-25 ° c, ble dG phosphoramidites oppløst i ACN som 30 mM løsning for å være stabile i flere uker. Den relative ustabilitet i dG phosphoramidite løsninger ved romtemperatur betyr imidlertid at de ikke skal holdes festet til DNA-synthesizer i flere dager.
For RNA-phosphoramidites er koplings utbyttet svært avhengig av phosphoramidite kvalitet (som kan vurderes med 31P NMR spektroskopi) og koblingstid. Koblingstider på 5 minutter for rA, rG, rC og 2 min for rU synes nødvendig. Faktisk fant vi ut at forkorte kondens tiden til 2 min for alle RNA phosphoramidites førte til betydelig lavere hybridisering signaler.
Selve DNA-synthesizer, samt reagenser og løsemidler, må absolutt være så rene som mulig for å oppnå høyest utbytte av oligonukleotid syntese. Imidlertid kan uløselig materiale, salter eller partikler, akkumuleres over tid i linjene og slangen i leveringssystemet, noe som fører til en gradvis reduksjon i forbruket av reagenser og reaktantene. Der en generell rengjøring av synthesizer ikke løser et lavt utgangs volum, kan en økning i antall pulser være en alternativ løsning. Spesielt nyttig i tilfelle av lavt phosphoramidite forbruk, kan linjen i koplings protokollen som tilsvarer pumping av en blanding av phosphoramidite og aktivator (tredje linje av koplingen ledd i tabell 1 og tabell 2) være modifisert, fra 6 til 9 pulser uten merkbar negativ effekt på syntese kvalitet. Videre, antall pulser av aktivator som trengs for å bringe amidite/aktivator Mix til syntese substrat (for tiden 6, fjerde linje i koblingen ledd, se tabell 1 og tabell 2) avhenger av DNA synthesizer seg selv så vel som på slange lengden i syntese cellen. Dette tallet kan justeres etter utskifting av phosphoramidite med en farget oppløsning og telling av antall pulser som trengs for å presse den fargede blandingen til glass underlaget for kopling.
Metoden som beskrives her, gjør det mulig for DNA-og RNA-syntese å fortsette samtidig, på samme Microarray. Hybrider av DNA og RNA kan også være forberedt uten noen endring i array fabrikasjon protokoller, og så lenge de tre-trinns deprotection protokollen er fulgt. Det bør imidlertid bemerkes at RNA-bare Microarrays bare krever en to-trinns deprotection: en decyanoethylation først med et3N etterfulgt av hydroksyl og base deprotection med hydrazin. DNA-nucleobases ble funnet å være ufullstendig deprotected under disse forholdene, og trenger ytterligere trinn i EDA for å kunne gjennomføre fullstendig fjerning av phenoxyacetyl (PAC) grupper. Denne ekstra behandlingen med EDA er kortere (5 min) enn for standard deprotection av DNA-Microarrays31, men det er tilstrekkelig å kjøre den til ferdigstillelse etter triethylamine og hydrazin behandlinger. I tillegg begrenser en kort reaksjonstid med EDA eksponeringen av en fullt deprotected RNA-oligonukleotid til grunnleggende forhold.
En fordel med in situ RNA array syntese over alternative metoder som spotting eller DNA transkripsjon32,33,er34 muligheten til å lagre syntetisert RNA microchip i beskyttet form til bruk, og dermed unngå risikoen for potensiell RNA-degradering. Etter syntetiske prosedyrer for RNA betyr derimot at forbruksvarer og reagenser holdes sterile og at håndteringen utføres under RNase-frie forhold. Av notatet, fant vi at tillegg av RNase hemmer til hybridisering Mix ikke gi sterkere hybridisering signaler for RNA funksjoner.
Syntesen av DNA-bibliotekene på en base-følsom monomer er mer kompleks enn syntesen av noen kontroll sekvenser på en overflate, og som sådan er sikkert mer utsatt for design feil. Likevel, forutsatt at sekvensen design (dvs. naturen og antall sekvenser) er riktig, transformere denne listen til en samling av eksponering masker og en organisert serie av kopling sykluser forblir en grei prosess. Imidlertid, betydelig variasjoner fra målestokk Microarray syntese eksisterer og er betenkelig å en heldig fabrikasjon av en høy-tettheten bibliotek oppstille.
Først er en base-følsom dT monomer kombinert som den første phosphoramidite etter syntese av linker. Koblings utbyttet fra denne monomer (figur 1) ble funnet å være relativt lav, rundt 85%28, noe som er grunnen til at arbeidet er gjort for å forbedre sin innlemmelse rate, enten ved å øke konsentrasjonen i ACN fra 30 mm til 50 mm, eller ved å gjenta koplings trinn: to påfølgende koblings reaksjoner ved hjelp av ferske monomerer, eller to separate, men påfølgende koplings sykluser.
Den andre endringen er tilsetning av en β-karoten løsning i bakre kammer av syntese cellen, som beleilig absorberer 365 NM lys. Dette er en viktig modifikasjon av foto litografi oppsett som hindrer UV-lys fra å reflektere tilbake på array underlaget. Faktisk, etter traversering mellomliggende medium mellom underlag, innkommende UV-lys utganger gjennom boret lysbildet og når kvarts blokk av cellen. Den Fresnel ligninger spår at ~ 4% av vinkelrett hendelsen UV-lys vil reflektere fra hver av de tre nedstrøms luft-glass grensesnitt (Exit side av 2nd substrat og begge sider av kvarts blokk) og tilbake på syntese substrat, fører til utilsiktet eksponering av photoprotected oligonukleotider. Diffraksjon og spredning bidrar også til "off-target" photodeprotection og derfor til nukleotid innsetting, som direkte påvirker feilfrekvensen av syntese, men disse bidragene er mye mindre enn refleksjoner og kan i hovedsak bli behandlet av redusere syntese tetthet (forlater gap mellom funksjoner). Vi har funnet at nivået av β-karoten løsning i nedre kammeret av cellen har en tendens til å minske litt bare i løpet av de første minuttene av array syntese, og derfor må overvåkes og justeres.
Til slutt, den tredje endringen er deprotection løsning, erstatter EtOH for toluen, som holder kløyvde DNA biblioteket bundet til overflaten, antagelig gjennom elektrostatisk samhandling. Ved å bruke en liten mengde vann til syntese området etter ACN-vasking, kan biblioteket enkelt samles inn. Prosessen er imidlertid bare vellykket hvis vanninnholdet i EDA og toluen er minimalt, og gjengir nukleinsyre syre helt uløselig i deprotection cocktail. Alternativt kan DNA-bibliotekene være kløyvde av chip ved hjelp av ammoniakk9,10,14,35, deretter ytterligere deprotected ved å varme opp DNA-inneholdende vandig ammoniakk løsning til 55 ° c over natten. Gjenvinning av DNA-bibliotekene ved hjelp av ammoniakk er imidlertid ikke kompatibel med RNA. RNA-oligonukleotider på et base-spaltbare substrat kan eluert fra overflaten ved hjelp av samme EDA/toluen-prosedyre som beskrevet ovenfor, men bare ved den nest siste etappen etter et3N og hydrazin to-trinns deprotection strategi28.
Alternative strategier for å gjenopprette oligonukleotid bassenger fra Microarrays uten behov for en bestemt grunnleggende behandling finnes, er i prinsippet kompatibel med foto litografi og stole på bruk av enzymer. For eksempel kan en enkelt deoxyuracil nukleotid være målet for uracil-DNA-glycosylase (UDG) og excised fra resten av DNA-sekvensen, eller en enkelt RNA-enhet kan gjenkjennes av RNase H type 2-enzymer og phosphodiester Bond 5 ' til RNA-kløyvde , slippe 5 ' DNA del23.
Vi har nå en kraftig, pålitelig og høy tetthet metode for syntese av DNA, RNA, og hybrid DNA/RNA Microarrays. Disse kan ikke bare tjene som plattformer for hybridisering eller bindende analyser36, men de representerer også en rask og rimelig måte å produsere komplekse nukleinsyre acid biblioteker. For DNA-basert digital datalagring, kan Microarray Foto litografi bli en potensiell løsning på "skrive" flaskehalsen (dvs. til koding av informasjon ved syntese). Suksessen i Digital koding på DNA og i de Novo Gene forsamlingen avhenger sekvens troskap som, på syntese nivå, oversettes til feil rate. Syntetiske og optiske feil i våre nåværende array fabrikasjon protokoller vil bli diskutert og rapportert på andre steder. Parallelt er arbeidet nå i gang for ytterligere å øke fabrikasjon skala og gjennomstrømning.

Den praktiske bruken av DNA-Microarrays har tradisjonelt vært i studiet av variasjonene i gen uttrykks nivåene mellom to celle populasjoner, ved hjelp av komplementære tråder og fluorescens som deteksjons metode1. Av og til DNA Microarrays venture i bindende hendelser med ikke-nukleinsyre acid ligander, slik som proteiner, med en strategi for systematisk sekvens permutasjon som gir en omfattende oversikt over bindings landskapet2,3, 4,5. Denne tilnærmingen forvandler effektivt Microarrays fra bare hybridisering overflater til plattformer med bred sekvensdekning, noe som ville være et aktivum for studiet av den rikere og mer komplekse verden av RNA struktur og funksjon. Støttet av ekstremt effektiv phosphoramidite kopling reaksjon6, in SITU syntetisert DNA arrays kan nå også betraktes som en billig kilde til DNA7, som blir spesielt relevant med tanke på stadig økende etterspørsel etter nukleinsyre yre materiale for gen montering8,9, DNA-basert nanostrukturer10, informasjonslagring eller sekvensering11,12. På samme måte vil sekvensering teknologier trolig dra nytte av utviklingen av metoder som gir svært komplekse blandinger av RNA oligonukleotider13. I denne konteksten, array fabrikasjon protokoller som gjør det mulig for oligonukleotider å bli syntetisert in situ og ved høy tetthet er ideelt plassert for å møte behovene til den raskt voksende feltet av nukleinsyre acid bioteknologi. Men med et felt så forskjellige som bioteknologi, kan formålet med hvert program kreve at DNA på Microarray produseres enten ved høy gjennomstrømming eller med en svært lav mengde syntetiske feil14,15, eller begge, som krever en nærmere titt på syntese protokoller av DNA Microarrays som historisk har vært primært optimalisert for hybridisering analyser. I mellomtiden, in situ syntese av RNA Microarrays har blitt funnet å være en utfordrende forsøke, med de fleste av vanskelighetene forbundet med å beskytte gruppen for 2 '-OH funksjon, vanligvis en silyl moiety i standard solid-fase syntese som er fjernet med fluor reagenser, kjemikalier som ikke er kompatible med glass eller silisium overflater. De spørsmål og utfordringer i DNA og RNA Microarray syntese har i det siste vært gjenstand for en stor kropp av arbeid, særlig med foto litografi tilnærming16.
Foto litografi bruker UV-lys for å oppheve oligonukleotider før kopling og krever masker for å konstruere et mønster av UV-eksponering, og dermed romlig organisering og kontrollere veksten av oligonukleotider. Fysiske masker har blitt erstattet av datastyrte micromirrors hvis vippe selektivt reflekterer UV lys på Microarray underlaget17,18,19. Som en UV-kilde, bruker vi 365 NM lys fra en høyeffekts LED-kilde20. Nåværende photolithographic oppsett er utstyrt med Micromirror Device arrays inneholder 1024 × 768 speil, tilsvarende mer enn 780 000 individuelt adresserbart flekker ("funksjoner") på et lite område på bare 1,4 cm2, eller 1080p med matriser av 1920 × 1080, eller > 2 millioner speil. Hver av speilene i enheten har derfor direkte kontroll over sekvensen vokst på tilsvarende funksjon. Med unntak av UV-lys, foto litografi funksjoner som en solid fase syntese teknikk og vedtar syklus BAS ert phosphoramidite kjemi. Bare det krever en helt annen beskyttelses strategi for RNA-syntese for å lykkes. Vi utviklet en ny serie med lysfølsomme RNA-phosphoramidites som lager hydrazin-labilt som beskytter grupper21. Disse monomerer gjør det mulig for RNA-er å bli deprotected under milde forhold som ikke påvirker integriteten til overflaten. Et første deprotection trinn bruker triethylamine til å fjerne cyanoethyl phosphodiester beskytte grupper, mens hydrazin brukes i et sekund, separate trinn for å fjerne dem på 2 '-OH og exocyclic Amin funksjoner. Dermed kan RNA oligonukleotider ~ 30-NT i lengde og en hvilken som helst sekvens nå bli syntetisert in situ på Microarrays22,23. Parallelt, vi har også nylig begynt å ta opp spørsmål om gjennomstrømning, kvalitet og hastighet i DNA og RNA Foto litografi. Vi målte koblings effektiviteten > 99% for alle DNA-og RNA-amidites (figur 1) og undersøkte hvert enkelt trinn i oligonukleotid forlengelse syklus, fra oksidasjons tid, til valg av Aktivator og til optimal UV-eksponering24 , 25. we har brakt inn nye lysfølsomme 5 ' beskytte grupper som kan fjernes i løpet av sekunder, transformere syntesen av hundretusenvis av 100mers i et par timer lang prosess26. Vi har også doblet gjennomstrømningen av array fabrikasjon ved å utsette to underlag samtidig27. Til slutt har vi innført en dT phosphoramidite som inneholder en base-sensitiv succinyl gruppe som en praktisk måte å holde, samle og analysere DNA og RNA oligonukleotider, som er sentralt i biblioteks forberedelser28.
Til tross for den relativt kjedelige aspektet av DNA og RNA solid-fase syntese, spesielt for nukleinsyre yre kjemikere, Microarray Foto litografi fortsatt en ikke-triviell oppgradering krever et komplekst oppsett, nøye kontroll og tilsyn med prosessen, og separate instruksjoner for post-syntetisk håndtering avhengig av arten av oligonukleotid og type søknad. I denne artikkelen ønsker vi å gi en detaljert presentasjon av hele steg-for-steg prosedyre av in situ syntese av DNA og RNA Microarrays av foto litografi, fra eksperimentell design til dataanalyse, med vekt på utarbeidelse av instrumenter og forbruksvarer. Deretter beskriver vi de post-syntetiske deprotection metodene som samsvarer med det tiltenkte formålet med Microarray fabrikasjon (dvs. enten hybridisering eller utvinning av nukleinsyre syre biblioteker).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:792px;" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Slide functionalization</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetic acid &#62;99.8%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">33209</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">CNC router</td>
			<td style="width:175px;">Stepcraft</td>
			<td style="width:119px;">300 CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">1.07017.2511</td>
			<td>For deprotection and functionalization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide</td>
			<td style="width:175px;">Gelest</td>
			<td style="width:119px;">SIT8189.5</td>
			<td>Silanizing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Nexterion Glass D microscope slides</td>
			<td style="width:175px;">Schott</td>
			<td style="width:119px;">1095568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Polymax 1040</td>
			<td style="width:175px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Proclean 507 Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:175px;">Ulsonix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z860086</td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Microarray synthesis</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.25 M dicyanoimidazole in ACN</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004712402BS</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.7 XGA DMD</td>
			<td style="width:175px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital Micromirror Device</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:332px;">20 mM I2 in pyridine/H2O/THF</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L860020-06</td>
			<td>Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">250 &#956;m thick Chemraz 584 perfluoroelastomer</td>
			<td style="width:175px;">FFKM</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Lower teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2&#39;-O-ALE RNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">365 nm high-power UV-LED</td>
			<td style="width:175px;">Nichia</td>
			<td style="width:119px;">NVSU333A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;BzNPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">Orgentis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;NPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">FlexGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0001205402BS</td>
			<td>For DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amidite Diluent for DNA synthesis</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L010010</td>
			<td>For dissolving phosphoramidites</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Cleavable dT</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Base-sensitive monomer for library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DMSO</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004474701BS</td>
			<td>As exposure solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DNA and RNA microarray deprotection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethylenediamine &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3550</td>
			<td>For deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Expedite 8909</td>
			<td style="width:175px;">PerSeptive Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA synthesizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">225819</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Imidazole</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Industrial Strength lower-density PTFE tape</td>
			<td style="width:175px;">Gasoila</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thin, upper teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Pyridine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P57506</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Triethylamine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0886</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#946;-carotene</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9750</td>
			<td>For library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization and scanning</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">20x Sodium Saline Citrate</td>
			<td style="width:175px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">1054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;Cy3-labelled complementary strand</td>
			<td style="width:175px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For duplex hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">R3961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">EDTA molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">GenePix 4100A</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:175px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:119px;">230500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES monohydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">69889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES sodium</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NaCl &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SecureSeal SA200 hybridization chamber</td>
			<td style="width:175px;">Grace BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">623503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Spectrafuge mini</td>
			<td style="width:175px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">C1301</td>
			<td>Microarray centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tween-20 molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Data extraction</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Excel</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For data extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MatLab</td>
			<td style="width:175px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NimbleScan 2.1</td>
			<td style="width:175px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Desalting and quantification</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Toluene</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">ZipTip C18</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ZTC18s008</td>
			<td>Desalting pipet tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries

Foto litografi er en kraftig teknikk for syntese av DNA-oligonukleotider på glass sklier, da den kombinerer effektiviteten til phosphoramidite koplings reaksjoner med presisjonen og tettheten av UV-lys som reflekteres fra mikrometer speil. Foto litografi gir Microarrays som kan romme fra hundretusener opp til flere millioner forskjellige DNA-sekvenser, 100-NT eller lengre, på bare noen få timer. Med denne svært store sekvensen plass, Microarrays er ideelle plattformer for å utforske mekanismer for nukleinsyre acid · ligand interaksjoner, som er spesielt relevant i tilfelle av RNA. Vi har nylig rapportert om utarbeidelse av et nytt sett med RNA-phosphoramidites som er kompatible med in situ Foto litografi og som senere ble brukt til å dyrke RNA-oligonukleotider, homopolymers samt blandede base sekvenser. Her illustrerer vi i detalj prosessen med RNA Microarray fabrikasjon, fra eksperimentell design, til instrumental oppsett, array syntese, deprotection og endelig hybridisering analysen ved hjelp av en mal 25mer sekvens som inneholder alle fire baser som et eksempel. Parallelt går vi utover hybridisering eksperimenter og utnytter Microarray Foto litografi som en billig gateway til komplekse nukleinsyre acid biblioteker. For å gjøre dette, er høy tetthet DNA Microarrays fabrikkert på en base-sensitive monomer som gjør at DNA å være beleilig kløyvde og hentes etter syntese og deprotection. Den fabrikasjon protokollen er optimalisert for å begrense antall syntetiske feil og at effekten, et lag av β-karoten løsning er innført for å absorbere UV fotoner som kan ellers reflektere tilbake på syntese underlag. Vi beskriver i en trinnvis måte den komplette prosessen med biblioteks forberedelser, fra design til kløft og kvantifisering.

DNA og RNA Microarray hybridisering Figur 5 viser resultatene av en hybridisering analysen utført på en Microarray som inneholder DNA og RNA versjoner av en 25mer sekvens (5 '-GTCATCATCATGAACCACCCTGGTC-3 ' i DNA form). Skanningen i figur 5a vises i et greenscale format som tilsvarer eksitasjon/utslipps spekteret til Cy3 fluorescens, med fluorescens intensitet innspilt i vilkårlige enheter mellom 0 og 65536. Array-designen fulgte oppsettet av 25:36-funksjonen som er beskrevet i protokoll delen. Skanningen vises etter riktig orientering av matrisen, med øvre venstre hjørne befolket med den lengste kjeden av fiducial funksjoner. Her, fiducial funksjoner inneholder DNA-versjon av 25mer og bør i prinsippet alltid gi et positivt fluorescens signal for å utføre skanning justering og data utvinning. Den hybridisert Microarray skal fremstå jevnt lys, med kantene av syntese området er imidlertid vanligvis lysere enn sentrum (opptil 50% lysere). Den store mengden sekvens replikerer, tilfeldig fordelt over hele området, reduserer virkningen av romlige gjenstander. Her ble hver sekvens (DNA og RNA) syntetisert på 2 000 tilfeldige steder. Det er vanligvis lav fluorescens støy (bakgrunn), < 50 a.u., noe som fører til et signal/støy-forhold i størrelsesorden 200:1 til 800:1 i hybridisering analyser. Etter uttrekking av data er fluorescens intensitet i gjennomsnitt og plottet ± SD.
Det er betydelig variasjon i absolutte fluorescens verdier mellom eksperimenter. Her viser vi resultatene for tre uavhengige synteser som bruker de samme produksjonsparametrene og den samme post-syntetiske håndteringen. Den 25mer DNA, når hybridisert til sin komplementære Cy3-merket DNA strand, vil gi fluorescens signaler som spenner alt fra 20 000 til 30 000, svært sjelden over eller under. 25mer RNA, når den hybridisert til samme Cy3-merket DNA-komplement, vil gi fluorescens intensitet på de tilsvarende funksjonene som spenner fra 15 000 til 20 000. Imidlertid vil fluorescens intensitet av RNA/DNA-duplexes av og til falle under 8 000, når tilsvarende DNA/DNA-duplexes fortsatt vil fluorescerer innenfor 20000-30000-serien. I slike tilfeller kan resultatene for RNA betraktes som sub-optimale. En syntese eller hybridisering svikt, enten for DNA eller RNA, vil være umiddelbart merkbar under skanning fra den åpenbare mangelen på fluorescens. Det er flere muligheter for RNA-syntese til enten mislykkes eller delvis lykkes, og de vil bli skissert i diskusjonen delen.
Bibliotek deprotection, kløft og utvinning Avhengig av kompleksiteten og tettheten av biblioteket, form og omrisset av syntetisert Array kan sees uten forstørrelse, men under riktig belysning (Figur 4), med DNA fortsatt i beskyttet form. Etter deprotection med EDA/toluen, og før tilsetning av vann for å samle inn kløyvde biblioteket, kan syntese området som inneholder den nå deprotected oligonukleotider skiller seg ut som en hydrofile sone, når resten av glasset lysbildet vises dekket med et grumsete hydrofobe lag. Den direkte observasjon av syntese området avhenger av det totale arealet som brukes til å syntetisere oligonukleotider: større bruk av syntese området vil tilsvare en større sjanse for klart skille mellom hydrofile og hydrofobe regioner på overflaten. I motsatt fall kan bibliotekene syntetisert med færre speil og med mindre funksjoner ikke umiddelbart Observer.
Tilsvarende mengden gjenvunnet DNA etter avsaltingsspisser overlegne sammenlignet er direkte proporsjonal med det totale arealet som brukes for syntese. Hvis alle funksjoner brukes for oligonukleotid syntese, bør kløften og utvinning prosedyren gir mellom 25 og 30 pmol av DNA. En 10% bruk av syntese området vil derfor ha råd til bare rundt 3 pmol av DNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg"> Figur 1 . Kjemiske strukturer av DNA og RNA phosphoramidites brukes i oligonukleotid syntese ved Microarray Foto litografi. Standard nitrophenylpropyloxycarbonyl (NPPOC) fotosensitive beskytte grupper ved 5 '-OH brukes i vanlig DNA og RNA Microarray syntese for hybridisering formål. For syntese av komplekse DNA-biblioteker, jo mer photolabile benzylalkohol-NPPOC (BzNPPOC) foretrekkes på 5 '-OH, som BzNPPOC er fjernet dobbelt så fort som NPPOC, som i betydelig grad reduserer total Microarray syntese tid. DNA oligonukleotider for bibliotekene krever også kobling av en spaltbare dT monomer på 3 ' end. Denne monomer, hvilke bærer en succinyl Ester funksjonen, ville være kløyvde i løpet av deprotection, tillater for det DNA å bli avhentet fra det microchip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg"> Figur 2 . Eksempel på en maske som en bildefil som sendes til den Micromirror Device enheten under UV-eksponering. De hvite pikslene tilsvarer speil som vil bli vippet i "på" posisjon, noe som reflekterer UV-lys på syntese cellen. Svarte piksler tilsvarer "av" speil, der UV-lyset vil bli reflektert vekk fra cellen. Hvite piksler vil derfor tillate kobling av neste innkommende phosphoramidite på oligonukleotider som finnes på de tilsvarende funksjonene på glass underlag. Oligonukleotider syntetisert på funksjoner som tilsvarende speil er, i denne masken filen, svarte piksler vil imidlertid forbli inert under neste kopling hendelsen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg"> Figur 3 . Fotografier av Microarray Foto litografi optisk og syntese oppsett. (A) optisk KRETS for UV-eksponering. UV-lys fra UV-LED er først homogenisert gjennom en rektangulær-tverrsnitt lysrør deretter reflekterer over micromirrors. Micromirrors som har blitt vippet inn i en "OFF" posisjon vil reflektere UV-lys bort fra syntese cellen, men Micromirrors i "ON" posisjon vil reflektere lys på syntese cellen, som ligger på fokalplanet, ved først å passere gjennom en 1:1 Offner Relay bilde systemet. (B) syntese cellen, en gang montert, består av en boret lysbilde plasseres først på kvarts blokk av cellen, atskilt av en tykk PTFE pakning (ikke vist). Et annet, ikke-boret lysbilde er deretter plassert over boret lysbildet, adskilt av en tynn PTFE pakning. En metallramme (ikke vist) holder forsamlingen sammen. (C). for bibliotek forberedelse, når syntesen cellen er festet på fokalplanet av innkommende UV-lys, kammeret ligger mellom kvarts blokken og boret lysbildet er fylt med en 1% løsning av β-KAROTEN i ch2CL2. For å gjøre dette, en ekstra innløps-og utløps slange er festet til kvarts blokken og den oransje løsningen renner fra høyre til venstre posisjon. Flyten av reagenser og løsemidler for syntesen er vist i hvite piler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg"> Figur 4 . Syntese området er vanligvis synlig for det blotte øye. Her kan et DNA-bibliotek sees på glassflaten rett etter syntese, med DNA fortsatt i beskyttet form. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg"> Figur 5 . Hybridisering analyser til 25mer DNA og RNA sekvenser syntetisert in situ på Microarrays. (A) fluorescens skanning av hele hybridisert DNA og RNA Microarray. 25mer DNA-og RNA-oligonukleotider er hybridisert til deres Cy3-merkede komplementære tråder. Matrisen ble skannet med en laser på en 532 nm eksitasjon bølgelengde, ved 5 μm oppløsning. (B) fluorescens intensitet (vilkårlige enheter) av DNA: DNA og RNA: DNA-duplexes i tre separate eksperimenter. De lys grønne dataene for in situ syntetisert RNA-oligonukleotider kan betraktes som suboptimal, sammenlignet med den fluorescens intensiteten til de tilsvarende DNA-sekvensene. Feilfelt er SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg"> Figur 6 . Skjematisk fremstilling av deprotection, kløft og gjenvinnings prosedyre for DNA-bibliotekene syntetisert på Microarrays. DNA-sekvenser dyrkes på en base-følsom Spaltbare dt nukleosid (vist i zoomet området). Etter syntese er deprotection av DNA-oligonukleotider (base beskytte grupper representert som røde sfærer) i EDA/toluen etterlater deprotected materialet elektrostatisk bundet til overflaten og kan deretter Pipet tert ut ved å påføre en liten mengde vann på syntetisert området. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg"> Figur 7 . Representative absorbansen spektrum (220-350 Nm) av en kløyvde, avsalte DNA bibliotek som inneholder 4 000 forskjellige sekvenser, 100-NT i lengde. Totalt 940 ng av DNA ble isolert fra en enkelt array syntese, tilsvarende 30 pmol av DNA totalt, eller 15 pmol per glass substrat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg"> Tabell 1. Representativ syklus protokoll for kopling/oksidasjon/photodeprotection av 5 '-BzNPPOC-da, forutsatt at tilsvarende phosphoramidite ble lastet på port "A". Koplings tiden (i sekunder) vises på "par monomer"-linjen. UV photodeprotection tid, her tilsvarer en strålende energi av 3 J/cm2 (BzNPPOC fotokjemi), beregnes som tiden gått mellom de to "Event 2 ut" kommunikasjons signaler.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg"> Tabell 2. Representativ syklus protokoll for kopling/oksidasjon/photodeprotection av 5 '-NPPOC-rA, forutsatt at den KORRESPONDERENDE RNA-phosphoramidite ble lastet på port "A". Koplings tiden (i sekunder) vises på "par monomer"-linjen. UV photodeprotection tiden, her tilsvarer en strålende energi av 6 J/cm2 (NPPOC fotokjemi), beregnes som tiden gått mellom de to "Event 2 ut" kommunikasjons signaler.

Watch this Scientific Journal Video about High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries at JoVE.com

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Høy tetthet DNA og RNA Microarrays-Photolithographic syntese, hybridisering og utarbeidelse av store nukleinsyre acid Libraries

I denne artikkelen presenterer vi og diskutere nye utbygginger i syntese og anvendelser av nukleinsyre acid Microarrays fabrikkert in situ. Nærmere bestemt viser vi hvordan protokollene for DNA-syntese kan utvides til RNA og hvordan Microarrays kan brukes til å lage hentes nukleinsyre yre biblioteker.

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

DNA og RNA mikroarrayer er svært nyttige for å studere samspillet mellom nukleinsyrer og proteiner, men de er også en praktisk metode for fremstilling av sekvensbiblioteker. Fotolitografi gjør det mulig for hundretusenvis av unike sekvenser å bli syntetisert parallelt og er for tiden den eneste direkte metoden for RNA-syntese på mikroarrayer. In situ fotolittografisk syntese av mikroarrayer kan også utvides til kjemisk modifiserte oligonukleotider, for eksempel med to førsteklasses fluor av peptid nukleinsyrer.Å se prosessen med mikroarray fabrikasjon og håndtering kan bidra til å forstå hvordan dette komplekse maskineriet ble utviklet fra den velkjente standard solid fase DNA-syntese. Start denne prosedyren med mikroarray design og lysbildefunksjonalisering som beskrevet i tekstprotokollen. Slå på DNA-synthesizeren UV LED og kjøleviften.Fest en UV-intensitetsmåler på fokuspunktet for innkommende UV-lys og slå den på. Start WiCell Controller-programvaren på datamaskinen. Slå på og initialiser mikromerenheten.Last inn en helt hvit maskefil ved å høyreklikke på DMD og deretter velge lastbilde. Høyreklikk på UVS-ikonet og velg UV-lukkeren åpen. Les effektverdien på intensitetsmåleren og tell 60 sekunder.Etter 60 sekunder leser du strømverdien på nytt og noterer deg start- og sluttverdiene. Lukk lukkeren ved å velge UV-lukkeren lukkes og slå av intensitetsmåleren. Beregn den gjennomsnittlige UV-intensitetsverdien i milliwatt per centimeter kvadrat.I WiCell-programvaren laster du inn jobb-, sekvens- og protokollfilene i de respektive undervinduene, og deretter klikker du send for å sende sekvens- og protokollfilene til DNA-synthesizeren. For å montere syntesecellen plasserer du en tykk perfluoroelastomerpakning på cellens kvartsblokk. Plasser deretter et boret, funksjonalisert mikroskopsklie oppå den første pakningen, og kontroller at hullene på lysbildene kobles til innløps- og utløpsslangen til syntesecellen.Plasser en annen, tynn polytetrafluoretylenpakning over det borede lysbildet, rundt de to hullene. Til slutt plasserer du et sekund, funksjonalisert, men uboret lysbilde på toppen av den andre pakningen. Plasser nå en 4-skrue metallramme på toppen av den monterte dobbeltunderlaget cellen Stram skruen til samme klemmekraft ved hjelp av en momentskrutrekker.Fest innløps- og utløpsslangen til DNA-synthesizeren. Prime acetonitril vaskelinjen og verifisere riktig flyt av acetonitril gjennom substrater. Mål volumet av acetonitril på avfallslinjen etter å ha gått gjennom syv sykluser med acetonitril grunning.Dette volumet skal være to milliliter. Fest syntesecellen ved fokalplanet for innkommende UV-lys. Ved bibliotekforberedelse, fest en ekstra innløps- og utløpslinje på baksiden av cellen og fyll bakkammeret med de to milliliter av betakarotens løsning.Start syntesen ved først å klikke på Kjør i WiCell-programvaren. Ved første ventetidskommando i jobbfilen trykker du på start på DNA-synthesizeren. Etter syntese av vanlige mikroarrayer, koble cellen fra synthesizeren og demontere cellen.Bruk en diamantpenn til å etse syntesenummeret på glasslysbildene. Etse nummeret på det ikke-syntetiserte ansiktet til hvert lysbilde. Overfør lysbildene til 50 milliliter sentrifugerør og oppbevar i et uttørket område til videre bruk.Etter syntesen av bibliotekmikroarrayer, tøm først betakarotenoppløsningen ut av kammeret og vask deretter kammeret to ganger ved å flyte fem milliliter metylenklorid gjennom før drenering. For DNA mikroarry deprotection, fyll en glassglasskrukke med 20 milliliter etanol og 20 milliliter EDA. Plasser mikroarrayene kun for DNA vertikalt i kannen, lukk lokket og la lysbildene debeskytte i to timer ved romtemperatur.Etter to timer, hent lysbildene ved hjelp av pinsett og skyll dem grundig med dobbeltdestillert vann. Tørk lysbildene i en mikroarray sentrifuge i noen sekunder før du lagrer dem i en desiccator. For RNA microarray deprotection, forberede en tørr løsning på 20 milliliter trietyamin og 30 milliliter acetonitril i en 50 milliliter sentrifuge rør.Overfør en RNA mikroarray lysbilde inn i sentrifuge røret, lukk lokket og pakk med plast tetting film. Rist sentrifugerøret forsiktig på en orbital shaker i en time og 30 minutter ved romtemperatur. Deretter fjerner du lysbildet og vasker to ganger med 20 milliliter tørr acetonitril før du tørker i en mikroarray sentrifuge i noen sekunder.Etter det første deprotection trinnet overføre RNA lysbildet inn i hydrazin hydrat løsning, lukk lokket og pakk med plast tetting film. Etter to timer med forsiktig risting på en orbital shaker, fjern lysbildet og vask det to ganger med 20 milliliter tørr acetonitril. Tørk deretter i en mikroarray sentrifuge i noen sekunder.Hvis RNA-mikroarrayet også inneholder DNA-nukleotider, fortsett med et tredje deprotection-trinn. Tilsett DNA/RNA-mikroarrayet i et 50 milliliter rør som inneholder en eda-etanolløsning Etter 5 min ved romtemperatur, fjern lysbildet og vask mikroarrayet to ganger med 20 milliliter sterilt vann. Tørk lysbildet i en mikroarray sentrifuge og lagre i en desiccator.I et 1,5 milliliter sterilt mikrocentrifugerør, klargjør hybridiseringsbufferen som inneholder Cy3-merket DNA, som beskrevet i tekstprotokollen. Bland og virvle oppløsningen. Plasser forsiktig et selvklebende 300 mikroliter hybridiseringskammer over synteseområdet på hvert lysbilde og pipet i hybridiseringsløsningen.Dekk hullene i kammeret med selvklebende prikker og pakk hele lysbildet i aluminiumsfolie. Plasser mikroarraysklie i hybridiseringsovnen, dekk og la den rotere forsiktig ved den valgte hybridiseringstemperaturen i to timer. Etter to timer, ta av lysbildet, fjern aluminiumsfolie, pipette ut hybridiseringsløsningen, og forsiktig rive av hybridiseringskammeret.Overfør lysbildene til et sentrifugerør som inneholder 30 milliliter ikke-strenge vaskebuffer. Rist kraftig i to minutter ved romtemperatur. Overfør lysbildet til et sentrifugerør som inneholder 30 milliliter streng vaskebuffer og rist kraftig i ett minutt.Til slutt overfører du lysbildet til et sentrifugerør som inneholder 30 milliliter med endelig vaskebuffer. Rist i noen sekunder. Tørk lysbildet i en mikroarray sentrifuge.Plasser nå det tørre mikroarrayet, synteseområdet vendt ned, i glideholderen på mikroarrayskanneren. For å debeskytte og holde DNA-biblioteker, dypp lysbildet inn i spaltingsløsningen, i et 50 milliliter sentrifugerør. Lukk røret og pakk med plastforseglingsfilm, før du forsiktig roterer i en orbital shaker i to timer ved romtemperatur.Etter to timer, fjern lysbildet og vask to ganger med 20 milliliter omhyggelig tørr acetonitril før du lar det lufttørke. Med en pipette, påfør 100 mikroliter sterilt vann over det nå merkbare synteseområdet. Rør oppløsningen opp og ned et par ganger før du overfører den til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Gjenta prosessen og kombiner mikroarray eluate i samme rør. Fordamp brikken eluate til tørrhet og deretter redissolve i 10 mikroliter kjerner-fri H2O. Vist her er resultatene av en hybridisering analyse utført på en mikroarray som inneholder DNA og RNA versjoner av en 25mer sekvens.Skanningen i vises i et grønt format som tilsvarer eksitasjon, utslipp spekteret av Cy3 fluorescens, med fluorescens intensitet registrert i vilkårlige enheter. Det er betydelig variasjon i absolutte fluorescensverdier mellom eksperimenter. Resultatene for tre uavhengige synteser ved hjelp av de samme fabrikasjonsparametrene og den samme postsyntetiske håndteringen vises.Den 25mer DNA, når hybridisert til sin komplementære Cy3-merket DNA-tråd, vil gi fluorescens signaler som spenner fra 20,000 til 30, 000, svært sjelden over eller under. 25mer RNA, når hybridisert til samme Cy3-merket DNA komplement, vil gi fluorescens intensiteter på tilsvarende funksjoner fra 15,000 til 20, 000. Imidlertid vil fluorescensintensiteten til RNA / DNA-dupleksene av og til falle under 8 000, når de tilsvarende DNA / DNA-dupleksene fortsatt vil fluorisere innenfor 20.000 til 30.000-området.I slike tilfeller kan resultatene for RNA betraktes som sub-optimale. Som med alle andre RNA-baserte eksperimenter er det viktig å huske at RNA mikroarrayer er følsomme for nedbrytning, og bør håndteres under sterile forhold. Nukleinsyre biblioteker samlet inn fra mikroarrays kan brukes i DNA eller RNA sekvensering samt i koding av digital informasjon om DNA.NED produserer et intenst UV-lys som ikke bør ses direkte på. På grunn av dette anbefales det å bruke vernebriller mens instrumentet er i bruk.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetikken for lagging-kjedet DNA Synthesis<em&gt; In Vitro</em&gt; Av bakteriofag T7 Replication Proteiner

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering av DNA forurensning i RNA eksempler basert på Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generasjon av innfødte Chromatin Immunoprecipitation sekvensering biblioteker til Nucleosome tetthet analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

En universell protokoll for store gRNA biblioteket produksjon fra en DNA-kilde

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse i sanntid av transkripsjon faktor bindende, transkripsjon, oversettelse og omsetning vise globale hendelser under aktivering

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Undersøkelse av RNA syntese med 5-Bromouridine merking og Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv MicroRNA sekvensering: Komplementære DNA biblioteket forberedelse protokollen bruker Formalin-fast parafin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjelden hendelse gjenkjenning feil-korrigert DNA og RNA sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...