Name: high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries at JoVE.com

Эта работа была поддержана Австрийским научным фондом (FWF гранты P23797, P27275 и P30596) и Швейцарский национальный научный фонд (Грант #PBBEP2_146174).

<ol>
	<li>Bumgarner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. 101, 22 (2013).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specificity+and+energy+landscapes+of+DNA-binding+molecules.">Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules.</a> Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).</li><li>Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+sequence+space+of+a+DNA+aptamer+using+microarrays.">Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).</li><li>Franssen-van Hal, N. L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Light-Directed+Synthesis+of+Aptamer+Microarrays.">Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).</li><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Chemistry+.4.+Synthesis+of+Deoxyoligonucleotides+on+a+Polymer+Support.">Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support.</a> Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li><li>Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Assembly+from+Chip-Synthesized+Oligonucleotides.">Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).</li><li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+gene+synthesis+by+selective+amplification+of+DNA+pools+from+high-fidelity+microchips.">Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips.</a> Nature Biotechnology. 28 (12), 1295 (2010).</li><li>Richmond, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+and+assembly+of+chip-eluted+DNA+(AACED):+a+method+for+high-throughput+gene+synthesis.">Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).</li><li>Schmidt, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+amplification+of+strand+subsets+from+chip-synthesized+oligonucleotide+libraries.">Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Chemical+Preservation+of+Digital+Information+on+DNA+in+Silica+with+Error-Correcting+Codes.">Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).</li><li>Erlich, Y., Zielinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Fountain+enables+a+robust+and+efficient+storage+architecture.">DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture.</a> Science. 355 (6328), 950-953 (2017).</li><li>Garalde, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+direct+RNA+sequencing+on+an+array+of+nanopores.">Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.</a> Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).</li><li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+complex+nucleic+acid+libraries+using+highly+parallel+in+situ+oligonucleotide+synthesis.">Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis.</a> Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).</li><li>LeProust, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+high-quality+libraries+of+long+(150mer)+oligonucleotides+by+a+novel+depurination+controlled+process.">Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).</li><li>Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M., Fern&#225;ndez-Lucas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives. , (2018).</li><li>Fodor, S. P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Addressable+Parallel+Chemical+Synthesis.">Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis.</a> Science. 251 (4995), 767-773 (1991).</li><li>Singh-Gasson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maskless+fabrication+of+light-directed+oligonucleotide+microarrays+using+a+digital+micromirror+array.">Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).</li><li>Pease, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Generated+Oligonucleotide+Arrays+for+Rapid+DNA-Sequence+Analysis.">Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).</li><li>Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Power+365+nm+UV+LED+Mercury+Arc+Lamp+Replacement+for+Photochemistry+and+Chemical+Photolithography.">High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography.</a> ACS Sustainable Chemistry &amp; Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).</li><li>Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetal+Levulinyl+Ester+(ALE)+Groups+for+2&#8242;-Hydroxyl+Protection+of+Ribonucleosides+in+the+Synthesis+of+Oligoribonucleotides+on+Glass+and+Microarrays.">Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2&#8242;-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).</li><li>Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+chemical+synthesis+of+rU-DNA+chimeras+on+chips+and+enzymatic+recognition.">In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition.</a> Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).</li><li>Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+RNA+microarrays+synthesized+in+situ+by+photolithography.">High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).</li><li>Agbavwe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency,+Error+and+Yield+in+Light-Directed+Maskless+Synthesis+of+DNA+Microarrays.">Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays.</a> Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).</li><li>Sack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Express+photolithographic+DNA+microarray+synthesis+with+optimized+chemistry+and+high-efficiency+photolabile+groups.">Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).</li><li>Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+o-Nitrobenzyl+Photolabile+Groups+for+Light-Directed+Chemistry+and+Microarray+Synthesis.">Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).</li><li>Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Light-Directed+Synthesis+of+Mirror-Image+Microarrays+in+a+Photochemical+Reaction+Cell+with+Flare+Suppression.">Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression.</a> Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-cleavable+microarrays+for+the+characterization+of+DNA+and+RNA+oligonucleotides+synthesized+in+situ+by+photolithography.">Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography.</a> Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).</li><li>Krotz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+stability+and+degradation+pathway+of+deoxyribonucleoside+phosphoramidites+in+acetonitrile.">Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).</li><li>Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Degradation+of+Dg+Phosphoramidites+in+Solution.">The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).</li><li>McGall, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+light-directed+synthesis+of+DNA+arrays+on+glass+substrates.">The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).</li><li>Collett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+RNA+microarrays+for+high-throughput+screening+of+antiprotein+aptamers.">Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers.</a> Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+RNA-protein+interactions+on+a+massively+parallel+array+reveals+biophysical+and+evolutionary+landscapes.">Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes.</a> Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).</li><li>Wu, C. -. H., Holden, M. T., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Fabrication+of+High-Density+RNA+Arrays.">Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).</li><li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+multiplex+gene+synthesis+from+programmable+DNA+microchips.">Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips.</a> Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+affinity+landscape+of+Thrombin-binding+aptamers+on+2'F-ANA/DNA+chimeric+G-Quadruplex+microarrays.">Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).</li></ol>

Авторы удостоверяют, что они не имеют никакого отношения к какой-либо некоммерческой организации.

Синтез твердой фазы ДНК и РНК является хлебом и маслом каждой лаборатории химии нуклеиновой кислоты, и, хотя добавление компонента фотолитографии, по общему признанию, является сложной операцией, изготовление микроаррей, опосредованного ультрафиолетовым светом, также является очень надежным процессом . Кроме того, это единственный доступный метод синтеза РНК на микроаррей. Тем не менее, как и в любой многоступенчатой экспериментальной процедуры, есть достаточно места для человеческой ошибки.
Возможно, самым важным шагом является соединение фосфорамидита, так как это должна быть постоянно высокоурожайная химическая реакция, чтобы позволить себе олигонуклеотиды с несколькими синтетическими ошибками. В нашем протоколе синтеза микроаррей, соединение фосфорамидита является еще более важным для общего качества синтеза, так как процесс изготовления обходит укупорки и предотвращает очистку олигонуклеотидов. Пошаговая эффективность соединения выше 99% были рассчитаны для всех фоточувствительных ДНК и РНК фосфорамититов, даже для очень коротких сроков соединения (15 с)24, но более низкие выходы соединения иногда может произойти, особенно в случае dG амидитов. Стабильность растворимых фосфорамидных фосфорамититов при комнатной температуре была исследована ранее и было показано, зависит от природы нуклеобазы, с гуанозина фосфорамидитов склонны к обширной деградации только в течение нескольких дней29, 30. Но при хранении при -25 градусов по Цельсию, гГ фосфорамиды растворяются в ACN как раствор 30 мМ были признаны стабильными в течение нескольких недель. Относительная нестабильность растворов фосфорамидита гГ при комнатной температуре означает, что они не должны быть прикреплены к синтезатору ДНК в течение нескольких дней.
Для РНК фосфорамидитов выход соединения очень зависит от качества фосфорамидита (которое может быть оценено 31P Спектроскопией ЯМР) и времени соединения. Время соединения 5 минут для rA, rG, rC и 2 мин для rU появляются необходимые. Действительно, мы обнаружили, что сокращение времени конденсации до 2 мин для всех ФОсфорамититОВ РНК привело к значительно более низким сигналам гибридизации.
Сам синтезатор ДНК, а также реагенты и растворители, безусловно, должны быть максимально чистыми, чтобы достичь наивысшего выхода синтеза олигонуклеотидов. Однако нерастворимый материал, соли или частицы могут со временем накапливаться в линиях и трубах системы доставки, что приводит к постепенному снижению потребления реагентов и реагентов. В тех случаях, когда общая очистка синтезатора не решает проблему низкого объема производства, альтернативное решение может быть увеличением количества импульсов. Особенно полезно в случае низкого потребления фосфорамидита, линия в протоколе соединения, соответствующая накачке смеси фосфорамидита и активатора (третья линия сцепления в таблице 1 и таблице2) может быть модифицированные, от 6 до 9 импульсов без заметного негативного влияния на качество синтеза. Кроме того, количество импульсов активатора, необходимого для приведения смеси амидитов/активатора в синтез субстрата (в настоящее время 6, четвертая строка в подразделе соединения, см. Таблица 1 и Таблица2) зависит от самого синтезатора ДНК, а также от длина труб в клетке синтеза. Это число может быть скорректировано после замены фосфорамидита с цветным раствором и подсчета количества импульсов, необходимых для нажатия цветной смеси на стеклянный субстрат для соединения.
Описанный в этом методе позволяет синтезу ДНК и РНК действовать одновременно, на одном и том же микроаррее. Гибриды ДНК и РНК также могут быть подготовлены без каких-либо изменений в протоколах изготовления массива, и до тех пор, пока соблюдается трехступенчатый протокол дезащиты. Тем не менее, следует отметить, что РНК-только microarrays требует только двухступенчатой дезащиты: decyanoethylation сначала с Et3N следуют гидроксила и базы дезащиты с гидразином. Нуклеобазы ДНК были признаны неполно дебошенными в этих условиях, и нуждаются в дополнительном шаге в EDA для того, чтобы осуществить полное удаление групп феноксиацетила (Pac). Это дополнительное лечение с EDA короче (5 мин), чем для стандартной дезащиты ДНК microarrays31, но достаточно, чтобы вести его к завершению после лечения триэтиламин и гидразин. Кроме того, короткое время реакции с EDA ограничивает воздействие полностью дезащищенных РНК олигонуклеотида к основным условиям.
Преимущество милитинического синтеза РНК-массива in situ по сравнению с альтернативными методами, такими как выявление пятен или транскрипция ДНК32,33,34, является возможность хранить синтезированный микрочип РНК в защищенной форме до использования, тем самым избегая риск потенциальной деградации РНК. Постсинтетические процедуры ДЛЯ РНК, с другой стороны, означает, что расходные материалы и реагенты хранятся стерильными и что обработка осуществляется в условиях, свободных от РНЗа. Примечательно, что добавление ингибитора RNase в смесь гибридизации не давало более сильных сигналов гибридизации для особенностей РНК.
Синтез библиотек ДНК на базовом мономере более сложен, чем синтез нескольких контрольных последовательностей на поверхности, и как таковой, безусловно, более подвержен ошибкам проектирования. Тем не менее, если предположить, что дизайн последовательности (т.е. характер и количество последовательностей) является правильным, преобразование этого списка в коллекцию маски экспозиции и упорядоченной серии циклов соединения остается простым процессом. Однако существуют важные вариации от стандартного синтеза микроэлементов, которые имеют решающее значение для успешного изготовления массива библиотек высокой плотности.
Во-первых, базовый чувствительный мономер dT в сочетании с первым фосфорамидитом после синтеза связующим. Соединение выход этого мономера(Рисунок 1) было установлено, что относительно низким, около 85%28, поэтому усилия предпринимаются для улучшения его регистрации, либо за счет увеличения его концентрации в ACN от 30 мМ до 50 мм, или путем повторения соединение шаг: два последовательных реакции соединения с использованием свежих мономеров, или два отдельных, но последовательных циклов соединения.
Второе изменение – это добавление раствора к-каротина в задней камере синтеза, который удобно поглощает 365 нм света. Это важная модификация настройки фотолитографии, поскольку она предотвращает отражание ультрафиолетового света обратно на подстрат массива. Действительно, после прохождения интерстициальной среды между субстратами, входящие УЛЬТРАВ-свет выходит через просверленную горку и достигает кварцевого блока ячейки. Уравнения Френеля предсказывают, что 4% уф-излучения, перпендикулярно инцидента, будет отражаться от каждого из трех интерфейсов воздухостекла вниз по течению (выходная сторона2-го субстрата и обе стороны кварцевого блока) и обратно на субстрат синтеза, приводит к непреднамеренному облучению фотозащищенных олигонуклеотидов. Дифракция и рассеяние также способствуют "вне цели" фотодезащиты и, следовательно, нуклеотидва вставки, которая непосредственно влияет на уровень ошибок синтеза, но эти вклады гораздо меньше, чем отражения и могут быть в основном рассмотрены снижение плотности синтеза (оставляя зазоры между объектами). Мы обнаружили, что уровень раствора к-каротина в нижней камере клетки имеет тенденцию к незначительному снижению только в первые минуты синтеза массива, и поэтому его необходимо контролировать и корректировать.
Наконец, третье изменение является решением дезащиты, заменяя EtOH на толуол, который держит расщепленную библиотеку ДНК привязанной к поверхности, предположительно через электростатические взаимодействия. Применение небольшого количества воды в области синтеза после мытья ACN позволяет удобно собирать библиотеку. Процесс, однако, только успешным, если содержание воды в EDA и толуол является минимальным, что делает нуклеиновой кислоты полностью нерастворимым в дезащитном коктейле. Кроме того, библиотеки ДНК могут быть расщеплены чип с помощью аммиака9,10,14,35, а затем дальнейшее дезащищены путем нагрева ДНК-содержащих вакарастворительный раствор аммиака до 55 градусов по Цельсию в одночасье. Восстановление библиотек ДНК с использованием аммиака, однако, не совместимо с РНК. Олигонуклеотиды РНК на базовом склеобляемом субстрате можно утилизировать с поверхности с помощью той же описанной выше процедуры EDA/толуена, но только на предпоследнем этапе после стратегии et3N и гидразина двухступенчатой дезащиты28.
Альтернативные стратегии по извлечению олигонуклеотидных бассейнов из микроаррей без необходимости проведения специального базового лечения существуют, в принципе совместимы с фотолитографией и опираются на использование ферментов. Например, один нуклеотид дезоксиурацила может быть мишенью урацил-ДНК гликозилазы (UDG) и вырезаны из остальной последовательности ДНК, или один блок РНК может быть признан RNase H типа 2 ферментов и фосфодидер облигаций 5' к РНК расщепления , выпуская 5' ДНК часть23.
Теперь у нас есть мощный, надежный и высокой плотности метод для синтеза ДНК, РНК, и гибридных ДНК / РНК microarrays. Они могут не только служить платформами для гибридизации или связывания анализы36, но они также представляют собой быстрый и недорогой способ производства сложных библиотек нуклеиновой кислоты. Для хранения цифровых данных на основе ДНК фотолитография микроаррей может стать потенциальным решением для «письменного» узкого места (т.е. для кодирования информации путем синтеза). Успех цифрового кодирования ДНК и сборки генов de novo зависит от точности последовательности, которая на уровне синтеза приводит к частоте ошибок. Синтетические и оптические ошибки в наших текущих протоколах изготовления массива будут обсуждаться и сообщаться в другом месте. Параллельно с этим предпринимаются усилия по дальнейшему увеличению масштабов и пропускной возможности производства.

Практическое использование микроаррей ДНК традиционно было в изучении вариаций в уровнях экспрессии генов между двумя популяциями клеток, используя дополнительные нити и флуоресценцию в качестве метода обнаружения1. Иногда, ДНК microarrays предприятие в связывание событий с ненуклеиновой кислоты лиганды, такие как белки, со стратегией систематической перестановки последовательности, которая предлагает всеобъемлющий обзор связывания пейзаж2,3, 4,5. Этот подход эффективно преобразует микроаррей из простой поверхности гибридизации в платформы с широким охватом последовательности, что было бы активом для изучения более богатого и более сложного мира структуры и функции РНК. При поддержке чрезвычайно эффективной реакции соединения фосфорамидита6, на месте синтезированных массивов ДНК теперь также можно рассматривать как дешевый источник ДНК7, который становится особенно актуальным, учитывая постоянно растущий спрос на нуклеиновой кислоты материал для сборки генов8,9, ДНК наноструктур10, хранение информации или секвенирования11,12. Аналогичным образом, технологии секвенирования, вероятно, выиграют от разработки методов, которые дают очень сложные смеси олигонуклеотидов РНК13. В этом контексте протоколы изготовления массивов, позволяющие синтезировать олигонуклеотиды на месте и при высокой плотности, идеально подходят для удовлетворения потребностей быстро расширяющейся области биотехнологии нуклеиновой кислоты. Однако, с полем, как разнообразны, как биотехнология, цель каждого приложения может потребовать, чтобы ДНК на microarray быть произведены либо на высокой пропускной их или с очень низким количеством синтетических ошибок14,15, или оба, требующие пристальный взгляд на протоколы синтеза микроаррей ДНК, которые исторически были в первую очередь оптимизированы для анализа гибридизации. Между тем, на месте синтез РНК microarrays было установлено, что сложные усилия, с большинством трудностей, связанных с защитой группы для 2'-OH функции, как правило, силило moiety в стандартной твердой фазы синтеза, который удаляется с реагенты на основе фтора, химические вещества, несовместимые со стеклянными или кремниевыми поверхностями. Эти вопросы и проблемы в СИНТЕЗе ДНК и РНК микроаррей в последнее время были предметом большого количества работы, в частности, с фотолитографии подход16.
Фотолитография использует ультрафиолетовый свет для разблокирования олигонуклеотидов перед соединением и требует маски, чтобы построить шаблон УФ-облучения, тем самым пространственно организации и контроля роста олигонуклеотидов. Физические маски были заменены управляемыми компьютером микрозеркалами, наклон евразийцев избирательно отражает ультрафиолетовый свет на микроаррей17,18,19. В качестве УФ-источника мы используем 365 нм света от источника светодиодов высокой мощности20. Текущие фотолитографические установки оснащены микрозеркальными массивами, содержащими зеркала 1024 и 768, что соответствует более чем 780 000 индивидуально адресных точек ("функций") на небольшой площади всего 1,4 см2, или 1080p с массивами 1920 и 1080, или 2 миллиона зеркал. Поэтому каждое из зеркал в устройстве имеет прямой контроль над последовательностью, выращенной на соответствующей функции. За исключением ультрафиолетового света, фотолитография функционирует как метод синтеза твердой фазы и принимает циклна на основе химии фосфорамидита. Только для этого требуется совершенно другая стратегия защиты синтеза РНК. Мы разработали новую серию светочувствительных РНК фосфорамиды подшипников гидразина-лабиля защиты групп21. Эти мономеры позволяют РНК быть дезащищены в умеренных условиях, которые не влияют на целостность поверхности. Первый шаг дезащиты использует триэтиламин для удаления цианоэтил фосфодиера защиты групп, в то время как гидразин используется во втором, отдельный шаг, чтобы удалить те, на 2'-OH и exocyclic амина функций. При этом, РНК олигонуклеотиды 30-nt в длину и любой последовательности теперь могут быть синтезированы на месте на microarrays22,23. Параллельно мы также недавно приступили к решению вопросов пропускной перечни, качества и скорости в ДНК и фотолитографии РНК. Мы измерили эффективность соединения ,gt;99% для всех ДНК и РНК-амидитов(Рисунок 1) и исследовали каждый отдельный шаг в цикле удлинения олигонуклеотида, от времени окисления, до выбора активатора и оптимального УФ-облучения24 , 25. Мы ввели в новых светочувствительных 5 'защиты групп, которые могут быть удалены в считанные секунды только, превращая синтез сотен тысяч 100mers в несколько часов-долго процесса26. Мы также удвоили пропускную стоимость изготовления массива, подвергая два субстрата одновременно27. Наконец, мы ввели dT фосфорамидита, содержащего базы чувствительных сукцинил группы в качестве удобного способа расщеплять, собирать и анализировать ДНК и РНК олигонуклеотидов, который имеет центральное значение для подготовки библиотеки28.
Несмотря на относительно обыденный аспект синтеза ТВЕРДОй фазы ДНК и РНК, особенно для химиков нуклеиновой кислоты, фотолитография микроаррей остается нетривиальной апгрейдом, требующим сложной установки, тщательного контроля и надзора за процессом, и отдельные инструкции по постсинтетической обработке в зависимости от характера олигонуклеотида и типа применения. В этой статье мы хотели бы представить подробную презентацию всей поэтапной процедуры синтеза ДНК и РНК-микроаррей с помощью фотолитографии, от экспериментального проектирования до анализа данных, с акцентом на подготовку приборов и Расходные материалы. Затем мы описываем постсинтетические методы дезащиты, которые соответствуют предназначению производства микроаррей (т.е. либо гибридизации, либо восстановлению библиотек нуклеиновой кислоты).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:792px;" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Slide functionalization</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetic acid &#62;99.8%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">33209</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">CNC router</td>
			<td style="width:175px;">Stepcraft</td>
			<td style="width:119px;">300 CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">1.07017.2511</td>
			<td>For deprotection and functionalization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide</td>
			<td style="width:175px;">Gelest</td>
			<td style="width:119px;">SIT8189.5</td>
			<td>Silanizing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Nexterion Glass D microscope slides</td>
			<td style="width:175px;">Schott</td>
			<td style="width:119px;">1095568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Polymax 1040</td>
			<td style="width:175px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Proclean 507 Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:175px;">Ulsonix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z860086</td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Microarray synthesis</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.25 M dicyanoimidazole in ACN</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004712402BS</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.7 XGA DMD</td>
			<td style="width:175px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital Micromirror Device</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:332px;">20 mM I2 in pyridine/H2O/THF</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L860020-06</td>
			<td>Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">250 &#956;m thick Chemraz 584 perfluoroelastomer</td>
			<td style="width:175px;">FFKM</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Lower teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2&#39;-O-ALE RNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">365 nm high-power UV-LED</td>
			<td style="width:175px;">Nichia</td>
			<td style="width:119px;">NVSU333A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;BzNPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">Orgentis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;NPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">FlexGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0001205402BS</td>
			<td>For DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amidite Diluent for DNA synthesis</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L010010</td>
			<td>For dissolving phosphoramidites</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Cleavable dT</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Base-sensitive monomer for library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DMSO</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004474701BS</td>
			<td>As exposure solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DNA and RNA microarray deprotection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethylenediamine &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3550</td>
			<td>For deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Expedite 8909</td>
			<td style="width:175px;">PerSeptive Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA synthesizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">225819</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Imidazole</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Industrial Strength lower-density PTFE tape</td>
			<td style="width:175px;">Gasoila</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thin, upper teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Pyridine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P57506</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Triethylamine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0886</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#946;-carotene</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9750</td>
			<td>For library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization and scanning</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">20x Sodium Saline Citrate</td>
			<td style="width:175px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">1054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;Cy3-labelled complementary strand</td>
			<td style="width:175px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For duplex hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">R3961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">EDTA molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">GenePix 4100A</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:175px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:119px;">230500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES monohydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">69889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES sodium</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NaCl &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SecureSeal SA200 hybridization chamber</td>
			<td style="width:175px;">Grace BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">623503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Spectrafuge mini</td>
			<td style="width:175px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">C1301</td>
			<td>Microarray centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tween-20 molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Data extraction</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Excel</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For data extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MatLab</td>
			<td style="width:175px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NimbleScan 2.1</td>
			<td style="width:175px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Desalting and quantification</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Toluene</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">ZipTip C18</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ZTC18s008</td>
			<td>Desalting pipet tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries

Фотолитография является мощным методом синтеза олигонуклеотидов ДНК на стеклянных слайдах, так как она сочетает в себе эффективность реакций фосфорамидита с точностью и плотностью уф-излучения, отраженного от зеркал размером с микрометр. Фотолитография дает микроаррей, которые могут вместить от сотен тысяч до нескольких миллионов различных последовательностей ДНК, 100-nt или дольше, всего за несколько часов. С этим очень большим пространством последовательности, microarrays являются идеальными платформами для изучения механизмов нуклеиновой кислоты, которые особенно актуальны в случае РНК. Недавно мы сообщили о подготовке нового набора РНК фосфорамидитов совместимы с на месте фотолитографии и которые впоследствии были использованы для выращивания РНК олигонуклеотидов, гомополимеров, а также смешанных баз последовательностей. Здесь мы подробно иллюстрируем процесс изготовления РНК-микроаррей, от экспериментального дизайна до инструментальной установки, синтеза массивов, дезащиты и окончательного проверки гибридизации с использованием последовательности шаблона 25mer, содержащей все четыре базы в качестве примера. Параллельно мы выходим за рамки экспериментов на основе гибридизации и используем фотолитографию микроаррей как недорогой шлюз для сложных библиотек нуклеиновой кислоты. Для этого микроаррей ДНК высокой плотности изготавливаются на базовом мономере, который позволяет удобно расщепляться и извлекать ДНК после синтеза и дезащиты. Протокол изготовления оптимизирован таким образом, чтобы ограничить количество синтетических ошибок, и с этой стороны, слой раствора к-каротина вводится для поглощения ультрафиолетовых фотонов, которые в противном случае могут отражать обратно на субстраты синтеза. Мы описываем пошагово полный процесс подготовки библиотеки, от проектирования до расщепления и количественной оценки.

Watch this Scientific Journal Video about High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries at JoVE.com

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Микроары ДНК и РНК с высокой плотностью - фотолитографический синтез, гибридизация и подготовка больших нуклеиновой кислоты

В этой статье мы представляем и обсуждаем новые разработки в синтезе и применении микроаррей нуклеиновой кислоты, изготовленных на месте. В частности, мы показываем, как протоколы синтеза ДНК могут быть распространены на РНК и как микроаррей могут быть использованы для создания библиотек для извлечения нуклеиновой кислоты.

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Микроаррей ДНК и РНК очень полезны для изучения взаимодействия нуклеиновых кислот и белков, но они также являются удобным методом для подготовки библиотек последовательности. Фотолитография позволяет синтезировать сотни тысяч уникальных последовательностей параллельно и в настоящее время является единственным прямым методом синтеза РНК на микроарреях. Фотолитографический синтез микроаррей на месте также может быть распространен на химически модифицированные олигонуклеотиды, например, с двумя главными флюоро пептидных нуклеиновых кислот.Видя процесс изготовления микроаррей и обработки может помочь понять, как этот сложный механизм был разработан из хорошо известного стандартного синтеза твердой фазы ДНК. Начните эту процедуру с микроаррейного дизайна и функционализации слайдов, как описано в текстовом протоколе. Включите синтезатор ДНК УФ-светодиод и его охлаждающий вентилятор.Прикрепите УФ-измеритель интенсивности в координационном центре входящего УФ-излучения и включите его. На компьютере запустите программное обеспечение WiCell Controller. Включите и инициализируйте микромерное устройство.Загрузите файл белой маски, нажав правой кнопкой DMD, а затем выбрав изображение нагрузки. Нажмите правой кнопкой мыши на значок UVS и выберите уф-затвор открытым. Прочитайте значение мощности на измеритель интенсивности и подсчитайте 60 секунд.Через 60 секунд прочитайте значение мощности снова и обратите внимание на начало и конечные значения. Закройте затвор, выбрав УФ затвор близко и выключите счетчик интенсивности. Рассчитайте среднее значение интенсивности УФ-излучения в милливаттах на сантиметр квадрата.В программном обеспечении WiCell загрузите файлы задания, последовательности и протокола в соответствующих подок окнах, а затем нажмите кнопку отправки последовательности и протокольных файлов на синтезатор ДНК. Для сборки синтеза клетки поместите толстую прокладку перфтороэластомера на кварцевый блок клетки. Затем поместите просверленный, функциональный слайд микроскопа поверх первой прокладки, и убедитесь, что отверстия на слайдах соединяются с водой и розеткой трубки клетки синтеза.Поместите вторую тонкую полиэтиленовую прокладку на пробуреную горку, окружающую два отверстия. Наконец, поместите второй, функциональный, но undrilled слайд на вершине второй прокладки. Теперь поместите 4-винтовой металлический каркас на верхней части собранной двойной субстратной ячейки Затяните винт к той же силе зажима с помощью отвертки крутящего момента.Прикрепите вход и розетку к синтезатору ДНК. Премьер ацетонитрил мыть линии и проверить надлежащий поток ацетонитрила через субстраты. Измерьте объем ацетонитрила на линии отходов после семи циклов грунтовки ацетонитрила.Этот объем должен быть два миллилитров. Прикрепите ячейку синтеза к фокусной плоскости поступающего УФ-излучения. В случае подготовки библиотеки, приложите дополнительный вход и розетку линии к задней части клетки и заполнить заднюю камеру с двумя миллилитров бетакаротина решения.Начните синтез, сначала нажав на Run в программном обеспечении WiCell. При первом ожидании команды в файле задания нажмите на синтезатор ДНК. После синтеза регулярных микроаррей, отсоедините клетку от синтезатора и разберите клетку.Используйте бриллиантовую ручку, чтобы вытравить номер синтеза на стеклянных слайдах. Вытравьте число на не синтезированном лице каждого слайда. Перенесите слайды в 50 миллилитровых центрифуг и храните в высушенной области до дальнейшего использования.После синтеза библиотеки microarrays, сначала слейте бетакаротин раствор из камеры затем мыть камеру в два раза, протекая пять миллилитров хлорида метилена через перед сливом. Для депротекторной депротекторной ДНК наполните окрашивание стеклянной банки 20 миллилитров этанола и 20 миллилитров ЭДА. Поместите микроаррей только для ДНК вертикально в банку, закройте крышку и оставьте слайды для депротекирования в течение двух часов при комнатной температуре.Через два часа, получить слайды с помощью пинцета и промыть их тщательно с двойной дистиллированной водой. Высушите горки в центрифуге микроармей в течение нескольких секунд, прежде чем хранить их в децикаторе. Для депротекторции РНК-микроаррея приготовьте сухой раствор из 20 миллилитров триэтиламина и 30 миллилитров ацетонитриля в 50-миллилитровой центрифуге.Перенесите одну РНК-микроарейную горку в центрифугу, закройте крышку и оберните пластиковой уплотнительной пленкой. Аккуратно встряхните центрифугу трубку на орбитальном шейкере в течение одного часа и 30 минут при комнатной температуре. Затем снимите слайд и мыть дважды с 20 миллилитров сухого ацетонитрила перед сушкой в центрифуге микроаррей в течение нескольких секунд.После первого шага депротекторной передачи РНК слайд в гидратный раствор гидрата, закройте крышку и оберните пластиковой уплотнительной пленкой. После двух часов нежно тряски на орбитальном шейкере, удалить слайд и мыть его дважды с 20 миллилитров сухого ацетонитрила. Затем высушите в микроаррей центрифуге в течение нескольких секунд.Если РНК-микроаррей также содержит нуклеотиды ДНК, проступить третий шаг депротекторной. Добавить ДНК / РНК microarray в 50 миллилитров трубки, содержащей один к одному EDA-этанол раствор После 5 минут при комнатной температуре, удалить слайд, и мыть микроаррай в два раза с 20 миллилитров стерильной воды. Высушите горку в центрифуге микроаррей и храните в децикаторе.В 1,5 миллилитровой стерильной микроцентрифуге трубки, подготовить буфер гибридизации, содержащий Cy3 помечены ДНК, как описано в текстовом протоколе. Смешайте и вихрем раствор. Тщательно поместите самоклеясь 300 микролитровую камеру гибридизации над областью синтеза на каждом слайде и пипетке в растворе гибридизации.Обложка отверстия камеры с клеевыми точками и оберните весь слайд в алюминиевой фольге. Поместите микроаррей слайд в духовку гибридизации, накройте крышкой и дайте ему мягко вращаться при выбранной температуре гибридизации в течение двух часов. Через два часа отсоедините горку, удалите алюминиевую фольгу, вывечьте раствор гибридизации и аккуратно оторвите камеру гибридизации.Перенесите слайды в центрифугу, содержащую 30 миллилитров не-stringent Wash Buffer. Встряхните энергично в течение двух минут при комнатной температуре. Перенесите слайд в центрифугу, содержащую 30 миллилитров строгого буфера для мытья, и встряхните энергично в течение одной минуты.Наконец, перенесите слайд в центрифугу, содержащую 30 миллилитров final Wash Buffer. Встряхните в течение нескольких секунд. Высушите горку в центрифуге микроаррей.Теперь поместите сухой микроаррей, область синтеза лицом вниз, в держатель слайда микроаррей сканера. Чтобы депротекировать и расщеплять библиотеки ДНК, погрузите слайд в раствор расщепления в 50-миллилитровую центрифугу. Закройте трубку и оберните пластиковой уплотнительной пленкой, прежде чем аккуратно вращаться в орбитальном шейкере в течение двух часов при комнатной температуре.Через два часа, удалить слайд и мыть дважды с 20 миллилитров скрупулезно сухой ацетонитрил, прежде чем дать ему высохнуть. С помощью пипетки нанесите 100 микролитров стерильной воды на теперь различимую область синтеза. Труба раствор вверх и вниз несколько раз, прежде чем передать его в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки.Повторите процесс и объединить microarray eluate в той же трубке. Испарите чип eluate до сухости, а затем переочистить в 10 микролитров нуклеазы свободных H2O. Здесь показаны результаты анализа гибридизации, выполненной на микроаррее, содержащем ДНК и РНК-версии последовательности 25mer.Сканирование в появляется в зеленом формате, соответствующем возбуждению, спектр выбросов флуоресценции Cy3, с интенсивностью флуоресценции, зарегистрированной в произвольных единицах. Между экспериментами существует значительная изменчивость абсолютных значений флуоресценции. Показаны результаты трех независимых синтезов с использованием одинаковых параметров изготовления и одной и той же пост-синтетической обработки.25mer ДНК, когда гибридизированы в дополнение к его дополнительной Cy3 помечены нити ДНК, даст флуоресценции сигналов, начиная от 20000 до 30000, очень редко выше или ниже. 25mer РНК, когда гибридизируется в том же Cy3 помечены ДНК дополнение, даст флуоресценции интенсивности на соответствующие функции, начиная от 15000 до 20000. Однако интенсивность флуоресценции дуплексов РНК/ДНК иногда опускается ниже 8000, когда соответствующие дуплексы ДНК/ДНК будут по-прежнему флуоресцией в пределах диапазона от 20 000 до 30 000.В таких случаях результаты ДЛЯ РНК можно считать неоптимальными. Как и в случае с любым другим экспериментом на основе РНК, важно помнить, что РНК-микроаррей чувствительны к деградации и должны обрабатываться в стерильных условиях. Библиотеки нуклеиновой кислоты, собранные из микроаррей, могут быть использованы в секвенировании ДНК или РНК, а также в кодировании цифровой информации о ДНК.NED производит интенсивный ультрафиолетовый свет, который не следует непосредственно рассматривать. Из-за этого рекомендуется носить защитные очки во время использования инструмента.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Кинетика синтеза Отставание-нити ДНК<em&gt; In Vitro</em&gt; С помощью бактериофага Т7 белков репликации

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Оценка загрязнения ДНК в образцах РНК, основанный на рибосомной ДНК

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Поколения родной Chromatin иммунопреципитации секвенирования библиотек для анализа плотности нуклеосома

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Универсальный протокол для крупномасштабных gRNA библиотека производства из любого источника ДНК

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Исследования синтеза РНК с помощью 5-Bromouridine маркировки и иммунопреципитации

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Ретроспективное микроРНК последовательности: Комплементарной ДНК библиотеки подготовка протокол с помощью образцов формалин Исправлена парафин врезанных РНК

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...