Name: high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries at JoVE.com

Detta arbete stöddes av den österrikiska vetenskaps fonden (FWF Grants P23797, P27275 och P30596) och schweiziska National Science Foundation (Grant #PBBEP2_146174).

<ol>
	<li>Bumgarner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. 101, 22 (2013).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specificity+and+energy+landscapes+of+DNA-binding+molecules.">Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules.</a> Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).</li><li>Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+sequence+space+of+a+DNA+aptamer+using+microarrays.">Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).</li><li>Franssen-van Hal, N. L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Light-Directed+Synthesis+of+Aptamer+Microarrays.">Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).</li><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Chemistry+.4.+Synthesis+of+Deoxyoligonucleotides+on+a+Polymer+Support.">Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support.</a> Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li><li>Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Assembly+from+Chip-Synthesized+Oligonucleotides.">Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).</li><li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+gene+synthesis+by+selective+amplification+of+DNA+pools+from+high-fidelity+microchips.">Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips.</a> Nature Biotechnology. 28 (12), 1295 (2010).</li><li>Richmond, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+and+assembly+of+chip-eluted+DNA+(AACED):+a+method+for+high-throughput+gene+synthesis.">Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).</li><li>Schmidt, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+amplification+of+strand+subsets+from+chip-synthesized+oligonucleotide+libraries.">Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Chemical+Preservation+of+Digital+Information+on+DNA+in+Silica+with+Error-Correcting+Codes.">Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).</li><li>Erlich, Y., Zielinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Fountain+enables+a+robust+and+efficient+storage+architecture.">DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture.</a> Science. 355 (6328), 950-953 (2017).</li><li>Garalde, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+direct+RNA+sequencing+on+an+array+of+nanopores.">Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.</a> Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).</li><li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+complex+nucleic+acid+libraries+using+highly+parallel+in+situ+oligonucleotide+synthesis.">Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis.</a> Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).</li><li>LeProust, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+high-quality+libraries+of+long+(150mer)+oligonucleotides+by+a+novel+depurination+controlled+process.">Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).</li><li>Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M., Fern&#225;ndez-Lucas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives. , (2018).</li><li>Fodor, S. P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Addressable+Parallel+Chemical+Synthesis.">Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis.</a> Science. 251 (4995), 767-773 (1991).</li><li>Singh-Gasson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maskless+fabrication+of+light-directed+oligonucleotide+microarrays+using+a+digital+micromirror+array.">Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).</li><li>Pease, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Generated+Oligonucleotide+Arrays+for+Rapid+DNA-Sequence+Analysis.">Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).</li><li>Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Power+365+nm+UV+LED+Mercury+Arc+Lamp+Replacement+for+Photochemistry+and+Chemical+Photolithography.">High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography.</a> ACS Sustainable Chemistry &amp; Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).</li><li>Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetal+Levulinyl+Ester+(ALE)+Groups+for+2&#8242;-Hydroxyl+Protection+of+Ribonucleosides+in+the+Synthesis+of+Oligoribonucleotides+on+Glass+and+Microarrays.">Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2&#8242;-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).</li><li>Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+chemical+synthesis+of+rU-DNA+chimeras+on+chips+and+enzymatic+recognition.">In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition.</a> Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).</li><li>Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+RNA+microarrays+synthesized+in+situ+by+photolithography.">High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).</li><li>Agbavwe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency,+Error+and+Yield+in+Light-Directed+Maskless+Synthesis+of+DNA+Microarrays.">Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays.</a> Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).</li><li>Sack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Express+photolithographic+DNA+microarray+synthesis+with+optimized+chemistry+and+high-efficiency+photolabile+groups.">Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).</li><li>Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+o-Nitrobenzyl+Photolabile+Groups+for+Light-Directed+Chemistry+and+Microarray+Synthesis.">Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).</li><li>Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Light-Directed+Synthesis+of+Mirror-Image+Microarrays+in+a+Photochemical+Reaction+Cell+with+Flare+Suppression.">Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression.</a> Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-cleavable+microarrays+for+the+characterization+of+DNA+and+RNA+oligonucleotides+synthesized+in+situ+by+photolithography.">Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography.</a> Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).</li><li>Krotz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+stability+and+degradation+pathway+of+deoxyribonucleoside+phosphoramidites+in+acetonitrile.">Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).</li><li>Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Degradation+of+Dg+Phosphoramidites+in+Solution.">The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).</li><li>McGall, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+light-directed+synthesis+of+DNA+arrays+on+glass+substrates.">The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).</li><li>Collett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+RNA+microarrays+for+high-throughput+screening+of+antiprotein+aptamers.">Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers.</a> Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+RNA-protein+interactions+on+a+massively+parallel+array+reveals+biophysical+and+evolutionary+landscapes.">Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes.</a> Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).</li><li>Wu, C. -. H., Holden, M. T., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Fabrication+of+High-Density+RNA+Arrays.">Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).</li><li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+multiplex+gene+synthesis+from+programmable+DNA+microchips.">Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips.</a> Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+affinity+landscape+of+Thrombin-binding+aptamers+on+2'F-ANA/DNA+chimeric+G-Quadruplex+microarrays.">Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).</li></ol>

Författarna intygar att de inte har någon anknytning till någon vinstdrivande organisation.

Solid-fas DNA och RNA-syntes är bröd och smör i varje nukleinsyra kemi Lab, och även om tillägg av Photolithography komponenten är visserligen en komplicerad operation, microarray Fabrication medieras av UV-ljus är också en mycket tillförlitlig process . Det är dessutom den enda tillgängliga metoden för in situ RNA-syntes på mikromatriser. Fortfarande, som i alla etappvis experimentella förfarande, det finns gott om utrymme för mänskliga fel.
Det kanske mest kritiska steget är kopplingen av en fosforamidite, eftersom det måste vara en ständigt högavkastande kemisk reaktion för att ge oligonukleotides med få syntetiska fel. I vårt microarray Synthesis Protocol är phosphoramidite koppling ännu mer avgörande för övergripande syntes kvalitet eftersom tillverkningsprocessen kringgår tak och förebygger oligonukleotidrening. Stegvis koppling effektivitet över 99% har beräknats för alla ljuskänsliga DNA och RNA-fosforamiditer, även för mycket korta kopplingstider (15 s)24 men lägre kopplings avkastning kan ibland förekomma, särskilt när det gäller GD amidites. Stabiliteten hos de solubiliserade fosforamiditer vid rumstemperatur har undersökts innan och visades bero på vilken typ av nukleobas, med guanosin fosforamiditer benägna att omfattande nedbrytning i endast en fråga om dagar29, 30. Men vid förvaring vid-25 ° c konstaterades att GD fosforamiditer som upplöstes i ACN som 30 mM lösning var stabila i flera veckor. Den relativa instabiliteten hos GD fosforamidite-lösningar vid rumstemperatur innebär dock att de inte bör hållas knutna till DNA-syntesen i flera dagar.
För RNA-fosforamiditer, är kopplingen avkastningen mycket beroende av fosforamidite kvalitet (som kan bedömas med 31P NMR spektroskopi) och kopplingstid. Kopplingstider på 5 minuter för rA, rG, rC och 2 min för rU förefaller nödvändiga. Faktum är att vi fann att förkorta kondensations tiden till 2 min för alla RNA-fosforamiditer ledde till betydligt lägre hybridisering signaler.
Själva DNA-syntet, liksom reagenser och lösningsmedel, måste absolut vara så rena som möjligt för att uppnå den högsta avkastningen av oligonukleotidsyntes. Men olösligt material, salter eller partiklar, kan ackumuleras över tiden i linjer och slangar i leveranssystemet, vilket leder till en gradvis minskning av konsumtionen av reagenser och reaktanter. Om en allmän rengöring av syntet inte löser en låg effekt volym, kan en ökning av antalet pulser vara en alternativ lösning. Särskilt användbart när det gäller låg fosforamidite-förbrukning, kan linjen i kopplings protokollet som motsvarar pumpningen av en blandning av fosforamidite och aktivator (tredje raden i kopplings underavsnittet i tabell 1 och tabell 2) 6 till 9 pulser utan märkbar negativ effekt på syntes kvaliteten. Dessutom, antalet pulser av aktivator som behövs för att få amidite/Activator blanda till syntesen substrat (för närvarande 6, fjärde raden i kopplingen underavsnitt, se tabell 1 och tabell 2) beror på DNA-synthesizer själv samt på slanglängd i syntes cellen. Detta nummer kan justeras efter byte av fosforamidite med en färgad lösning och räkna antalet pulser som behövs för att driva den färgade blandningen till glaset substrat för koppling.
Metoden som beskrivs häri gör det möjligt för DNA och RNA-syntes att fortsätta samtidigt, på samma mikroarray. Hybrider av DNA och RNA kan också förberedas utan ändring av array Fabrication-protokollen, och så länge som trestegs deprotection-protokollet följs. Det bör dock noteras att RNA-bara mikromatriser bara kräver en två-stegs deprotection: en decyanoethylation först med et3N följt av hydroxylgrupp och bas deprotection med hydrazin. DNA-nukleobaser befanns vara ofullständigt deprotected under dessa förhållanden, och behöver ytterligare steg i EDA för att verkställa fullständig avlägsnande av fenoxyacetyl (PAC) grupper. Denna extra behandling med EDA är kortare (5 min) än för standard deprotection av DNA Microarrays31, men det är tillräckligt för att köra den till slutförande efter trietylamin och hydrazin behandlingar. Dessutom begränsar en kort reaktionstid med EDA exponeringen av en fullständigt avskyddad RNA-oligonukleotid till grundläggande villkor.
En fördel med in situ RNA-matris syntes över alternativa metoder som spotting eller DNA-transkription32,33,34 är förmågan att lagra syntetiserade RNA mikrochip i skyddad form tills den används, vilket undviker risk för potentiell RNA-nedbrytning. Post-syntetiska procedurer för RNA innebär å andra sidan att förbrukningsvaror och reagenser hålls sterila och att hanteringen utförs under RNase-fria förhållanden. Notera, vi fann att tillsats av RNase inhibitor till hybridisering mixen inte ger starkare hybridisering signaler för RNA-funktioner.
Syntesen av DNA-bibliotek på en bas känsliga monomer är mer komplex än syntesen av några kontrollsekvenser på en yta, och som sådan är säkert mer benägna att designa fel. Ändå, förutsatt att sekvensen design (dvs. arten och antalet sekvenser) är korrekt, omvandla denna lista till en samling av exponerings masker och en ordnad serie av kopplingscykler förblir en enkel process. Emellertid, viktiga variationer från standard microarray syntes finns och är avgörande för en lyckad tillverkning av en hög densitet bibliotek array.
Först kopplas en Base-Sensitive avskiljare monomer som den första phosphoramiditen efter syntes av länkaren. Kopplings avkastningen för denna monomer (figur 1) konstaterades vara relativt låg, cirka 85%28, varför ansträngningar görs för att förbättra dess införlivande takt, antingen genom att öka dess koncentration i ACN från 30 mm till 50 mm, eller genom att upprepa kopplings steg: två sammanhängande kopplings reaktioner med färska monomerer eller två separata men sammanhängande kopplingscykler.
Den andra förändringen är tillsatsen av en β-karoten lösning i den bakre kammaren i syntes cellen, som bekvämt absorberar 365 nm ljus. Detta är en viktig modifiering av Photolithography setup eftersom det hindrar UV-ljus från att reflektera tillbaka till mat ris substrat. Faktum är att efter passage av interstitiell mediet mellan substrat, inkommande UV-ljus utgångar genom den borrade bilden och når kvarts blocket av cellen. Den Fresnel ekvationer förutsäga att ~ 4% av vinkelrätt incident UV-ljus kommer att reflektera från var och en av de tre nedströms luft-glas gränssnitt (Exit sidan av 2nd substrat och båda sidor av kvarts blocket) och tillbaka på syntesen substrat, som leder till oavsiktlig exponering av fotoskyddade oligonukleotider. Diffraktion och spridning bidrar också till "off-Target" photodeprotection och därför till nukleotid insättning, som direkt påverkar felfrekvensen av syntes, men dessa bidrag är mycket mindre än reflektioner och kan främst åtgärdas genom minska syntes tätheten (lämnar luckor mellan funktioner). Vi har funnit att nivån av β-karoten lösning i den nedre kammaren av cellen tenderar att något minska endast under de första minuterna av array syntes, och därför måste övervakas och justeras.
Slutligen, den tredje förändringen är deprotection lösning, ersätter EtOH för toluen, som håller klyvs DNA-biblioteket bunden till ytan, förmodligen genom elektrostatiska interaktioner. Genom att applicera en liten mängd vatten i syntes området efter ACN-tvättning kan biblioteket enkelt samlas in. Processen är dock endast framgångsrik om vattenhalt i EDA och toluen är minimal, vilket gör att nukleinsyran helt olöslig i deprotection cocktail. Alternativt kan DNA-bibliotek klyvas av chip med ammoniak9,10,14,35, sedan ytterligare deprotected genom upphettning av DNA-innehållande vattenlösning ammoniak till 55 ° c över natten. Återhämtningen av DNA-bibliotek med ammoniak är dock inte förenligt med RNA. RNA-oligonukleotider på ett basklyvbart substrat kan elueras från ytan med samma EDA/toluenförfarande som beskrivs ovan, men endast i det näst sista stadiet efter et3N och hydrazin två stegs deprotection strategi28.
Alternativa strategier för att återvinna oligonukleotid pooler från Microarrays utan behov av en specifik grundbehandling finns, är i princip förenligt med Photolithography och förlita sig på användningen av enzymer. Till exempel kan en enda deoxyuracil nukleotid vara målet för uracil-DNA glykosylase (UDG) och exciderade från resten av DNA-sekvensen, eller en enda RNA-enhet kan kännas igen av RNase H typ 2 enzymer och Phosphodiester Bond 5 "till RNA-klyvt , frigöra 5 ' DNA del23.
Vi har nu en kraftfull, pålitlig och hög densitet metod för syntes av DNA, RNA, och hybrid DNA/RNA Microarrays. Dessa kan inte bara fungera som plattformar för hybridisering eller bindande analyser36, men de utgör också ett snabbt och billigt sätt att producera komplexa nukleinsyra bibliotek. För DNA-baserad digital datalagring, microarray Photolithography kan bli en potentiell lösning på "skriva" flaskhalsen (dvs, till kodning av information genom syntes). Framgången i Digital kodning på DNA och i de Novo gen församling beror på sekvens trohet som, på syntes nivå, översätter till felfrekvens. Syntetiska och optiska fel i våra nuvarande array Fabrication protokoll kommer att diskuteras och rapporteras på annat håll. Parallellt pågår nu insatser för att ytterligare öka tillverknings skala och genomströmning.

Den praktiska användningen av DNA-mikromatriser har traditionellt varit i studiet av variationer i gen uttrycks nivåer mellan två cellpopulationer, med hjälp av kompletterande strängar och fluorescens som en detektionsmetod1. Ibland, DNA Microarrays venture till bindande händelser med icke-nukleinsyra ligander, såsom proteiner, med en strategi för systematisk sekvens permutation som erbjuder en omfattande översikt av bindningen landskap2,3, 4,5. Denna metod omvandlar effektivt mikromatriser från enbart hybridisering ytor till plattformar med bred sekvens täckning, vilket skulle vara en tillgång för studiet av den rikare och mer komplex värld av RNA struktur och funktion. Med stöd av den extremt effektiva fosforamidite-kopplingsreaktionen6, kan in situ SYNTETISERADE DNA-matriser nu också betraktas som en billig källa till DNA7, vilket blir särskilt relevant med tanke på den ständigt ökande efterfrågan på nukleinsyraferial för gen församlingen8,9, DNA-baserade nanostrukturer10, informationslagring eller sekvensering11,12. På samma sätt kommer sekvenseringstekniker sannolikt att gynnas av utvecklingen av metoder som ger mycket komplexa blandningar av RNA-oligonukleotider13. I detta sammanhang, array Fabrication protokoll som gör det möjligt för oligonukleotides att syntetiseras på plats och vid hög densitet är idealiskt placerade för att tillgodose behoven hos det snabbt växande området av nukleinsyra bioteknik. Med ett så vitt skilda område som bioteknik kan syftet med varje ansökan dock kräva att DNA på microarray produceras antingen vid hög genomströmning eller med en mycket låg mängd syntetiska fel14,15, eller båda, vilket kräver en närmare titt på syntes protokollen av DNA Microarrays som historiskt sett har främst optimerats för hybridisering assays. Under tiden, in situ syntes av RNA Microarrays har visat sig vara en utmanande strävan, med de flesta av de svårigheter som är förknippade med den skyddande gruppen för 2 '-OH funktion, oftast en silylgrupp del i standard solid-fas syntes som avlägsnas med fluor-baserade reagenser, kemikalier som är oförenliga med glas-eller kisel ytor. Dessa frågor och utmaningar i DNA och RNA microarray syntes har nyligen varit föremål för en stor kropp av arbete, i synnerhet med Photolithography förhållningssätt16.
Photolithography använder UV-ljus för att avblockera oligonukleotides innan kopplingen och kräver masker för att konstruera ett mönster av UV-exponering, därigenom rumsligt organisera och kontrollera tillväxten av oligonukleotides. Fysiska masker har ersatts av datorstyrda micromirrors vars vippning selektivt reflekterar UV-ljus på mikroarraysubstratet17,18,19. Som UV-källa använder vi 365 nm ljus från en hög effekt LED-källa20. Nuvarande photolithographic uppställningar är utrustade med Micromirror Device matriser som innehåller 1024 × 768 speglar, vilket motsvarar mer än 780 000 individuellt adresserbara fläckar ("egenskaper") på en liten yta på bara 1,4 cm2, eller 1080p med matriser av 1920 × 1080, eller > 2 miljoner speglar. Var och en av speglarna i enheten har därför direkt kontroll över sekvensen som odlas på motsvarande funktion. Med undantag av UV-ljus, Photolithography fungerar något liknande enarrangera gradvis syntes teknik och adopterar den cykla-baserade phosphoramiditekemin. Bara det kräver en helt annan skyddsstrategi för RNA-syntes för att lyckas. Vi utvecklade en ny serie av ljuskänsliga RNA-fosforamiditer med hydrazin-labila skyddande grupper21. Dessa monomerer tillåter RNA att deskyddas under milda förhållanden som inte påverkar integriteten av ytan. En första deprotection steg använder trietylamin att ta bort cyanoetylfosfodiester skydda grupper, medan hydrazin används i en andra, separat steg för att ta bort dem på 2 '-OH och exocykliska Amin funktioner. På så sätt, RNA oligonukleotides ~ 30-NT i längd och i varje sekvens kan nu syntetiseras in situ på Microarrays22,23. Parallellt har vi också nyligen börjat ta itu med frågor om genomströmning, kvalitet och snabbhet i DNA och RNA Photolithography. Vi mätte kopplingen effektivitetsvinster > 99% för alla DNA och RNA amiditer (figur 1) och undersökt varje enskilt steg i oligonukleotid förlängning cykel, från oxidation tid, val av aktivator och optimal UV-exponering24 , 25. vi har fört in nya ljuskänsliga 5 "skydda grupper som kan avlägsnas på bara några sekunder, omvandla syntesen av hundratusentals 100mers till några timmar långa process26. Vi har också fördubblat genomströmningen av array Fabrication genom att exponera två substrat samtidigt27. Slutligen har vi infört en dT fosforamidite som innehåller en bas känslig Succinyl grupp som ett bekvämt sätt att klyva, samla in och analysera DNA och RNA oligonukleotides, som är centralt för biblioteks beredning28.
Trots den relativt vardagliga aspekten av DNA och RNA solid-fas syntes, särskilt för nukleinsyrafokemister, microarray Photolithography förblir en icke-trivial uppgradering som kräver en komplex installation, noggrann kontroll och övervakning av processen, och separata instruktioner för post-syntetisk hantering beroende på typen av oligonukleotid och typ av ansökan. I denna artikel vill vi ge en detaljerad presentation av hela steg-för-steg-förfarandet för in situ-syntes av DNA och RNA-mikromatriser av Photolithography, från experimentell design till dataanalys, med betoning på beredning av instrument och Förbrukningsvaror. Vi beskriver sedan de post-syntetiska deprotection metoder som motsvarar det avsedda syftet med microarray Fabrication (dvs, antingen hybridisering eller återvinning av nukleinsyra bibliotek).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:792px;" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Slide functionalization</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetic acid &#62;99.8%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">33209</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">CNC router</td>
			<td style="width:175px;">Stepcraft</td>
			<td style="width:119px;">300 CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">1.07017.2511</td>
			<td>For deprotection and functionalization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide</td>
			<td style="width:175px;">Gelest</td>
			<td style="width:119px;">SIT8189.5</td>
			<td>Silanizing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Nexterion Glass D microscope slides</td>
			<td style="width:175px;">Schott</td>
			<td style="width:119px;">1095568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Polymax 1040</td>
			<td style="width:175px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Proclean 507 Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:175px;">Ulsonix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z860086</td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Microarray synthesis</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.25 M dicyanoimidazole in ACN</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004712402BS</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.7 XGA DMD</td>
			<td style="width:175px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital Micromirror Device</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:332px;">20 mM I2 in pyridine/H2O/THF</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L860020-06</td>
			<td>Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">250 &#956;m thick Chemraz 584 perfluoroelastomer</td>
			<td style="width:175px;">FFKM</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Lower teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2&#39;-O-ALE RNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">365 nm high-power UV-LED</td>
			<td style="width:175px;">Nichia</td>
			<td style="width:119px;">NVSU333A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;BzNPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">Orgentis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;NPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">FlexGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0001205402BS</td>
			<td>For DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amidite Diluent for DNA synthesis</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L010010</td>
			<td>For dissolving phosphoramidites</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Cleavable dT</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Base-sensitive monomer for library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DMSO</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004474701BS</td>
			<td>As exposure solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DNA and RNA microarray deprotection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethylenediamine &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3550</td>
			<td>For deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Expedite 8909</td>
			<td style="width:175px;">PerSeptive Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA synthesizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">225819</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Imidazole</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Industrial Strength lower-density PTFE tape</td>
			<td style="width:175px;">Gasoila</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thin, upper teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Pyridine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P57506</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Triethylamine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0886</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#946;-carotene</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9750</td>
			<td>For library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization and scanning</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">20x Sodium Saline Citrate</td>
			<td style="width:175px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">1054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;Cy3-labelled complementary strand</td>
			<td style="width:175px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For duplex hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">R3961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">EDTA molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">GenePix 4100A</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:175px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:119px;">230500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES monohydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">69889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES sodium</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NaCl &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SecureSeal SA200 hybridization chamber</td>
			<td style="width:175px;">Grace BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">623503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Spectrafuge mini</td>
			<td style="width:175px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">C1301</td>
			<td>Microarray centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tween-20 molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Data extraction</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Excel</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For data extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MatLab</td>
			<td style="width:175px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NimbleScan 2.1</td>
			<td style="width:175px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Desalting and quantification</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Toluene</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">ZipTip C18</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ZTC18s008</td>
			<td>Desalting pipet tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries

Photolithography är en kraftfull teknik för syntes av DNA oligonukleotides på glas diabilder, eftersom den kombinerar effektiviteten av fosforamidite koppling reaktioner med precision och täthet av UV-ljus reflekteras från mikrometer stora speglar. Photolithography ger Microarrays som rymmer från hundratusentals upp till flera miljoner olika DNA-sekvenser, 100-NT eller längre, på bara några timmar. Med denna mycket stora sekvens utrymme, Microarrays är idealiska plattformar för att utforska mekanismerna för nukleinsyra · ligandinteraktioner, som är särskilt relevanta när det gäller RNA. Vi rapporterade nyligen om utarbetandet av en ny uppsättning av RNA-fosforamiditer kompatibla med in situ Photolithography och som senare användes för att odla RNA oligonukleotides, homopolymerer samt blandade-bas sekvenser. Här illustrerar vi i detalj processen för RNA microarray Fabrication, från experimentell design, instrumentell installation, array syntes, deprotection och final hybridisering assay med hjälp av en mall 25mer sekvens som innehåller alla fyra baser som ett exempel. Parallellt går vi bortom hybridisering-baserade experiment och utnyttja microarray Photolithography som en billig inkörsport till komplexa nukleinsyra bibliotek. För att göra det, är hög densitet DNA Microarrays fabricerade på en bas-känslig monomer som gör att DNA för att vara bekvämt klyvs och hämtas efter syntes och deprotection. Tillverknings protokollet är optimerat för att begränsa antalet syntetiska fel och för detta, ett skikt av β-karoten lösning införs för att absorbera UV-fotoner som annars kan reflektera tillbaka på syntes substrat. Vi beskriver i ett steg-för-steg hur hela processen med biblioteks förberedelse, från design till klyvning och kvantifiering.

DNA och RNA microarray hybridisering Figur 5 visar resultatet av en hybridiserings analys utförd på en mikroarray innehållande DNA-och RNA-versionerna av en 25mer sekvens (5 '-GTCATCATCATGAACCACCCTGGTC-3 ' i DNA-form). Skanningen i figur 5a visas i en greenscale format som motsvarar excitation/emission spektrum av Cy3 fluorescens, med fluorescensintensitet registreras i godtyckliga enheter mellan 0 och 65536. Matrisdesignen följde 25:36-funktionslayouten som beskrivs i avsnittet protokoll. Skanningen visas efter korrekt orientering av matrisen, med det övre vänstra hörnet befolkade med den längsta kedjan av relaterat funktioner. Här innehåller relaterat funktioner DNA-versionen av 25mer och bör i princip alltid ge en positiv fluorescens signal för att utföra skanning justering och datautvinning. Den hybridiserade microarrayen bör synas jämnt ljust, med kantar av syntes området vara emellertid vanligt ljusare än centrera (upp till 50% ljusare). Den stora mängden sekvens replikat, slumpmässigt fördelade över hela området, minskar effekterna av rumsliga artefakter. Här var varje sekvens (DNA och RNA) syntetiseras på 2 000 slumpmässiga platser. Det är typiskt låg fluorescens buller (bakgrund), < 50 a.u., vilket leder till en signal/brus förhållande i storleksordningen 200:1 till 800:1 i hybridisering assays. Efter datautvinning beräknas fluorescensintensiteter ut och ritas ± SD.
Det finns en signifikant variation i absoluta fluorescensvärden mellan experiment. Här visar vi resultaten för tre oberoende synteser med samma tillverknings parametrar och samma post-syntetiska hantering. Den 25mer DNA, när hybridiseras till dess kompletterande Cy3-märkt DNA-sträng, kommer att ge fluorescens signaler som sträcker sig någonstans från 20 000 till 30 000, mycket sällan över eller under. Den 25mer RNA, när hybridiseras till samma Cy3-märkt DNA komplement, kommer att ge fluorescens intensiteter på motsvarande funktioner som sträcker sig från 15 000 till 20 000. Dock kommer fluorescensintensiteten hos RNA/DNA-duplexerna ibland sjunka under 8 000, då motsvarande DNA/DNA duplex fortfarande fluorescerar inom intervallet 20000-30000. I sådana fall kan resultaten för RNA betraktas som suboptimala. En syntes eller hybridisering misslyckande, antingen för DNA eller RNA, kommer att märkas omedelbart under skanning från den uppenbara bristen på fluorescens. Det finns flera möjligheter för RNA-syntesen att antingen misslyckas eller delvis lyckas och de kommer att beskrivas i diskussionsdelen.
Bibliotek deprotection, klyvning och återhämtning Beroende på komplexiteten och tätheten av biblioteket, kan formen och konturerna av den syntetiserade matrisen ses utan förstoring men under ordentlig belysning (figur 4), med DNA fortfarande i skyddad form. Efter deprotection med EDA/toluen, och före tillsats av vatten för att samla in det kluvna biblioteket, kan syntes området som innehåller de nu deskyddade oligonukleotiderna sticka ut som en hydrofila zon, när resten av glas bilden kommer att visas täckt med ett grumligt hydrofoba skikt. Den direkta observationen av syntes området beror på den totala arean som används för att syntetisera oligonukleotider: en större användning av syntes området kommer att motsvara en större chans att klara distinktionen mellan hydrofila och hydrofoba områden på ytan. Omvänt, bibliotek syntetiseras med färre speglar och med mindre funktioner kan inte vara omedelbart observerbara.
På samma sätt är mängden återvunnet DNA efter avsaltning direkt proportionell mot den totala arean som används för syntes. Om alla funktioner används för oligonukleotidsyntes bör klyvning och återvinningsförfarande ge mellan 25 och 30 pmol av DNA. En 10% användning av syntes området kommer därför endast att ge omkring 3 pmol av DNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg"> Figur 1 . Kemiska strukturer av DNA och RNA-fosforamiditer som används i oligonukleotidsyntes av microarray Photolithography. Standard nitrophenylpropyloxycarbonyl (NPPOC) ljuskänsliga skyddande grupper på 5 '-OH används i vanliga DNA och RNA microarray syntes för hybridisering ändamål. För syntesen av komplexa DNA-bibliotek, den mer photolabile Benzyl-NPPOC (BzNPPOC) är att föredra vid 5 '-OH, som BzNPPOC avlägsnas dubbelt så snabbt som NPPOC, vilket avsevärt minskar total microarray syntes tid. DNA oligonukleotides för bibliotek kräver också kopplingen av en klyvbar dT monomer vid 3 ' änden. Denna monomer, som bär en Succinyl Ester funktion, kommer att klyvas under deprotection, vilket gör det möjligt för DNA som skall samlas in från mikrochip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg"> Figur 2 . Exempel på en mask som en bildfil som skickas till Micromirror Device-enheten under UV-exponering. De vita pixlarna motsvarar speglar som kommer att lutas i "on"-läge, reflekterande UV-ljus på syntes cellen. Svarta pixlar motsvarar "off"-speglar, där UV-ljuset reflekteras bort från cellen. Vita pixlar kommer därför att möjliggöra kopplingen av nästa inkommande fosforamidite på oligonukleotides finns på motsvarande funktioner på glaset substrat. Oligonukleotides syntetiseras på de funktioner vars motsvarande speglar är, i denna mask fil, svarta pixlar kommer dock att förbli inert under nästa koppling händelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg"> Figur 3 . Fotografier av microarray Photolithography optisk och syntes setup. (A) optisk krets för UV-exponering. UV-ljus från UV-LED först homogeniseras genom en rektangulär-tvärsnitt ljus-röret sedan reflekterar på micromirrors. Micromirrors som har lutats i en "OFF" läge kommer att återspegla UV-ljus bort från syntes cellen, men micromirrors i "ON" läge kommer att återspegla ljus på syntes cellen, som ligger på fokalplanet, genom att först passera genom en 1:1 offner relä avbildningssystem. (B) syntes cellen, en gång monterad, består av en borrad bild placerad först på kvarts blocket av cellen, åtskilda av en tjock PTFE packning (visas inte). En andra, icke-borrad bild är sedan placerad över den borrade bilden, åtskilda av en tunn PTFE packning. En metallram (visas inte) håller ihop monteringen. (C). för bibliotek beredning, när syntes cellen är fäst vid fokalplanet av inkommande UV-ljus, är den kammare som ligger mellan kvarts blocket och den borrade bilden fylld med en 1% lösning av β-KAROTEN i CH2cl2. För att göra detta är ett extra inlopps-och utloppsrör anslutet till kvarts blocket och den orangefärgade lösningen flödar från höger till positionen längst till vänster. Flödet av reagenser och lösningsmedel för syntesen visas i vita pilar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg"> Figur 4 . Syntes området är vanligtvis synligt för blotta ögat. Här kan ett DNA-bibliotek ses på glasytan direkt efter syntesen, med DNA fortfarande i skyddad form. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg"> Figur 5 . Hybridisering analyser till 25mer DNA och RNA sekvenser syntetiseras in situ på Microarrays. (A) fluorescens Scan av hela hybridiserade DNA och RNA microarray. 25mer DNA och RNA oligonukleotides hybridiseras till deras Cy3-märkta kompletterande strängar. Matrisen skannades med en laser vid en 532 nm excitation våglängd, vid 5 μm upplösning. (B) fluorescensintensiteter (godtyckliga enheter) av DNA: DNA och RNA: DNA duplex i tre separata experiment. De ljusgröna uppgifterna för in situ syntetiserade RNA-oligonukleotider kan anses vara suboptimala, jämfört med fluorescensintensiteten hos motsvarande DNA-sekvenser. Felstaplar är SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg"> Figur 6 . Schematisk representation av deprotection, klyvning och återvinning förfarande för DNA-bibliotek syntetiseras på Microarrays. DNA-sekvenser odlas på en baskänslig lånet DT-nukleosid (visas i det zoomade området). Efter syntes, deprotection av DNA oligonukleotides (bas skyddande grupper representeras som röda sfärer) i EDA/toluen lämnar det deskyddade materialet elektrostatiskt bunden till ytan och kan sedan pipetteras ut genom att tillämpa en liten mängd vatten på det syntetiserade området. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg"> Figur 7 . Representativ absorbansspektrum (220-350 nm) i ett klyvt, desaltat DNA-bibliotek innehållande 4 000 olika sekvenser, 100-NT i längd. Totalt 940 ng av DNA isolerades från en enda Array syntes, vilket motsvarar 30 pmol av DNA totalt, eller 15 pmol per glas substrat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg"> Tabell 1. Representativ cykel protokoll för koppling/oxidation/photodeprotection av 5 '-BzNPPOC-da, förutsatt att motsvarande fosforamidite var lastat på port "A". Kopplings tiden (i sekunder) visas på raden "parmonomer". Den UV photodeprotection tid, här motsvarar en strålningsenergi på 3 J/cm2 (bznppoc Photochemistry), beräknas som den tid som förflutit mellan de två "händelse 2 ut" kommunikations signaler.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg"> Tabell 2. Representativ cykel protokoll för koppling/oxidation/photodeprotection av 5 '-NPPOC-ra, förutsatt att motsvarande RNA-fosforamidite lastades på port "A". Kopplings tiden (i sekunder) visas på raden "parmonomer". Den UV photodeprotection tid, här motsvarar en strålningsenergi på 6 J/cm2 (nppoc Photochemistry), beräknas som den tid som förflutit mellan de två "händelse 2 ut" kommunikations signaler.

Watch this Scientific Journal Video about High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries at JoVE.com

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Hög densitet DNA och RNA mikromatriser-photolithographic syntes, hybridisering och beredning av stora nukleinsyra bibliotek

I denna artikel presenterar vi och diskuterar nya utvecklingar i syntes och tillämpningar av nukleinsyremikromatriser fabricerade in situ. Närmare bestämt visar vi hur protokollen för DNA-syntes kan utökas till RNA och hur mikromatriser kan användas för att skapa hämtningsbara nukleinsyrebibliotek.

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

DNA och RNA-mikroarrayer är mycket användbara för att studera samspelet mellan nukleinsyror och proteiner, men de är också en bekväm metod för beredning av sekvensbibliotek. Fotolitografi möjliggör hundratusentals unika sekvenser som ska syntetiseras parallellt och är för närvarande den enda direkta metoden för RNA-syntes på mikrostrålar. Den in situ fotolitgrafiska syntesen av mikroarrayer kan också utvidgas till kemiskt modifierade oligonukleotider, till exempel med två främsta fluor av peptidnukleinsyror.Att se processen för microarray tillverkning och hantering kan bidra till att förstå hur denna komplexa maskiner utvecklades från den välkända standarden solid fas DNA-syntes. Påbörja den här proceduren med microarray-design och glidfunktionalisering enligt beskrivningen i textprotokollet. Slå på DNA-synten UV LED och dess kylfläkt.Fäst en UV-intensitetsmätare vid kontaktpunkten för inkommande UV-ljus och slå på den. Starta programvaran WiCell Controller på datorn. Slå på och initiera mikromerenheten.Ladda en helt vit mask fil genom att högerklicka på DMD och sedan välja ladda bild. Högerklicka på UVS-ikonen och välj UV-slutare öppen. Avläs strömvärdet på intensitetsmätaren och räkna 60 sekunder.Efter 60 sekunder, läs av strömvärdet igen och anteckna ned värdena för början och. Stäng slutaren genom att välja UV-jalusi stänga och stänga av intensitetsmätaren. Beräkna genomsnittligt UV-intensitetsvärde i milliwatt per centimeterkvadrat.I Programvaran WiCell laddar du jobb-, sekvens- och protokollfilerna i sina respektive underfönster och klickar sedan på skicka för att skicka sekvens- och protokollfilerna till DNA-syntet. För att montera syntescellen placera en tjock perfluoroelastomer packning på kvartsblocket i cellen. Placera sedan ett borrat, funktionaliserat mikroskop glida ovanpå den första packningen, och kontrollera att hålen på objektglasen ansluta med in- och utloppsslangen i syntescellen.Placera en andra, tunn polytetrafluoreten packning över den borrade bilden, som omger de två hålen. Slutligen, placera en andra, funktionaliserad men oborstade glida ovanpå den andra packningen. Placera nu en 4-skruv metallram ovanpå den monterade dubbelsubstratcellen Dra åt skruven till samma klämkraft med hjälp av en momentskruvmejsel.Fäst in- och utloppsslangen på DNA-synt. Prime acetonitril tvättlinjen och verifiera korrekt flöde av acetonitril genom substrat. Mät volymen acetonitril vid avfallsledningen efter att ha gått igenom sju cykler acetonitril priming.Denna volym bör vara två milliliter. Fäst syntescellen vid fokalplanet av inkommande UV-ljus. Vid biblioteksberedning, fäst en extra in- och utloppslina på cellens baksida och fyll ryggkammaren med betakarotenlösningens två milliliter.Starta syntesen genom att först klicka på Kör i WiCell-programvaran. Vid första vänta kommandot i jobbet filen, tryck på start på DNA-synthesizer. Efter syntes av regelbundna mikroarrayer, koppla cellen från synthesizer, och demontera cellen.Använd en diamantpenna för att etsa upp syntesnumret på glasglasen. Etsa numret på det icke-syntetiserade ansiktet på varje bild. Överför objektglasen i 50 milliliter centrifugeringsrör och förvara i ett uttredd område tills vidare används.Efter syntesen av bibliotekets mikroarrayer, först dränera betakaroten lösningen ur kammaren sedan tvätta kammaren två gånger genom att flöda fem milliliter metylenklorid genom innan avtappning. För DNA-mikroarrydeskydd, fyll en färgningsglasburk med 20 milliliter etanol och 20 milliliter EDA. Placera mikrostrålarna med enbart DNA-banor vertikalt i burken, stäng locket och låt rutschkanorna deskydda i två timmar i rumstemperatur.Efter två timmar, hämta bilderna med hjälp av pincett och skölj dem noggrant med dubbeldestillerat vatten. Torka objektglasen i en mikroarraycentrifug i några sekunder innan du förvarar dem i en exsiccator. För deprotection av RNA mikroarray, bered en torr lösning på 20 milliliter trietylamin och 30 milliliters acetonitril i ett 50 milliliter centrifugeringsrör.Överför en RNA microarray glida in i centrifugröret, stäng locket och linda med plast tätning film. Skaka försiktigt centrifugröret på en orbitalskak i en timme och 30 minuter i rumstemperatur. Därefter tar du bort bilden och tvätta två gånger med 20 milliliter torr acetonitril innan du torkar i en microarray centrifug i några sekunder.Efter det första avskyddsteget överför RNA-glidningen in i hydrazinhydratlösningen, stäng locket och linda med plasttätningsfilm. Efter två timmars försiktigt skakning på en orbital shaker, ta bort bilden och tvätta den två gånger med 20 milliliter av torra acetonitril. Torka sedan i en microarray centrifug i några sekunder.Om RNA-mikroarrayen också innehåller DNA-nukleotider, fortsätt med ett tredje deprotectionsteg. Tillsätt DNA/RNA-mikroarrayen i ett 50 milliliterrör som innehåller en till en EDA-etanollösning Efter 5 min i rumstemperatur, ta bort rutschkanan och tvätta mikroarrayen två gånger med 20 milliliter sterilt vatten. Torka rutschkanan i en mikroarraycentrifug och förvara i en exsiccator.I ett 1,5 milliliter sterilt mikrocentrifugrör, förbered hybridiseringsbufferten som innehåller Cy3-märkt DNA, som beskrivs i textprotokollet. Blanda och virvel lösningen. Placera försiktigt en självhäftande 300 mikroliter hybridiseringskammare över syntesområdet på varje objektglas och pipet i hybridiseringslösningen.Täck kammarens hål med självhäftande prickar och linda hela glidglaset i aluminiumfolie. Placera mikroarray glida in i hybridisering ugnen, täck och låt den försiktigt rotera vid den valda hybridiseringstemperaturen i två timmar. Efter två timmar, lossa glid, ta bort aluminiumfolien, pipettera ut hybridiseringslösningen och försiktigt riva av hybridiseringskammaren.Överför objektglasen till ett centrifugrör innehållande 30 milliliter av Non-Stringent Wash Buffer. Skaka kraftigt i två minuter i rumstemperatur. Överför glidglaset till ett centrifugrör innehållande 30 milliliter Stringent Wash Buffer och skaka kraftigt i en minut.Slutligen, överför bilden till en centrifug röret som innehåller 30 milliliter av Final Wash Buffer. Skaka i några sekunder. Torka rutschkanan i en mikroarraycentrifug.Nu, placera den torra microarray, syntes område vänd nedåt, i bildhållare av microarray scanner. För att deskydda och klyva DNA-bibliotek, sänk ner bilden i klyvningslösningen, i ett centrifugrör på 50 milliliter. Stäng röret och linda med plast tätning film, innan försiktigt rotera i en orbital shaker i två timmar vid rumstemperatur.Efter två timmar, ta bort bilden och tvätta två gånger med 20 milliliter av noggrant torr acetonitril innan du låter den lufttorka. Med en pipett, applicera 100 mikroliter sterilt vatten över det nu urskiljbara syntesområdet. Pipet lösningen upp och ner några gånger innan du överför den till en 1,5 milliliter microcentrifug rör.Upprepa processen och kombinera microarray eluat i samma rör. Avdunsta chip eluat till torrhet och sedan rödissolve i 10 mikroliter av nuklea-fri H2O. Visas här är resultaten av en hybridisering analys utförs på en microarray som innehåller DNA och RNA versioner av en 25mer sekvens.Skanningen i visas i en grönskala format som motsvarar excitation, utsläpp spektrum av Cy3 fluorescens, med fluorescens intensitet registreras i godtyckliga enheter. Det finns betydande variabilitet i absoluta fluorescensvärden mellan experiment. Resultaten för tre oberoende synteser med hjälp av samma fabriceringsparametrar och samma postsyntetiska hantering visas.Den 25mer DNA, när hybridiseras till dess kompletterande Cy3-märkta DNA-sträng, kommer att ge fluorescens signaler som sträcker sig från 20, 000 till 30, 000, mycket sällan över eller under. Den 25mer RNA, när hybridiseras till samma Cy3-märkta DNA-komplement, kommer att ge fluorescens intensiteter på motsvarande funktioner från 15, 000 till 20, 000. Fluorescensintensiteten hos RNA/DNA-duplexen kommer dock ibland att sjunka under 8 000, när motsvarande DNA/DNA-duplex fortfarande fluorescerar inom intervallet 20, 000 till 30 000.I sådana fall kan resultaten för RNA betraktas som suboptimala. Som med alla andra RNA-baserade experiment är det viktigt att komma ihåg att RNA mikroarrayer är känsliga för nedbrytning, och bör hanteras under sterila förhållanden. Nukleinsyrabibliotek som samlats in från mikroarrayer kan användas i DNA- eller RNA-sekvensering samt vid kodning av digital information på DNA.NED ger ett intensivt UV-ljus som inte bör ses direkt. På grund av detta rekommenderas det att bära skyddsglasögon medan instrumentet används.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetik för sackar-sträng DNA-syntes<em&gt; In Vitro</em&gt; Av bakteriofag T7 replikering proteiner

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Bedömning av DNA kontaminering i RNA-prover baserat på Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Ett universellt protokoll för storskaliga gärna biblioteket produktion från någon DNA-källa

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Utredning av RNA-syntes med 5-Bromouridine märkning och Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekvensering: Kompletterande DNA bibliotek förberedelse protokoll använder Formalin-fast Paraffin-inbäddat RNA exemplar

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detektion av sällsynta händelser med fel-korrigerade DNA och RNA-sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...