Name: high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries at JoVE.com

Bu çalışma Avusturya Bilim Fonu (FWF p23797, P27275 ve P30596 hibe) ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (Grant #PBBEP2_146174) tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Bumgarner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. 101, 22 (2013).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specificity+and+energy+landscapes+of+DNA-binding+molecules.">Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules.</a> Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).</li><li>Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+sequence+space+of+a+DNA+aptamer+using+microarrays.">Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).</li><li>Franssen-van Hal, N. L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Light-Directed+Synthesis+of+Aptamer+Microarrays.">Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).</li><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Chemistry+.4.+Synthesis+of+Deoxyoligonucleotides+on+a+Polymer+Support.">Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support.</a> Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li><li>Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Assembly+from+Chip-Synthesized+Oligonucleotides.">Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).</li><li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+gene+synthesis+by+selective+amplification+of+DNA+pools+from+high-fidelity+microchips.">Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips.</a> Nature Biotechnology. 28 (12), 1295 (2010).</li><li>Richmond, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+and+assembly+of+chip-eluted+DNA+(AACED):+a+method+for+high-throughput+gene+synthesis.">Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).</li><li>Schmidt, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+amplification+of+strand+subsets+from+chip-synthesized+oligonucleotide+libraries.">Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Chemical+Preservation+of+Digital+Information+on+DNA+in+Silica+with+Error-Correcting+Codes.">Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).</li><li>Erlich, Y., Zielinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Fountain+enables+a+robust+and+efficient+storage+architecture.">DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture.</a> Science. 355 (6328), 950-953 (2017).</li><li>Garalde, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+direct+RNA+sequencing+on+an+array+of+nanopores.">Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.</a> Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).</li><li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+complex+nucleic+acid+libraries+using+highly+parallel+in+situ+oligonucleotide+synthesis.">Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis.</a> Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).</li><li>LeProust, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+high-quality+libraries+of+long+(150mer)+oligonucleotides+by+a+novel+depurination+controlled+process.">Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).</li><li>Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M., Fern&#225;ndez-Lucas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives. , (2018).</li><li>Fodor, S. P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Addressable+Parallel+Chemical+Synthesis.">Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis.</a> Science. 251 (4995), 767-773 (1991).</li><li>Singh-Gasson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maskless+fabrication+of+light-directed+oligonucleotide+microarrays+using+a+digital+micromirror+array.">Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).</li><li>Pease, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Generated+Oligonucleotide+Arrays+for+Rapid+DNA-Sequence+Analysis.">Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).</li><li>Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Power+365+nm+UV+LED+Mercury+Arc+Lamp+Replacement+for+Photochemistry+and+Chemical+Photolithography.">High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography.</a> ACS Sustainable Chemistry &amp; Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).</li><li>Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetal+Levulinyl+Ester+(ALE)+Groups+for+2&#8242;-Hydroxyl+Protection+of+Ribonucleosides+in+the+Synthesis+of+Oligoribonucleotides+on+Glass+and+Microarrays.">Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2&#8242;-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).</li><li>Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+chemical+synthesis+of+rU-DNA+chimeras+on+chips+and+enzymatic+recognition.">In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition.</a> Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).</li><li>Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+RNA+microarrays+synthesized+in+situ+by+photolithography.">High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).</li><li>Agbavwe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency,+Error+and+Yield+in+Light-Directed+Maskless+Synthesis+of+DNA+Microarrays.">Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays.</a> Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).</li><li>Sack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Express+photolithographic+DNA+microarray+synthesis+with+optimized+chemistry+and+high-efficiency+photolabile+groups.">Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).</li><li>Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+o-Nitrobenzyl+Photolabile+Groups+for+Light-Directed+Chemistry+and+Microarray+Synthesis.">Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).</li><li>Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Light-Directed+Synthesis+of+Mirror-Image+Microarrays+in+a+Photochemical+Reaction+Cell+with+Flare+Suppression.">Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression.</a> Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base-cleavable+microarrays+for+the+characterization+of+DNA+and+RNA+oligonucleotides+synthesized+in+situ+by+photolithography.">Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography.</a> Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).</li><li>Krotz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+stability+and+degradation+pathway+of+deoxyribonucleoside+phosphoramidites+in+acetonitrile.">Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).</li><li>Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Degradation+of+Dg+Phosphoramidites+in+Solution.">The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution.</a> Nucleosides Nucleotides &amp; Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).</li><li>McGall, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+light-directed+synthesis+of+DNA+arrays+on+glass+substrates.">The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).</li><li>Collett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+RNA+microarrays+for+high-throughput+screening+of+antiprotein+aptamers.">Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers.</a> Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+RNA-protein+interactions+on+a+massively+parallel+array+reveals+biophysical+and+evolutionary+landscapes.">Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes.</a> Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).</li><li>Wu, C. -. H., Holden, M. T., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Fabrication+of+High-Density+RNA+Arrays.">Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).</li><li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+multiplex+gene+synthesis+from+programmable+DNA+microchips.">Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips.</a> Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).</li><li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+affinity+landscape+of+Thrombin-binding+aptamers+on+2'F-ANA/DNA+chimeric+G-Quadruplex+microarrays.">Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir kar amacı gütmeyen kuruluş ile hiçbir ilişkisi olduğunu belgelemek.

Katı fazLı DNA ve RNA sentezi her nükleik asit kimya laboratuvarının ekmek ve tereyağıdır ve fotolitografi bileşeninin eklenmesi kuşkusuz karmaşık bir işlem olmasına rağmen, UV ışığı ile aracılık edilen mikrodizi imalatı da çok güvenilir bir süreçtir. . Buna ek olarak, mikrodiziler üzerinde yerinde RNA sentezi için tek mevcut yöntemdir. Yine de, herhangi bir çok aşamalı deneysel prosedür olduğu gibi, insan hatası için yeterli oda var.
Belki de en kritik adım bir fosforamidit in kaplanmasıdır, çünkü birkaç sentetik hata içeren oligonükleotidleri karşılayabilmek için sürekli olarak yüksek verimli kimyasal reaksiyon olması gerekir. Mikrodizi sentez protokolümüzde, fosforamidit kaplini genel sentez kalitesi açısından daha da önemli dir, çünkü üretim süreci kapamayı atlar ve oligonükleotid arınmasını önler. %99'un üzerindeki kademeli bağlantı verimliliği, çok kısa bağlantı süreleri (15 s)24 için bile, ışığa duyarlı DNA ve RNA fosforamiditleri için hesaplanmıştır, ancak özellikle dG amiditleri söz konusu olduğunda, daha düşük bağlantı verimleri bazen oluşabilir. Oda sıcaklığında çözünür fosforamiditlerin stabilitesi daha önce araştırılmış ve nükleobaz doğasına bağlı olduğu gösterilmiştir, guanozin fosforamiditler sadece birkaç gün içinde geniş bozulmaeğilimli29, 30'a kadar. Ancak -25 °C'de depolandığında, 30 mM çözeltisi olarak ACN'de çözünmüş dG fosforamiditlerinin birkaç hafta stabil olduğu bulunmuştur. DG fosforamidit çözeltilerinin oda sıcaklığındaki göreceli kararsızlığı, dna sentezleyicisine birkaç gün bağlı tutulmaması gerektiği anlamına gelmez.
RNA fosforamiditler için kaplin verimi fosforamidit kalitesine (31P NMR spektroskopisi ile değerlendirilebilir) ve bağlantı süresine çok bağlıdır. rA, rG, rC ve rU için 2 dk için 5 dakikalık kaplin süreleri gerekli görünmektedir. Gerçekten de, tüm RNA fosforamiditleri için yoğuşma süresini 2 dk'ya düşürmenin hibridizasyon sinyallerini önemli ölçüde azaltdığını gördük.
DNA sentezleyicinin kendisi, reaktifler ve çözücüler, oligonükleotid sentezinin en yüksek verimelde etmek için kesinlikle mümkün olduğunca temiz olması gerekir. Ancak, çözünmez malzeme, tuzlar veya parçacıklar, zaman içinde hatlar ve dağıtım sisteminin boru, reaktifler ve reaktanların tüketiminde kademeli bir azalmaya yol açabilir birikebilir. Synthesizer'ın genel olarak temizlenmesinin düşük çıkış hacmini çözmediği durumlarda, bakliyat sayısındaki artış alternatif bir çözüm olabilir. Özellikle düşük fosforamidit tüketiminde yararlı, fosforamidit ve aktivatör karışımının pompalanmasına karşılık gelen bağlantı protokolündeki çizgi (Tablo 1 ve Tablo 2'dekibağlantı alt bölümü üçüncü satırı ) sentez kalitesi üzerinde kayda değer bir olumsuz etkisi olmadan 6 ila 9 darbeler. Ayrıca, amidit/aktivatör karışımını sentez substratına getirmek için gerekli olan aktivatör ünyatlarının sayısı (şu anda 6, bağlantı alt bölümünde dördüncü satır, bkz. Tablo 1 ve Tablo 2) DNA sentezleyicisinin kendisine ve sentez hücresinde tüp uzunluğu. Bu sayı, fosforamiditin renkli bir çözelti ile değiştirilmesi ve renkli karışımı kaplin için cam alt tabakaya itmek için gereken bakliyat sayısı sayıldıktan sonra ayarlanabilir.
Burada açıklanan yöntem, DNA ve RNA sentezinin aynı mikrodiziüzerinde aynı anda ilerlemesini sağlar. DNA ve RNA melezleri de dizi üretim protokollerinde herhangi bir değişiklik yapılmadan ve üç aşamalı korumasız protokole uyulması sürece hazırlanabilir. Ancak, rna sadece mikrodizilleri sadece iki adımlı bir deprotection gerektirir unutulmamalıdır: Et ile bir decyanoethylation ilk3N hidroksil ve hidrazin ile baz deprotection. DNA nükleobazlarının bu koşullar altında tamamen korumasız olduğu saptandı ve fenoksiasetil (Pac) gruplarının tamamen çıkarılmasını etkilemek için EDA'da ek bir adıma ihtiyaç vardır. EDA ile bu ekstra tedavi daha kısa (5 dk) DNA mikrodizilerinin standart deprotection için daha31, ama trietitamin ve hidrazin tedavileri sonra tamamlanması için sürücü yeterlidir. Buna ek olarak, EDA ile kısa bir reaksiyon süresi temel koşullara tamamen deprotected RNA oligonükleotid maruz kalma sınırlar.
Tespit veya DNA transkripsiyon32,33,34 gibi alternatif yöntemler üzerinde in situ RNA dizi sentezinin bir avantajı kullanıma kadar korunan formda sentezlenen RNA mikroçip saklamak için yeteneği, böylece kaçınarak potansiyel RNA bozulma riski. Diğer taraftan, RNA için sentetik sonrası prosedürler, sarf malzemelerinin ve reaktiflerin steril tutulduğunu ve elleçlemenin RNase içermeyen koşullar altında yapıldığını ima eder. Dikkat, biz hibridizasyon karışımı rna inhibitörü eklenmesi RNA özellikleri için güçlü hibridizasyon sinyalleri verim vermedi bulundu.
DNA kitaplıklarının tabana duyarlı bir monomer üzerindeki sentezi, yüzeydeki birkaç kontrol dizisinin sentezinden daha karmaşıktır ve bu nedenle tasarım hatalarına kesinlikle daha yatkındır. Ancak, sıralı tasarımın (yani, doğa ve dizi sayısının) doğru olduğunu varsayarsak, bu listeyi pozlama maskeleri koleksiyonuna dönüştürmek ve sıralı bir dizi bağlantı döngüsü basit bir süreç olmaya devam etmektedir. Ancak, standart mikrodizi sentezinden önemli varyasyonlar mevcuttur ve yüksek yoğunluklu bir kütüphane dizisinin başarılı bir şekilde üretilmesi için önemlidir.
İlk olarak, baza duyarlı dT monomer bağlayıcı sentezinden sonra ilk fosforamidit olarak birleştiğinde. Bu monomerin (Şekil1)kaplin veriminin nispeten düşük olduğu saptandı, yaklaşık %8528,bu nedenle ACN'deki konsantrasyonunu 30 mM'den 50 mM'ye çıkararak veya bağlantı adımı: taze monomerler veya iki ayrı ama ardışık bağlantı döngüleri kullanarak iki ardışık bağlantı reaksiyonları.
İkinci değişiklik, sentez hücresinin arka haznesine 365 nm ışığı uygun şekilde emen β-karoten çözeltisinin eklenmesidir. Bu, UV ışığının dizi alt tabakasına geri yansımasını önlediği için fotolitografi kurulumunda önemli bir değişikliktir. Gerçekten de, substratlar arasında interstisyel ortam geçtikten sonra, gelen UV ışığı delinmiş slayt üzerinden çıkar ve hücrenin kuvars bloğuna ulaşır. Fresnel denklemleri, dik olay UV ışığının ~% 4 üç aşağı hava-cam arayüzleri(2 substrat ve kuvars bloğun her iki tarafında çıkış tarafı) her yansıtacak ve geri sentez substrat üzerine tahmin, foto-korumalı oligonükleotidlerin istenmeyen maruziyetine yol açması. Kırınım ve saçılma aynı zamanda "hedef dışı" fotodekoruma ve dolayısıyla sentezhata oranını doğrudan etkileyen nükleotit eklemeye katkıda bulunur, ancak bu katkılar yansımalardan çok daha küçüktür ve esas olarak sentez yoğunluğunu azaltmak (özellikler arasında boşluklar bırakarak). Hücrenin alt odasındaki β-karoten çözeltisinin seviyesinin sadece dizi sentezinin ilk dakikalarında hafif çetrene düştüğünü ve bu nedenle izlenmesi ve yeniden ayarlanması gerektiğini bulduk.
Son olarak, üçüncü değişiklik deprotection çözümdür, toluen için EtOH yerine, hangi muhtemelen elektrostatik etkileşimler yoluyla, yüzeye bağlı aralıklı DNA kütüphanesi tutar. ACN yıkamadan sonra sentez alanına az miktarda su uygulanması, kütüphanenin rahatlıkla toplanmasını sağlar. Ancak eda ve toluen'deki su içeriği çok az sayılsa da bu işlem ancak nükleik asidi korumasız kokteylde tamamen çözünmez hale getirir. Alternatif olarak, DNA kütüphaneleri amonyağı9,10,14,35, daha sonra dna içeren sulu amonyan çözeltisi 55 ° C gecede ısıtılarak daha fazla deprotected kullanarak çip kapalı yarık olabilir. Ancak amonya kullanarak DNA kitaplıklarının geri kazanımı RNA ile uyumlu değildir. Bir baz-dekolte edilebilir substrat üzerinde RNA oligonükleotidler yukarıda açıklanan aynı EDA / toluen prosedürü kullanılarak yüzeyden eluted olabilir, ancak et3N ve hidrazin iki adım koruma stratejisi28sonra sondan bir önceki aşamada sadece .
Belirli bir temel tedaviye gerek kalmadan oligonükleotid havuzları mikrodizilerden kurtarmak için alternatif stratejiler vardır, prensipte fotolitografi ile uyumludur ve enzimlerin kullanımına dayanır. Örneğin, tek bir deoksiurasil nükleotit urasil-DNA glikozilazının (UDG) hedefi olabilir ve DNA dizisinin geri kalanından çıkarılabilir veya tek bir RNA ünitesi RNa H tip 2 enzimleri ve fosfodiester bağı 5' tarafından RNA cleaved'e kabul edilebilir. , 5' DNA bölüm23serbest .
Artık DNA, RNA ve melez DNA/RNA mikrodizilerinin sentezi için güçlü, güvenilir ve yüksek yoğunluklu bir metoduz var. Bu sadece hibridizasyon veya bağlayıcı tahliller için platformlar olarak hizmet edemez36, ama aynı zamanda karmaşık nükleik asit kütüphaneleri üretmek için hızlı ve ucuz bir yol temsil. DNA tabanlı dijital veri depolama için, mikrodizi fotolitografi "yazma" darboğaz için potansiyel bir çözüm haline gelebilir (yani, sentez ile bilgi kodlama için). DNA ve de novo gen montajında dijital kodlamadaki başarı, sentez düzeyinde hata oranına dönüşen sıralı sadakate bağlıdır. Mevcut dizi üretim protokollerimizdeki sentetik ve optik hatalar tartışılacak ve başka yerlerde raporlanacaktır. Buna paralel olarak, üretim ölçeğini ve üretim ini daha da artırmak için çalışmalar devam etmektedir.

DNA mikrodizilerinin pratik kullanımı geleneksel olarak iki hücre popülasyonu arasındaki gen ekspresyonu düzeylerindeki değişimlerin incelenmesinde, tamamlayıcı iplikçikler ve floresan bir algılamayöntemiolarak 1. Bazen, DNA mikrodizileri, proteinler gibi nükleik olmayan asit ligandları ile bağlayıcı olaylara, bağlayıcı manzara 2,3kapsamlı bir bakış sunan sistematik dizi permütasyon bir strateji ile girişim, 4,5. Bu yaklaşım, mikrodizileri sadece hibridizasyon yüzeylerinden geniş sıra kapsamına sahip platformlara dönüştürür ve bu da RNA yapısı nın ve fonksiyonunun daha zengin ve daha karmaşık dünyasının incelenmesinde bir değer olacaktır. Son derece verimli fosforamidit kaplin reaksiyonu tarafından desteklenen6, in situ sentezlenmiş DNA dizileri şimdi de DNA ucuz bir kaynak olarak kabul edilebilir7, hangi özellikle giderek artan talep dikkate alınarak ilgili hale gelmektedir gen montajı için nükleik asit malzemesi8,9, DNA tabanlı nanoyapılar10, bilgi depolama veya sıralama11,12. Aynı şekilde, sıralama teknolojileri RNA oligonükleotid13 çok karmaşık karışımları verim yöntemleringeliştirilmesinden yararlanmak olasıdır. Bu bağlamda, oligonükleotidlerin yerinde ve yüksek yoğunlukta sentezlemesine olanak tanıyan dizi üretim protokolleri, hızla genişleyen nükleik asit biyoteknolojisi alanının ihtiyaçlarını karşılamak için ideal bir şekilde yerleştirilmiştir. Ancak, biyoteknoloji gibi çeşitli bir alan ile, her uygulamanın amacı mikrodizi dna ya yüksek iş çıkışlı ya da sentetik hataları çok düşük miktarda14,15, ya da her ikisi ile üretilmesi gerektirebilir, gerektiren bir DNA mikrodizilerinin sentez protokollerine daha yakından bakın, tarihsel olarak, öncelikle melezleştirme tahlilleri için optimize edilmiştir. Bu arada, RNA mikrodizilerinin yerinde sentezinin zorlu bir çaba olduğu tespit edilmiştir, 2'-OH fonksiyonu için koruma grubu ile ilişkili zorluk çoğu ile, genellikle standart katı faz sentezinde silil moiety ile kaldırılır flor bazlı reaktifler, cam veya silikon yüzeylerile uyumsuz kimyasallar. Bu sorunlar ve DNA ve RNA mikrodizi sentezinde zorluklar son zamanlarda çalışma büyük bir vücut konusu olmuştur, fotolitografi yaklaşımı ile özellikle16.
Fotolitotografi kaplin önce oligonükleotidlerin engelini kaldırmak için UV ışığı kullanır ve uv maruziyeti bir desen oluşturmak için maskeler gerektirir, bu nedenle mekansal organize ve oligonükleotidlerin büyümesini kontrol. Fiziksel maskeler olan eğim seçici microarray substrat üzerine UV ışığı nı yansıtan bilgisayar kontrollü mikroaynalar tarafından değiştirildi17,18,19. UV kaynağı olarak, yüksek güç LED kaynak20365 nm ışık kullanın. Mevcut fotolitografik kurulumlar 1024 × 768 aynalar içeren mikroayna dizileri ile donatılmıştır, 780.000 'den fazla bireysel adreslenebilir noktalar ("özellikler") sadece 1.4 cm2küçük bir alanda karşılık gelen , veya 1080p dizileri ile 1920 × 1080, veya >2 milyon ayna. Bu nedenle, aygıttaki aynaların her biri, ilgili özellikte yetiştirilen dizi üzerinde doğrudan denetime sahiptir. UV ışığı dışında fotolitografi katı fazlı sentez tekniği gibi işlev görür ve çevrim bazlı fosforamidit kimyasını benimser. Sadece RNA sentezinin başarılı olması için tamamen farklı bir koruma stratejisi gerektirir. Hydrazine-labile koruma grupları 21'i taşıyan ışığa duyarlı RNAfosforamiditleri serisi geliştirdik. Bu monomerler, Yüzeyin bütünlüğünü etkilemeyen hafif koşullar altında RNA'nın korunmasını sağlar. İlk deprotection adım siyanotil fosfodiester koruma grupları kaldırmak için triethylamin kullanır, hidrazin 2'-OH ve ekzosiklik amin fonksiyonları bu kaldırmak için ikinci, ayrı bir adımkullanılır iken. Bunu yaparken, RNA oligonükleotidler ~ 30-nt uzunluğunda ve herhangi bir dizi şimdi mikrodiziler 22,23üzerinde yerinde sentezlenebilir . Buna paralel olarak, son zamanlarda DNA ve RNA fotolitografisinde üretim, kalite ve hız sorularını da ele almaya başladık. Tüm DNA ve RNA amiditleri için kaplin verimliliklerinin >%99'unu ölçtük (Şekil 1) ve oligonükleotid uzama döngüsündeki her bir adımı oksidasyon süresinden aktivatör seçimine ve optimal UV maruziyetine kadar inceledik24 , 25- Biz birkaç saat süren bir süreç içine 100mers yüz binlerce sentezi dönüştürerek, sadece saniyeler içinde kaldırılabilir yeni ışığa duyarlı 5 ' koruma grupları getirdik26. Biz de aynı anda iki substrat açığa çıkararak dizi imalatı nın üretim iki katına çıkardık27. Son olarak, biz cleave, toplamak ve DNA ve RNA oligonükleotidler, kütüphane hazırlık merkezi dir analiz etmek için uygun bir yol olarak bir baz duyarlı süksinil grubu içeren bir dT fosforamidit tanıttı28.
ÖZELLIKLE nükleik asit kimyagerleri için DNA ve RNA katı faz sentezinin nispeten dünyevi yönüne rağmen, mikrodizi fotolitografisi karmaşık bir kurulum, sürecin dikkatli kontrolü ve denetimi gerektiren önemsiz olmayan bir yükseltme olmaya devam eder ve oligonükleotidin niteliğine ve uygulama türüne bağlı olarak sentetik sonrası kullanım için ayrı talimatlar. Bu makalede, dna ve RNA mikrodizilerinin fotolitografi ile, deneysel tasarımdan veri analizine kadar tüm adım adım sentezinin ayrıntılı bir sunumunun sunulmasını, aletlerin hazırlanmasına ve Sarf. Daha sonra mikrodizi imalatının amacına karşılık gelen sentetik koruma sonrası koruma yöntemlerini (yani hibridizasyon veya nükleik asit kitaplıklarının geri kazanımı) açıklıyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:792px;" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Slide functionalization</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetic acid &#62;99.8%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">33209</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">CNC router</td>
			<td style="width:175px;">Stepcraft</td>
			<td style="width:119px;">300 CK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">1.07017.2511</td>
			<td>For deprotection and functionalization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide</td>
			<td style="width:175px;">Gelest</td>
			<td style="width:119px;">SIT8189.5</td>
			<td>Silanizing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Nexterion Glass D microscope slides</td>
			<td style="width:175px;">Schott</td>
			<td style="width:119px;">1095568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Polymax 1040</td>
			<td style="width:175px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Proclean 507 Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:175px;">Ulsonix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z860086</td>
			<td>To clean slides after drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Microarray synthesis</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.25 M dicyanoimidazole in ACN</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004712402BS</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.7 XGA DMD</td>
			<td style="width:175px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital Micromirror Device</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:332px;">20 mM I2 in pyridine/H2O/THF</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L860020-06</td>
			<td>Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">250 &#956;m thick Chemraz 584 perfluoroelastomer</td>
			<td style="width:175px;">FFKM</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Lower teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2&#39;-O-ALE RNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">365 nm high-power UV-LED</td>
			<td style="width:175px;">Nichia</td>
			<td style="width:119px;">NVSU333A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;BzNPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">Orgentis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;NPPOC DNA phosphoramidites</td>
			<td style="width:175px;">FlexGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0001205402BS</td>
			<td>For DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amidite Diluent for DNA synthesis</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L010010</td>
			<td>For dissolving phosphoramidites</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Cleavable dT</td>
			<td style="width:175px;">ChemGenes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Base-sensitive monomer for library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DMSO</td>
			<td style="width:175px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0004474701BS</td>
			<td>As exposure solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DNA and RNA microarray deprotection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Ethylenediamine &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3550</td>
			<td>For deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Expedite 8909</td>
			<td style="width:175px;">PerSeptive Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA synthesizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">225819</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Imidazole</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Industrial Strength lower-density PTFE tape</td>
			<td style="width:175px;">Gasoila</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thin, upper teflon gasket</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Pyridine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P57506</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Triethylamine &#62;99%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0886</td>
			<td>For RNA deprotection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#946;-carotene</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9750</td>
			<td>For library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization and scanning</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">20x Sodium Saline Citrate</td>
			<td style="width:175px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">1054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5&#39;Cy3-labelled complementary strand</td>
			<td style="width:175px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For duplex hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">R3961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">EDTA molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">GenePix 4100A</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:175px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:119px;">230500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES monohydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">69889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MES sodium</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NaCl &#62;99.5%</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SecureSeal SA200 hybridization chamber</td>
			<td style="width:175px;">Grace BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">623503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Spectrafuge mini</td>
			<td style="width:175px;">Labnet</td>
			<td style="width:119px;">C1301</td>
			<td>Microarray centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Tween-20 molecular biology grade</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Data extraction</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Excel</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For data extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">MatLab</td>
			<td style="width:175px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microarray design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NimbleScan 2.1</td>
			<td style="width:175px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Desalting and quantification</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Toluene</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">ZipTip C18</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ZTC18s008</td>
			<td>Desalting pipet tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-density dna and rna microarrays - photolithographic synthesis, hybridization and preparation of large nucleic acid libraries

Fotolitografi, fosforamidit kaplin reaksiyonlarının verimliliğini mikrometre boyutlu aynalardan yansıyan UV ışığının hassasiyeti ve yoğunluğuyla birleştirerek, cam kaydıraklarda DNA oligonükleotidlerinin sentezi için güçlü bir tekniktir. Fotolitografi, sadece birkaç saat içinde yüz binlerceden birkaç milyon farklı DNA dizisine, 100 nt veya daha uzun olan mikrodiziler verir. Bu çok büyük sıra alanı ile, mikrodiziler özellikle RNA durumunda ilgili nükleik asit·ligand etkileşimleri, mekanizmaları keşfetmek için ideal platformlar vardır. Yakın zamanda situ fotolitografide uyumlu ve daha sonra RNA oligonükleotidleri, homopolimerleri ve karışık baz dizilerini yetiştirmek için kullanılan yeni bir RNA fosforamidit setinin hazırlanması hakkında rapor verdik. Burada, rna mikrodizi üretim sürecini ayrıntılı olarak göstermek, deneysel tasarım, enstrümantal kurulum, dizi sentezi, deprotection ve son hibridizasyon tahlil bir örnek olarak dört temelleri içeren bir şablon 25mer dizisi kullanarak. Buna paralel olarak, melezleşmeye dayalı deneylerin ötesine geçiyoruz ve mikrodizi fotolitografisini karmaşık nükleik asit kütüphanelerine ucuz bir geçit olarak sömürüyoruz. Bunu yapmak için, yüksek yoğunluklu DNA mikrodizileri dna'nın uygun bir şekilde yarık ve sentez ve deprotection sonra geri alınmasını sağlayan bir baz duyarlı monomer üzerinde imal edilir. Üretim protokolü, sentetik hata sayısını sınırlamak için optimize edilmiştir ve bu etkiye göre, aksi takdirde sentez yüzeyleri üzerine geri yansıtabilir UV fonları absorbe β-karoten çözeltisi bir tabaka tanıtıldı. Tasarımdan dekolte ye ve nicelemeye kadar kütüphane hazırlama sürecinin tamamını adım adım anlatıyoruz.

DNA ve RNA mikrodizi hibridizasyonu Şekil 5, 25mer dizisinin (5'-GTCATCATCATGAACCACCGGTC-3' DNA formunda) DNA ve RNA versiyonlarını içeren bir mikrodizi üzerinde yapılan melezleme testinin sonuçlarını göstermektedir. Şekil 5A'daki tazyik, Cy3 floresanının uyarma/emisyon spektrumuna karşılık gelen yeşil ölçekte görünür ve floresan yoğunluğu 0 ile 65536 arasında rasgele birimlerde kaydedilir. Dizi tasarımı, protokol bölümünde açıklanan 25:36 özellik düzenini izledi. Tama, dizinin doğru yönlendirmesi sonrasında gösterilir ve sol üst köşe en uzun fiducial özellikler zinciriyle doldurulur. Burada, fiducial özellikler 25mer'in DNA versiyonunu içerir ve ilke olarak, tbmfik hizalama ve veri çıkarma işlemi gerçekleştirmek için her zaman pozitif floresan sinyali vermelidir. Melezleştirilmiş mikrodizi düzgün parlak görünmelidir, sentez alanının kenarları ancak genellikle merkezi daha parlak olan (%50'ye kadar parlak). Alan boyunca rastgele dağıtılan büyük miktarda dizi çoğaltma, mekansal eserlerin etkisini azaltır. Burada, her dizi (DNA ve RNA) 2.000 rasgele yerlerde sentezlendi. Genellikle düşük floresan gürültüsü (arka plan), <50 a.u., hibridizasyon tahlillerinde 200:1 ile 800:1 arasında bir sinyal/gürültü oranına yol açar. Veri ayıklamadan sonra floresan yoğunlukları ortalama olarak alınır ve ±SD çizilir.
Deneyler arasında mutlak floresan değerlerinde önemli değişkenlik vardır. Burada, aynı üretim parametreleri ve aynı post-sentetik işleme kullanarak üç bağımsız syntezs için sonuçları göstermektedir. 25mer DNA, tamamlayıcı Cy3 etiketli DNA iplikçik hibrid, floresan sinyalleri 20.000 ila 30.000 arasında değişen verecek, çok nadiren yukarıda veya altında. 25mer RNA, aynı Cy3 etiketli DNA komplemanı için hibridize edildiğinde, 15.000 ile 20.000 arasında değişen ilgili özellikleri floresan yoğunlukları verecektir. Ancak, RNA/DNA duplekslerinin floresan yoğunluğu zaman zaman 8.000'in altına düşer, buna karşılık gelen DNA/DNA dubleksleri 20.000-30.000 aralığında floresan olacaktır. Bu gibi durumlarda, RNA sonuçları sub-optimal olarak kabul edilebilir. Bir sentez veya hibridizasyon yetmezliği, DNA veya RNA için, floresan bariz eksikliği tarama sırasında hemen fark edilecektir. RNA sentezinin başarısız olması veya kısmen başarılı olması için birden fazla fırsat vardır ve bunlar tartışma bölümünde özetlenecektir.
Kütüphane deprotection, dekolte ve kurtarma Kütüphanenin karmaşıklığına ve yoğunluğuna bağlı olarak, sentezlenen dizinin şekli ve anahattı büyütme den önce ancak uygunışıklandırma altında (Şekil 4), DNA hala korumalı formda görülebilir. EDA/toluen ile korumadan sonra ve sulu kütüphaneyi toplamak için su ilavesinden önce, artık korumasız olan oligonükleotidleri içeren sentez alanı, cam kaydıraktan geri kalan ların ortaya çıkacağı hidrofilik bir bölge olarak öne çıkabilir. bulanık hidrofobik bir tabaka ile kaplıdır. Sentez alanının doğrudan gözlemlenmesi, oligonükleotidlerin sentezlenmesinde kullanılan toplam alana bağlıdır: sentez alanının daha fazla kullanılması yüzeydeki hidrofilik ve hidrofobik bölgeler arasında daha fazla ayrım olasılığına karşılık gelecektir. Tersine, daha az ayna kullanılarak ve daha küçük özelliklere sahip olarak sentezlenen kitaplıklar hemen gözlemlenebilir olmayabilir.
Benzer şekilde, tuzsuzlama dan sonra kurtarılan DNA miktarı sentez için kullanılan toplam alan ile doğru orantılıdır. Tüm özellikler oligonükleotid sentezi için kullanılırsa, dekolte ve geri kazanım işlemi 25 ile 30 pmol arasında DNA verilmelidir. Bu nedenle sentez alanının %10'luk bir kullanımı sadece 3 pmol civarında DNA'yı karşılayacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg"> Şekil 1 . Mikrodizi fotolitografi ile oligonükleotid sentezinde kullanılan DNA ve RNA fosforamiditlerinin kimyasal yapıları. Standart nitrofenilpropiloksikarbonil (NPPOC) 5'-OH'da ışığa duyarlı koruma grupları hibridizasyon amacıyla düzenli DNA ve RNA mikrodizi sentezinde kullanılmaktadır. Kompleks DNA kütüphanelerinin sentezi için, 5'-OH'da daha fazla fotolabile benzyl-NPPOC (BzNPPOC) tercih edilir, çünkü BzNPPOC nppoc'dan iki kat daha hızlı çıkarılır ve bu da toplam mikrodizi sentez süresini önemli ölçüde azaltır. Kütüphaneler için DNA oligonükleotidler de 3 'sonunda bir dekolte dT monomer kaplin gerektirir. Succinyl ester fonksiyonu taşıyan bu monomer, deprotection sırasında cleaved olacak, DNA mikroçip toplanan için izin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg"> Şekil 2 . UV pozlama sırasında mikroayna cihazına gönderilen bir görüntü dosyası olarak maske örneği. Beyaz pikseller, "ON" pozisyonunda eğilecek aynalara karşılık gelir ve uv ışığını sentez hücresine yansıtır. Siyah pikseller , UV ışığının hücreden uzağa yansıtılabildiği "OFF" aynalarına karşılık gelir. Beyaz piksel bu nedenle cam yüzeylerde ilgili özellikleri bulunan oligonükleotidler üzerinde bir sonraki gelen fosforamidit kaplin için izin verecektir. Bu maske dosyasında, siyah pikseller bir sonraki bağlantı sırasında hareketsiz kalacaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg"> Şekil 3 . Mikrodizi fotolitografi optik ve sentez kurulum fotoğrafları. (A) UV ışınlarına maruz kalmak için optik devre. UV-LED'den gelen UV ışığı önce dikdörtgen-kesitışık borusu ile homojenize edilir, sonra mikroaynalara yansır. "KAPALI" konuma yatırılan mikroaynalar sentez hücresinden uzak UV ışığını yansıtır, ancak "AÇIK" konumundaki mikroaynalar, ilk olarak 1:1 Offner Rölesi'nden geçerek, odak düzleminde bulunan sentez hücresine ışığı yansıtacaktır. görüntüleme sistemi. (B) Sentez hücresi, bir kez monte edildikten sonra, kalın bir PTFE contası ile ayrılmış hücrenin kuvars bloğuna ilk yerleştirilen delinmiş bir slayttan oluşur (gösterilmez). İkinci, delinmemiş olmayan slayt daha sonra ince bir PTFE conta ile ayrılmış, delinmiş slayt üzerine konumlandırılır. Metal bir çerçeve (gösterilmez) montajı bir arada tutar. (C). Kütüphane hazırlama için, sentez hücresi gelen UV ışığının odak düzlemine bağlandıktan sonra, kuvars bloğu ile delinmiş kaydırak arasında yer alan oda, CH2Cl 2'deki β-karoten %1'lik bir çözelti ile doldurulur. Bunu yapmak için kuvars bloğuna ek bir giriş ve çıkış borusu eklenir ve turuncu çözelti en sağdan en sola doğru akar. Sentez için reaktiflerin ve çözücülerin akışı beyaz oklarla gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg"> Şekil 4 . Sentez alanı genellikle çıplak gözlegörülebilir. Burada, sentezden hemen sonra cam yüzeyde dna kütüphanesi görülebilir ve DNA hala korumalı formdadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg"> Şekil 5 . 25mer DNA ve RNA dizilerinin hibritizasyon tahlilleri mikrodiziler üzerinde yerinde sentezlenir. (A) Tüm melezlenmiş DNA ve RNA mikrodizifloresan floresan tkamı. 25mer DNA ve RNA oligonükleotidler Cy3 etiketli tamamlayıcı iplikçikleriyle melezlenmiştir. Dizi 5 μm çözünürlükte 532 nm uyarma dalga boyunda bir lazer ile tarandı. (B) DNA'nın floresan yoğunlukları (rasgele birimler:DNA ve RNA:DNA dubleksleri üç ayrı deneyde. Insitu sentezlenen RNA oligonükleotidler için açık yeşil veri suboptimal olarak kabul edilebilir, ilgili DNA dizilerinin floresan yoğunluğu ile karşılaştırıldığında. Hata çubukları SD'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg"> Şekil 6 . Mikrodiziler üzerinde sentezlenen DNA kütüphaneleri için dekoruma, dekolte ve kurtarma prosedürünün şematik gösterimi. DNA dizileri baza duyarlı bir dT nükleoziti üzerinde yetiştirilir (yakınlaştırılmış alanda gösterilir). Sentezden sonra, EDA/toluen'deki DNA oligonükleotidlerinin (baz koruma grupları kırmızı küreler olarak temsil edilir) korunmasından sonra, korumasız malzemeyi elektrostatik olarak yüzeye bağlı bırakır ve daha sonra az miktarda sentezlenen alana su. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg"> Şekil 7 . Temsili emici spektrum (220 - 350 nm) bir yarık, tuzsuz DNA kütüphanesi içeren 4.000 farklı dizileri, uzunluğu 100-nt. Toplam 940 ng DNA tek bir dizi sentezinden izole edildi, dna toplam 30 pmol veya cam substrat başına 15 pmol karşılık gelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg"> Tablo 1. 5'-BzNPPOC-dA'nın bağlantı/oksidasyon/fotodekoruma için temsili döngü protokolü, ilgili fosforamiditin "A" noktasına yüklendiğini varsayarsak. Kaplin süresi (saniye cinsinden) "çift monomer" satırında gösterilir. Uv fotodekoruma süresi, burada 3 J /cm2 (BzNPPOC fotokimya) parlak bir enerjiye karşılık gelen, iki "Olay 2 Out" iletişim sinyalleri arasında geçen süre olarak hesaplanır.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg"> Tablo 2. 5'-NPPOC-rA'nın bağlantı/oksidasyon/fotodekoruma için temsili döngü protokolü, ilgili RNA fosforamiditinin "A" noktasına yüklendiğini varsayarsak. Kaplin süresi (saniye cinsinden) "çift monomer" satırında gösterilir. Uv fotodekoruma süresi, burada 6 J /cm2 (NPPOC fotokimya) parlak bir enerjiye karşılık gelen, iki "Olay 2 Out" iletişim sinyalleri arasında geçen süre olarak hesaplanır.

Watch this Scientific Journal Video about High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries at JoVE.com

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Yüksek Yoğunluklu DNA ve RNA mikrodizileri - Fotolitografik Sentez, Hibridizasyon ve Büyük Nükleik Asit Kütüphanelerinin Hazırlanması

Bu makalede, yerinde üretilen nükleik asit mikrodizilerinin sentezi ve uygulamalarındaki yeni gelişmeleri sunmakta ve tartışıyoruz. Özellikle, DNA sentezi protokollerinin RNA'ya nasıl genişletilebileceğini ve mikrodizilerin geri alınabilir nükleik asit kitaplıkları oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

DNA ve RNA mikrodizileri nükleik asitler ve proteinler arasındaki etkileşimleri incelemek için çok yararlıdır, ama aynı zamanda sıra kitaplıklarının hazırlanması için uygun bir yöntemdir. Fotolitografi yüz binlerce benzersiz dizinin paralel olarak sentezlenmesine olanak sağlar ve şu anda mikrodiziler üzerinde RNA sentezi için tek doğrudan yöntemdir. Mikrodizilerin in situ fotolitografik sentezi de kimyasal olarak modifiye oligonükleotidlere genişletilebilir, örneğin peptit nükleik asitlerin iki ana floro su.Mikrodizi üretim ve işleme sürecini görmek, bu karmaşık makinenin bilinen standart katı faz DNA sentezinden nasıl geliştirildiğini anlamada yardımcı olabilir. Bu yordamı metin protokolünde açıklandığı gibi mikrodizi tasarımı ve slayt işlevselleştirmesi ile başlatın. DNA sentezleyici UV LED'ini ve soğutma fanını açın.Gelen UV ışığının odak noktasına bir UV yoğunluk ölçer takın ve açın. Bilgisayarda, WiCell Controller yazılımını başlatın. Mikromere cihazı açın ve başharfe çevirin.DMD'ye sağ tıklayıp yük görüntüsünü seçerek tüm beyaz maske dosyalarını yükleyin. UVS simgesine sağ tıklayın ve UV deklanşöraçık seçin. Yoğunluk ölçerdeki güç değerini okuyun ve 60 saniye sayın.60 saniye sonra güç değerini yeniden okuyun ve başlangıç ve bitiş değerlerini not edin. UV deklanşörünü seçerek deklanşörü kapatın ve yoğunluk ölçeri kapatın. Santimetre karemiliwatt ortalama UV yoğunluğu değerini hesaplayın.WiCell yazılımında, iş, sıra ve protokol dosyalarını kendi alt pencerelerine yükleyin ve sıra ve protokol dosyalarını DNA sentezleyicisine göndermek için gönder'i tıklatın. Sentez hücresini monte etmek için hücrenin kuvars bloğuna kalın bir perfloroelastomer conta yerleştirin. Daha sonra ilk contanın üzerine delinmiş, işlevsel leştirilmiş bir mikroskop kaydırağı yerleştirin ve slaytlar üzerindeki deliklerin sentez hücresinin giriş ve çıkış borusuyla bağlantı kurduğunu doğrulayın.İki deliği çevreleyen, delinmiş kaydırağın üzerine ikinci, ince bir politetrafloroetilen conta yerleştirin. Son olarak, ikinci conta üstüne ikinci, işlevsel ama delinmemiş slayt yerleştirin. Şimdi monte edilmiş çift substrat hücresinin üzerine 4 vidalı metal bir çerçeve yerleştirin Vidayı tork tornavida kullanarak aynı bağlama kuvvetine sıkın.Giriş ve çıkış tüplerini DNA sentezleyicisine takın. Asetonitril yıkama hattını asal olarak takın ve asetonitrilin yüzeylerden doğru akışını doğrulayın. Asetonitril priming yedi döngügeçtikten sonra atık hattında asetonitril hacmini ölçün.Bu hacim iki mililitre olmalıdır. Sentez hücresini gelen UV ışığının odak düzlemine takın. Kütüphane hazırlama durumunda, hücrenin arkasına ekstra bir giriş ve çıkış hattı takın ve arka odayı betakaroten çözeltisinin iki mililitresiyle doldurun.Önce WiCell yazılımında Çalıştır'a tıklayarak senteze başlayın. İş dosyasındaki ilk bekleme komutunda DNA sentezleyicisine basın. Düzenli mikrodizilerin sentezinden sonra, hücreyi synthesizer'dan ayırın ve hücreyi sökün.Sentez numarasını cam slaytlara takmak için elmas bir kalem kullanın. Her slaydın sentezedilmeyen yüzündeki sayıyı etch. Slaytları 50 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın ve daha fazla kullanıma kadar kurutulmuş bir alanda saklayın.Kütüphane mikrodizilerinin sentezinden sonra, önce betakaroten çözeltisini odadan boşaltın, sonra drenajdan önce beş mililitre metilen klorür dederek odayı iki kez yıkayın. DNA mikroarry deprotection için, etanol 20 mililitre ve EDA 20 mililitre ile boyama cam kavanoz doldurun. DNA'ya özel mikro diziliyi kavanoza dikey olarak yerleştirin, kapağı kapatın ve slaytları oda sıcaklığında iki saat boyunca korumak için bırakın.İki saat sonra, cımbız kullanarak slaytları alın ve çift distile su ile iyice durulayın. Bir kurutucu onları depolamadan önce birkaç saniye için bir mikrodizi santrifüj slaytlar kuru. RNA mikrodizi deprotection için, 50 mililitrelik santrifüj tüp 20 mililitre trietilamin ve 30 mililitre asetonitrile kuru bir çözüm hazırlamak.Santrifüj tüpüiçine bir RNA mikrodizi slayt aktarın, kapağı kapatın ve plastik sızdırmazlık filmi ile sarın. Yavaşça oda sıcaklığında bir saat ve 30 dakika boyunca bir orbital shaker üzerinde santrifüj tüp sallayın. Daha sonra, birkaç saniye mikrodizi santrifüj içinde kurutmadan önce 20 mililitre kuru asetonitril ile iki kez kaydırak çıkarın ve yıkayın.İlk deprotection adımını takiben RNA kaydırakları hidrazin hidrat çözeltisine aktarın, kapağı kapatın ve plastik sızdırmazlık filmi ile sarın. Bir yörünge shaker hafifçe sallayarak iki saat sonra, slayt çıkarın ve kuru asetonitril 20 mililitre ile iki kez yıkayın. Sonra birkaç saniye mikrodizi santrifüj kuru.Eğer RNA mikrodizi de DNA nükleotitleri içeriyorsa, üçüncü bir korumasız adım ile devam edin. 5 dakika oda sıcaklığında 5 dakika sonra bire bir EDA-etanol çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir tüpe DNA/RNA mikrodizisini ekleyin, kaydırağı çıkarın ve 20 mililitre steril suyla mikrodiziyi iki kez yıkayın. Bir mikrodizi santrifüj slayt kuru ve bir kurutucu saklayın.1.5 mililitrelik steril mikrosantrifüj tüpünde, metin protokolünde açıklandığı gibi Cy3 etiketli DNA içeren hibridizasyon tamponunu hazırlayın. Karışımı ve girdap çözeltisi. Hibritleştirme çözeltisinde her slayt ve pipet üzerine kendi kendine yapışkan 300 mikrolitre hibridizasyon odasını dikkatlice yerleştirin.Yapışkan nokta ile odanın delikleri kapak ve alüminyum folyo tüm slayt sarın. Mikrodizi kaydırağı hibridizasyon fırınına yerleştirin, kapağını kapatın ve seçilen hibridizasyon sıcaklığında iki saat boyunca yavaşça döndürülsün. İki saat sonra, slayt ı ayırın, alüminyum folyo kaldırmak, hibridizasyon çözeltisi pipet, ve dikkatle hibridizasyon odası yırtmak.Slaytları 30 mililitre Katı Olmayan Yıkama Tamponu içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında iki dakika şiddetle çalkalayın. Kaydırağı 30 mililitre Sıkı Yıkama Tamponu içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir dakika boyunca şiddetle sallayın.Son olarak, son yıkama tampon 30 mililitre içeren bir santrifüj tüp içine slayt aktarın. Birkaç saniye çalkalayın. Bir mikrodizi santrifüj slayt kuru.Şimdi, kuru mikrodiziyi, sentez alanını aşağı bakacak şekilde mikrodizi tarayıcının slayt tutucuya yerleştirin. DNA kitaplıklarını korumak ve ayırmak için, slaytı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne dekolte çözeltisine daldırın. Tüpü kapatın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca orbital shaker'da hafifçe dönmeden önce plastik sızdırmazlık filmi ile sarın.İki saat sonra, slaydı çıkarın ve havanın kurumasına izin vermeden önce 20 mililitre lik kuru asetonitile iki kez yıkayın. Bir pipet ile, şimdi fark sentez alanı üzerinde steril su 100 mikrolitre uygulayın. 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarmadan önce çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı borulayın.İşlemi tekrarlayın ve aynı tüp eluate mikrodizi birleştirmek. Talaşı buharlaştırArak kuruluk için elüat ve sonra nükleaz içermeyen H2O 10 mikrolitre içine yeniden çözünür. Burada gösterilen bir melezizasyon tahlili sonuçları 25mer dizisinin DNA ve RNA sürümleriiçeren bir mikrodizi üzerinde yapılan.Bu tsam, cy3 floresanının uyarma, emisyon spektrumuna karşılık gelen yeşil bir formatta görünür ve floresan yoğunluğu rasgele birimlerhalinde kaydedilir. Deneyler arasında mutlak floresan değerlerinde önemli değişkenlik vardır. Aynı üretim parametreleri ve aynı post-sentetik işleme kullanılarak üç bağımsız sentezin sonuçları gösterilmiştir.25mer DNA, tamamlayıcı Cy3 etiketli DNA iplikçik hibrid, floresan sinyalleri 20, 000 ila 30, 000 arasında değişen herhangi bir yerde, çok nadiren yukarıda veya altında verecektir. 25mer RNA, aynı Cy3 etiketli DNA komplemanı için hibridize edildiğinde, 15, 000 ila 20, 000 arasında değişen ilgili özellikleri floresan yoğunlukları verecektir. Ancak, RNA/DNA dublekslerinin floresan yoğunluğu zaman zaman 8,000'in altına düşer, buna karşılık gelen DNA/DNA dubleksleri 20, 000 ila 30, 000 aralığında floresan olacaktır.Bu gibi durumlarda, RNA sonuçları sub-optimal olarak kabul edilebilir. Diğer RNA tabanlı deneylerde olduğu gibi RNA mikrodizilerinin bozulmaya karşı hassas olduğunu ve steril koşullar altında ele alınması gerektiğini unutmamak gerekir. Mikrodizilerden toplanan nükleik asit kütüphaneleri DNA veya RNA diziliminde ve DNA'daki dijital bilgilerin kodlanmasında kullanılabilir.NED doğrudan bakılması gereken yoğun bir UV ışığı üretir. Bu nedenle, cihaz kullanımdayken koruyucu gözlük takmak tavsiye edilir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kaplama DNA sentezinin kinetiği<em&gt; İn Vitro</em&gt; Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

RNA sentezi 5-Bromouridine etiketleme ve Immunoprecipitation kullanarak incelenmesi

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...