Name: sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry
Uploaded: 2020-02-19T12:00:00
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我们感谢Ayumi Iizuka操作PESI-MS和KazukoSawa-nobori为她的秘书协助。我们感谢埃丹斯集团（www.edanzediting.com/ac）的布朗文·加德纳博士编辑了这份手稿的草稿。

山梨大学动物护理机构委员会批准了本文所述的所有协议和实验动物的使用。人工样本的使用得到了山梨大学机构伦理委员会的批准。
1. 固体组织制备
注：样品从动物或人体中取出后，必须保存在冰上，以保持组织的新鲜度。如果测量不立即进行解剖，建议将组织储存在-80°C。不建议将组织放在任何类型的缓冲液或盐水中，因为它们可能从组织中提取某?...

<ol>
	<li>Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+for+mass+spectrometry+of+large+biomolecules.">Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules.</a> Science. 246, 64-71 (1989).</li><li>Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-Assisted+Ultraviolet+Laser+Desorption+of+Non-Volatile+Compounds.">Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds.</a> International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).</li><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100000+by+laser+ionization+time-of+flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).</li><li>Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+probe+electrospray+using+a+solid+needle.">Development of probe electrospray using a solid needle.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+analysis+of+living+animals+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).</li><li>Balog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+tissue+identification+using+rapid+evaporative+ionization+mass+spectrometry.">Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry.</a> Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).</li><li>Boughton, B. A., Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+metabolite+profiling+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging.">Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).</li><li>Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-based+imaging+mass+spectrometry+revealed+abnormal+distribution+of+phospholipids+in+colon+cancer+liver+metastasis.">MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).</li><li>Sugiyama, E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+brain+gangliosides+using+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive+tissue+analysis+for+ex+vivo+and+in+vivo+cancer+diagnosis+using+a+handheld+mass+spectrometry+system.">Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system.</a> Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).</li><li>Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+drug+analysis+from+oral+fluid+using+swab+touch+spray+mass+spectrometry.">Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry.</a> Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+probe+electrospray+generated+from+a+solid+needle.">Characterization of probe electrospray generated from a solid needle.</a> Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. 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K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+biomolecules+from+solutions+with+high+concentration+of+salts+using+probe+electrospray+and+nano-electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+non-proximate+probe+electrospray+ionization+for+real-time+analysis+of+living+animal.">Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal.</a> Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+imaging+mass+spectrometry+by+electrospray+ionization+using+solid+needle+as+sampling+probe.">Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+in+analytical+oncology+-+Status+quo+of+mass+spectrometry-based+diagnostics+for+malignant+tumor.">Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor.</a> Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).</li><li>Hiraoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Component+profiling+in+agricultural+applications+using+an+adjustable+acupuncture+needle+for+sheath-flow+probe+electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).</li></ol>

虽然PESI是ESI的质谱4的衍生物，但它最有利于监测实时代谢组学，以及分析生化反应，而无需执行任何复杂或耗时的预处理5，14，15，17。它是一种简单和瞬时的质谱技术，可应用于生物体的集成状态。由于它不需要复杂的样品预处理级联，因此评估整个标本的分子组成的可能性要大?...

质谱（MS）是一种还原论的技术实现;它将分析对象减少到一个可以基于分子物种或级联解释的单位。因此，它是分析化学的一种代表性方法。它由四个过程组成：电电化、分析、检测和光谱采集。由于分子电电化是质谱学的第一个过程，它通常限制分析物的加工形式。大多数电电化过程都需要破坏有机样品的结构、形态和实时生物过程。例如，电喷雾电电化 （ESI） MS 要求样品处于液态，以便实现高效的电电1。因此，样品必须经过复杂的生化制备，从而改变分子的组成。另外，虽然基质辅助激光解吸电离（MALDI）MS可以重建薄切片组织2、3的分子图，但其电离效率太低，无法检测样品中的所有分子，在分析脂肪酸方面尤为差。考虑到这些限制，探针电喷电电（PESI）4可用于观察生物系统在原位的实时变化，而不会破坏结构完整性5，而被观测的生物体在技术上处于生存状态。在这种情况下，使用非常精细的针头，同时用作样品拾取器和辐射体。这意味着可以绕过复杂的样品预处理序列，以获得反映原位生命系统分子成分的质量光谱。
还有其他几种电电化方法与PESI-MS相媲美。一个是快速蒸发电电化质谱（REIMS）6。这种技术在手术中效果很好，因为它用电刀组装，并收集切口过程中产生的电羽。虽然REIMS对手术非常有用，但它本质上是一种破坏性方法，需要组织电消融。因此，在准备样品或实验室分析中，它对于细胞和组织的详细分析没有用处。此外，由于它收集了大量含有组织碎片的羽状物，因此每次使用后都需要对设备进行长时间的维护，从而将这种机器的使用限制在特殊的外科手术中。一种类似的方法，称为激光脱吸电团质谱法（LDI-MS）7，是另一种非侵入性的技术，对表面分析有用。由于该技术擅长扫描标本表面，因此实现了像MALDI成像质谱仪8、9等综合二维分析。然而，由于LDI-MS仅适用于表面分析，PESI-MS有利于分析样品，例如组织内的样品。另一种技术，MasSpec Pen10，据报道，在诊断甲状腺癌时达到高特异性和灵敏度，但探针的直径是毫米的，它是特定于表面分析，这意味着它不能检测癌症或深度局部病变的小结节。此外，由于该方法使用嵌入在探针笔中的微毛细管流管，因此必须考虑交叉污染，类似于 LDI-MS。其他技术已经应用于临床设置，如流动探针和电电化形式拭11，但它们并不普遍。
PESI 是 ESI 的极端小型化，其中纳米电喷的毛细管收敛在尖曲半径为几百 nm 的固体针上。电离发生在针尖的极限区，形成泰勒锥体，样品一直保留，直到尖端上所有液体的电离完成12。如果分析物停留在金属针尖上，则在金属针和分析物之间的界面处连续产生过量电荷。因此，分子的连续电电化取决于其表面活性。此属性使针尖成为一种色谱图，根据分析物的表面活动分离分析物。更从技术上讲，表面活性较强的分子会进入泰勒锥体表面，并且比表面活性较弱的分子更早电离，这些分子会粘附在针的表面直到电离过程结束。因此，所有被针拾取的分子完全电电化是13。此外，由于这种技术不涉及在样品中添加多余的溶剂，几百个飞升足以得到足够强的质谱，以便进一步分析14。这些特性有利于分析完整的生物样品。然而，PESI-MS 的一个主要缺点是电电位不连续，因为针沿垂直轴的往复运动类似于锯床。仅当孔孔的高度与水平轴对齐时，探头尖端达到最高点时才会发生电一合。当针拾取样品时，电电停止，因此电电化的稳定性不等于传统ESI。因此，PESI-MS 不是蛋白质组学的理想方法。
迄今为止，PESI-MS主要应用于生物系统的分析，涵盖从基础研究到临床环境的广泛领域。例如，对手术期间准备的人体组织的直接分析能够揭示出肾细胞癌15和咽癌16中三乙甘油的积累。这种方法还可以测量液体样品，如血液，以专注于脂质轮廓。例如，在兔子的饮食变化过程中，一些分子被划定;据介绍，其中一些分子在实验初期就减少了，表明该系统对临床诊断具有很高的灵敏度和实用性。此外，直接应用于活的动物允许在禁食5一晚后检测肝脏的生化变化。Zaitsu等人18日再次对实验5进行了重新实验，以几乎相同的方式分析了肝脏的代谢特征，结果增强了我们原始方法的稳定性和可重复性。此外，我们利用这项技术19区分小鼠的癌症组织与周围非癌性肝脏。因此，这是一种多功能质谱技术，在各种环境中（包括体内和体外）都很有用。从另一个角度来看，PESI 模块可以通过调整安装附件来适应各种质谱仪。在这篇短文中，我们介绍了应用的基本和示例（图1），包括带有活体动物的应用程序5。
根据每个国家的条例和法律，需要修订本议定书的某些部分，以满足每个机构的标准。应用于活生物体是最有趣和最具挑战性的，因为它可以在原位活动物的组织中或器官中提供生化或代谢变化。虽然这项申请在2013年得到了山梨大学动物护理机构委员会的批准，但由于最近动物实验法规的变更，现在需要再进行一轮批准。因此，对实验方案进行一些修改是可取的。关于实验中获得的质谱，考虑到每次测量之间的质谱波动，没有核苷酸测序界共有的光谱信息共享系统。操作者处理针头时必须小心，以避免针棒事故，尤其是在从针架上取下针头时。分离针头的特殊装置对于此用途非常有用。由于 PESI 模块的隔间是一个密封、封闭的腔室，因此，如果根据说明操作质谱仪，则不会发生电羽泄漏。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine (5-FdU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8791-25MG</td>
			<td>25mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable biposy punch (Trepan)</td>
			<td>kai Europa GmbH</td>
			<td>BP-30F</td>
			<td>bore size 3mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>extra pure reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>ver. 5.96, Data analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropestle</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>S13091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtube</td>
			<td>Treff</td>
			<td>982855</td>
			<td>0.5 mL clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>DPiMS-2020</td>
			<td>Mass spectrometer equipped with PESI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPGT solition</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ND</td>
			<td>Attached to DPiMS-2020</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry

质谱（MS）是分析化学中一种强有力的工具，因为它提供了非常准确的分子信息，如质量-电荷比（m/z），这些信息有助于推导分子量和结构。虽然它本质上是一种破坏性的分析方法，但环境电离技术的最新进展使我们能够获取数据，同时使组织在完整性方面处于相对完整的状态。探头电喷雾电化（PESI）是一种所谓的直接方法，因为它不需要对样品进行复杂而耗时的预处理。细针用作样品拾取器和电电化发射器。基于探针尖端非常尖锐和精细的特性，对样品的破坏是最小的，使我们能够从原地生物获取实时分子信息。在这里，我们介绍了PESI-MS技术的三个应用，这些应用对生物医学的研究和发展是有用的。一是固体组织的应用，是该技术在医学诊断中的基本应用。由于此技术只需要 10 毫克的样品，它可能在常规临床设置中非常有用。第二个应用是体外医学诊断，其中测量人血清。测量流体样品的能力在各种生物实验中也很有价值，因为无法为常规分析技术提供足够的样品量。第三个应用倾向于在活体动物中直接应用探针，我们可以在特定的器官中获得代谢物或药物的实时动力学。在每个应用中，我们可以推断MS检测到的分子，或者使用人工智能来获得医学诊断。

如图3所示，PESI-MS技术获得的数据是质谱，其m/z在此系统中的m/z范围为10至1，200。虽然可以检测到高达m/z 2，000 的分子，但使用这种技术在m/z 1，200 的质量范围内获得的峰值很少。因此，我们分析了从m/z 10 到 1，200 的峰值。m/z 800 和 900 周围有明显的山峰群;前者代表细胞膜成分，如磷脂酰胆碱（PC）种类，后者代表三...

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Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

本文介绍了一种基于环境质谱的独特实时分析方法的样品制备方法。这种方法使我们能够对体内的生物分子进行实时分析，无需任何特殊的预处理。

探头电喷电镀质谱的样品制备

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

因此，这是独特的环境质谱，特别适用于分析生物样品，包括体外和体内。由于这不需要定期对样品进行特殊的预处理，如细胞分馏、分馏和浓度，因此它可以分析一个样本，使生物成分损失最小，尤其是那些以非常少量存在的生物成分。此技术允许您通过质谱法在一分钟内直接分析原始组织材料。快速是系统鲁棒性不受阻碍，这是该技术固有的主要优势。所有你需要做的只是准备二氧化硅，10毫克的组织标本，和10微升的增殖。并把它们放进一次性墨盒里。它设置为 PESI-MS 计算机，几分钟后即可获得结果。通过选择适当的质谱仪，您可以注释分子标识。首先，从冰柜中取出肝脏或肾脏组织。在软木板上，用手术刀或刀将组织标本切成大约两两毫米。或者，用Trepan冲出样品，将柱的长度修剪到两毫米。如果组织被血液污染，用冰冷磷酸盐缓冲盐水短暂清洗。将大约 10 毫克的切口或冲孔样品放入塑料微管中，并加入 100 微升 50%乙醇。使用微甲虫使样品均质化。然后与移液器一起，将10微升的均质剂放入质谱仪的弹夹的井中。将墨盒放在直接探针电离质谱仪的电离室中，并安装用于样品电离的不锈钢针探针。牢固地合上室盖，自动激活安全装置。通过单击"开始"图标开始板机，使用屏幕面板分析，对针头施加 2.3 千伏的电压以生成电胶，并确保针头的频率为 3 赫兹。等待 30 秒钟，完成测量。测量每个样品后，将墨盒和针头处置在生物危害处置器中。要分析质谱，请打开与质谱仪相关的软件。单击软件的数据文件浏览器窗口中的 L-C-D 文件。选择单击质量谱窗口的单个峰值，并自动描绘 E-I-C。检查 T-I-C 和 E-I-C，然后单击平均频谱图标以选择生成质量谱的时间窗口范围。导出质量光谱文本数据。要分析体液，应绘制多达10微升的血清样本，并配入1.5毫升微管。将190微升50%乙醇加入管中，然后在室温下涡流两分钟。为了消除所有的红血球，在摄氏4度下将液体在15，000倍G下离心1至5分钟。将 10 微升的上一液转移到墨盒的井中，然后像以前一样在质谱仪上测量。该协议显示了固体样品、液体样品和活动物的PESI-MS样品制备。人类肾细胞癌显示中性脂质的特征峰。光谱中具有相对强的峰，其质量-电荷比为900，来自人类肾细胞癌组织，在周围非癌组织中未被识别。这些峰值主要代表三甲基甘油。在正常肝脏组织中获得的数据示例描述了慢性肝炎和肝硬化患者的肿瘤病变。利用PESI-MS对三个个体的人体血清进行了分析，个体的光谱模式存在明显差异。对于5-FdU内注射到小鼠尾血管中的代谢变化，在原位肝脏中实现了5-FdU钠的非常快速和灵敏的检测。由于针尖的深度从组织的网站，发挥最重要的电离作用，读取成功的数据采集，一定要按照说明。您可以通过查看商业数据库来识别分子物种。这是一种限定疾病分子机制的方法。许多研究人员对应用这种技术来预测疾病的繁荣及其预后感兴趣。特别是使用里基特活检。只要确保不要被探针刺破。使用用于从机器上取下针头的特定仪器可以简单地避免这种情况。

Research

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Biochemistry

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Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

使用液色谱结合串联质谱法对糖皮质酶细胞脂质的定量分析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

无目标液相色谱-质量光谱学-小麦粒基代谢代谢学分析

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...