Name: sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry
Uploaded: 2020-02-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

Vi takker Ayumi Iizuka for driften af PESI-MS og Kazuko Sawa-nobori for hendes sekretærbistand. Vi takker Bronwen Gardner, Ph.D., fra Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) for at redigere et udkast til dette manuskript.

Den institutionelle komité for dyrepleje ved Universitetet i Yamanashi godkendte alle protokoller og brugen af forsøgsdyr, der er angivet heri. Brugen af humane prøver blev godkendt af det institutionelle etiske råd ved Universitetet i Yamanashi.
1. Fremstilling af fast væv
BEMÆRK: Prøverne skal opbevares på is, efter at de er fjernet fra dyret eller menneskekroppen for at bevare vævets friskhed. Hvis målingerne ikke umiddelbart følger dissektion, anbefales...

<ol>
	<li>Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+for+mass+spectrometry+of+large+biomolecules.">Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules.</a> Science. 246, 64-71 (1989).</li><li>Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-Assisted+Ultraviolet+Laser+Desorption+of+Non-Volatile+Compounds.">Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds.</a> International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).</li><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100000+by+laser+ionization+time-of+flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).</li><li>Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+probe+electrospray+using+a+solid+needle.">Development of probe electrospray using a solid needle.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+analysis+of+living+animals+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).</li><li>Balog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+tissue+identification+using+rapid+evaporative+ionization+mass+spectrometry.">Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry.</a> Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).</li><li>Boughton, B. A., Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+metabolite+profiling+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging.">Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).</li><li>Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-based+imaging+mass+spectrometry+revealed+abnormal+distribution+of+phospholipids+in+colon+cancer+liver+metastasis.">MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).</li><li>Sugiyama, E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+brain+gangliosides+using+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive+tissue+analysis+for+ex+vivo+and+in+vivo+cancer+diagnosis+using+a+handheld+mass+spectrometry+system.">Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system.</a> Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).</li><li>Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+drug+analysis+from+oral+fluid+using+swab+touch+spray+mass+spectrometry.">Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry.</a> Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+probe+electrospray+generated+from+a+solid+needle.">Characterization of probe electrospray generated from a solid needle.</a> Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+and+exhaustive+ionization+of+analytes+with+different+surface+activity+by+probe+electrospray+ionization.">Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+renal+cell+carcinoma+as+a+first+step+for+mass+spectrometry-based+diagnostics.">Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).</li><li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+mass+spectra+database+and+diagnosis+algorithm+for+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).</li><li>Johno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+potential+new+biomarkers+of+atherosclerosis+by+probe+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 14, 38 (2018).</li><li>Zaitsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+endogenous+metabolite+analysis+of+mice+liver+by+probe+electrospray+ionization/triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry+and+its+preliminary+application+to+in+vivo+real-time+analysis.">Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis.</a> Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+diagnosis+of+chemically+induced+hepatocellular+carcinoma+using+a+novel+mass+spectrometry-based+technique.">Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique.</a> Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolic+reprogramming+in+hepatocellular+carcinoma.">Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma.</a> Cancers. 10, 447-461 (2018).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+biomolecules+from+solutions+with+high+concentration+of+salts+using+probe+electrospray+and+nano-electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+non-proximate+probe+electrospray+ionization+for+real-time+analysis+of+living+animal.">Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal.</a> Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+imaging+mass+spectrometry+by+electrospray+ionization+using+solid+needle+as+sampling+probe.">Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+in+analytical+oncology+-+Status+quo+of+mass+spectrometry-based+diagnostics+for+malignant+tumor.">Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor.</a> Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).</li><li>Hiraoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Component+profiling+in+agricultural+applications+using+an+adjustable+acupuncture+needle+for+sheath-flow+probe+electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).</li></ol>

Selv om PESI er et derivat af ESI for massespektrometri4, er det mest fordelagtigt at overvåge metabolomiiii realtid samt til analyse af biokemiske reaktioner uden at udføre komplekse eller tidskrævende præbehandlinger5,14,15,17. Det er en nem og øjeblikkelig massespektrometri teknik, der kan anvendes på den integrerede tilstand af levende organismer. Da det ikke k...

Massespektrometri (MS) er en teknologisk erkendelse af reduktionisme; det reducerer analyseformålet til en enhed, der kan fortolkes på grundlag af molekylære arter eller kaskader. Derfor er det en repræsentativ metode til analytisk kemi. Det består af fire processer: ionisering, analyse, detektion og spektrale erhvervelse. Fordi ionisering af molekylet er den første proces i massespektrometri, det generelt begrænser formen af analysander, der skal behandles. De fleste ioniseringsprocedurer kræver ødelæggelse af strukturen, morfologien og biologiske processer i realtid af økologiske prøver. F.eks. kræver elektrosprayionisering (ESI) MS, at prøverne er i flydende tilstand for effektiv ionisering1. Prøverne skal derfor gennemgå et komplekst biokemisk præparat, som ændrer molekylernes sammensætning. Alternativt, mens matrix-assisteret laser desorption ionisering (MALDI) MS kan rekonstruere molekylære kort over tynde opdeltvæv2,3,dens ionisering effektivitet er for lav til at opdage alle molekyler i prøverne, og det er særligt dårlig til at analysere fedtsyrer. I betragtning af disse begrænsninger, sonde elektrospray ionisering (PESI)4 kan bruges til at observere real-time ændringer i biologiske systemer in situ uden at ødelægge den strukturelle integritet5,mens den biologiske organisme observeres er teknisk i en levende tilstand. En meget fin nål bruges i dette tilfælde, der tjener samtidigsom prøvevælger og ionudleder. Det betyder, at de komplekse prøveforbehandlingssekvenser kan omgås for at opnå massespektre, der afspejler de molekylære komponenter i det levende system på stedet.
Der er flere andre ionisering metoder, rivaliserende PESI-MS. Den ene er hurtig fordampningsionisering massespektrometri (REIMS)6. Denne teknik fungerer godt under operationen, fordi det er samlet med en elektrisk kniv og indsamler ion røgfanen genereret under snit. Mens REIMS er meget nyttigt for operationen, det er hovedsagelig en destruktiv metode, der kræver elektrisk ablation af vævet. Det er derfor ikke nyttigt at foretage en detaljeret analyse af celler og væv i en præparativ prøve eller i laboratorieanalyser. Desuden, fordi det indsamler en stor mængde røgfanen, der indeholder vævsrester, det kræver langvarig vedligeholdelse af enhederne efter hver brug, hvilket begrænser brugen af denne maskine til særlige kirurgiske procedurer. En lignende metode, kaldet laser desorption ionisering massespektrometri (LDI-MS)7, er en anden teknik, der er noninvasive og nyttige for overfladen analyse. Fordi denne teknik er god til at scanne overfladen af en prøve, det opnår omfattende to-dimensionelle analyse som MALDI imaging masse spektrometri8,9. Da LDI-MS imidlertid kun finder anvendelse på overfladeanalysen, er PESI-MS en fordel ved at analysere prøverne f.eks. En anden teknik, MasSpec Pen10, blev rapporteret at opnå høj specificitet og følsomhed i diagnosticering af kræft i skjoldbruskkirtlen, men diameteren af sonden er i størrelsesordenen mm, og det er specifikt for overfladen analyse, hvilket betyder, at det ikke kan opdage små knuder af kræft eller dybt lokaliserede læsioner. Da denne metode desuden anvender en mikrokapillær strømkanal, der er indlejret i sondepennen, skal krydskontaminering tages i betragtning i lighed med LDI-MS. Andre teknikker findes, der er blevet anvendt til kliniske indstillinger, såsom flow sonde og ionisering form podning11, men de er ikke udbredt.
PESI er ekstrem miniaturisering af ESI, hvor kapillæren af nanoelektrosprayen konvergerer på en fast nål med en spidskrumningsradius på flere hundrede nm. Ionisering finder sted i det ekstremt begrænsede område af nålen spidsen ved at danne en Taylor kegle, hvor prøverne forbliver indtil ionisering af al væsken på spidsen er afsluttet12. Hvis analysanden forbliver på spidsen af metalnålen, genereres der kontinuerligt overskydende ladning på grænsefladen mellem metalnålen og analysanden. Derfor forekommer sekventiel ionisering af molekyler afhængigt af deres overfladeaktivitet. Denne egenskab gør nålespidsen til en slags kromatogram, der adskiller analysanden afhængigt af deres overfladeaktivitet. Mere teknisk, molekyler med den stærkere overflade aktivitet kommer til overfladen af Taylor kegle og er ioniseret tidligere end dem med svagere overflade aktivitet, som klæber til overfladen af nålen indtil udgangen af ioniseringsprocessen. Således opnås fuldstændig ionisering af alle molekyler, der er opfanget afnålen, 13. Desuden, fordi denne teknik ikke indebærer tilsætning af overflødige opløsningsmidler til prøven, flere hundrede femtoliter er tilstrækkelige til at få masse spektre stærk nok til yderligere analyse14. Disse egenskaber er fordelagtige for analysen af intakte biologiske prøver. En stor ulempe ved PESI-MS ligger imidlertid i diskontinuiteten i ioniseringen på grund af nålens stempelbevægelse langs den lodrette akse, svarende til en savemaskine. Ionisering finder kun sted, når sondens spids når det højeste punkt, når ionåbningens højde justeres på den vandrette akse. Ionisering ophører, mens nålen opfanger prøver, og så stabiliteten af ionisering er ikke lig med den i konventionelle ESI. Derfor er PESI-MS ikke en ideel metode til proteomics.
Til dato er PESI-MS hovedsagelig blevet anvendt på analyse af biologiske systemer, der dækker en bred vifte af områder fra grundforskning til kliniske miljøer. For eksempel, den direkte analyse af humant væv udarbejdet under operationen var i stand til at afsløre ophobning af triacylglycerol i både nyrecelle karcinom15 og svælg planocellulært karcinom16. Denne metode kan også måle flydende prøver, såsom blod, at fokusere på lipid profil. For eksempel er nogle molekyler blevet afgrænset under kostændringer hos kaniner; det blev rapporteret, at nogle af disse molekyler faldt på meget tidlige stadier af forsøgene, hvilket indikerer den høje følsomhed og nytte n i dette system til klinisk diagnose17. Endvidere, direkte anvendelse på et levende dyr tilladt påvisning af biokemiske ændringer i leveren efter blot en nat fastende5. Zaitsu et al.18 revurderede dette eksperiment5 og analyserede leverens metaboliske profiler på næsten samme måde, med resultater, der styrkede stabiliteten og reproducerbarheden af vores oprindelige metode. Desuden, Vi var i stand til at diskriminere kræftvæv fra omkringliggende ikke-kræft lever i mus ved hjælp af denne teknik19. Derfor er dette en alsidig massespektrometri teknik, der er nyttig i forskellige indstillinger, både in vivo og in vitro. Fra et andet synspunkt kan PESI-modulet laves, så det passer til forskellige massespektrometre ved at justere monteringstilbehøret. I denne korte artikel introducerer vi det grundlæggende og eksempler på anvendelser (figur 1), herunder anvendelser med levende dyr5.
I henhold til forordningerne og lovgivningen i hvert land skal dele af denne protokol revideres for at opfylde de enkelte institutioners kriterier. Anvendelse på den levende organisme er den mest interessante og udfordrende, fordi det kan give biokemiske eller metaboliske ændringer i væv eller organer i levende dyr in situ. Mens denne ansøgning blev godkendt af den institutionelle komité for dyrepleje ved Universitetet i Yamanashi, i 20135, en anden runde af godkendelse vil nu være nødvendig på grund af de seneste ændringer i reglerne for dyreforsøg. Flere ændringer i forsøgsordningen er derfor tilrådelige. Med hensyn til massespektre opnået i forsøg, under hensyntagen til udsving en masse spektre mellem hver måling i betragtning, er der ingen spektrale informationsdeling system, der er fælles for nukleotid sekventering samfund. Der skal udvises forsigtighed, når operatøren håndterer nålen for at undgå nålestiksulykker, især når nålen fjernes fra nåleholderen. En særlig anordning til at løsne nålen er meget nyttig til dette formål. Da PESI-modulets rum er et lufttæt, lukket kammer, opstår der ikke lækage af ionfjerdmen, hvis massespektrometeret betjenes i henhold til instruktionerne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine (5-FdU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8791-25MG</td>
			<td>25mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable biposy punch (Trepan)</td>
			<td>kai Europa GmbH</td>
			<td>BP-30F</td>
			<td>bore size 3mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>extra pure reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>ver. 5.96, Data analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropestle</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>S13091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtube</td>
			<td>Treff</td>
			<td>982855</td>
			<td>0.5 mL clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>DPiMS-2020</td>
			<td>Mass spectrometer equipped with PESI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPGT solition</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ND</td>
			<td>Attached to DPiMS-2020</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry

Massespektrometri (MS) er et kraftfuldt værktøj i analytisk kemi, fordi det giver meget præcise oplysninger om molekyler, såsom masse-til-ladning nøgletal(m / z), som er nyttige til at udlede molekylvægte og strukturer. Selv om det er hovedsagelig en destruktiv analytisk metode, de seneste fremskridt i den omgivende ionisering teknik har gjort det muligt for os at erhverve data, mens forlader væv i en relativt intakt tilstand med hensyn til integritet. Sonde elektrospray ionisering (PESI) er en såkaldt direkte metode, fordi det ikke kræver komplekse og tidskrævende forbehandling af prøver. En fin nål fungerer som en prøve vælger, samt en ionisering udleder. Baseret på den meget skarpe og fine egenskab af sonden tip, ødelæggelse af prøverne er minimal, giver os mulighed for at erhverve real-time molekylære oplysninger fra levende ting in situ. Heri introducerer vi tre anvendelser af PESI-MS teknik, der vil være nyttige for biomedicinsk forskning og udvikling. Den ene indebærer anvendelse på fast væv, som er den grundlæggende anvendelse af denne teknik til den medicinske diagnose. Da denne teknik kræver kun 10 mg af prøven, Det kan være meget nyttigt i de rutinemæssige kliniske indstillinger. Den anden ansøgning er til in vitro medicinsk diagnostik, hvor humant blod serum måles. Evnen til at måle væskeprøver er også værdifuld i forskellige biologiske forsøg, hvor der ikke kan fremlægges en tilstrækkelig mængde prøve til konventionelle analyseteknikker. Den tredje ansøgning læner sig mod direkte anvendelse af sonde nåle i levende dyr, hvor vi kan opnå real-time dynamik metabolitter eller lægemidler i specifikke organer. I hver ansøgning, Vi kan udlede de molekyler, der er blevet opdaget af MS eller bruge kunstig intelligens til at opnå en medicinsk diagnose.

Som vist i figur 3er de data, der er indhentet ved PESI-MS-teknikken, massespektre, hvis m/z varierer fra 10 til 1.200 i dette system. Mens man kan opdage molekyler op til m / z 2.000, der var få toppe opnået ved hjælp af denne teknik over masseområdet m / z 1.200. Derfor analyserede vi toppe fra m/ z 10 til 1.200. Der var iøjnefaldende grupper af toppe omkring m / z 800 og 900; førstnævnte repræsenterer ce...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Denne artikel introducerer prøveforberedelsesmetoder til en unik analysemetode i realtid baseret på det omgivende massespektrometri. Denne metode lader os udføre real-time analyse af de biologiske molekyler in vivo uden nogen særlige præbehandlinger.

Prøve forberedelse til Sonde Elektrospray Ionization Mass Spektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Så dette er unik omgivende massespektrometri, specielt velegnet til analyse af biologiske prøver, både in vitro og in vivo. Da dette ikke kræver regelmæssigt en særlig forbehandling af prøver, såsom cellesortering, fraktionering, og koncentration, det kan analysere en prøve med et minimum tab af biologiske komponenter, især dem, der findes som meget lille mængde. Denne teknik giver dig mulighed for at analysere råvævsmaterialer direkte i et minut ved massespektrometri.Hurtighed er uhindret i robusthed af systemet, vigtigste fordele forbundet med denne teknik. Alt du skal gøre er at bare for at forberede silica, 10 milligram væv prøve, og 10 mikroliter af formere sig. Og læg dem i engangspatron.Den er indstillet til PESI-MS-maskinen, og du får resultatet om et par minutter. Ved at vælge det passende massespektrometer kan du anmærke den molekylære identitet. Til at begynde, hente leveren eller nyrevæv fra fryseren.På en korkplade skæres vævsprøven til ca. to gange to gange to millimeter ved hjælp af en skalpel eller kniv. Alternativt kan du slå prøven ud med Trepan og trimme længden af kolonnen til to millimeter. Hvis vævet er forurenet med blod, vaskes kortvarigt med iskold fosfat-bufferet saltvand.Placer ca 10 milligram af snittet eller udstansede prøve i en plastik mikrorør og tilsæt 100 mikroliter af 50% ethanol. Brug en mikropestle til at homogenisere prøven. Derefter med pipetman, sted 10 mikroliter af homogenate i brønden af patronen af massespektrometeret.Placer patronen i ioniseringskammeret i Direct Probe Ionization Mass Spectrometer og installer den rustfri stjæle nålsonde, der vil blive brugt til prøveioniseringen. Luk kammerets låg fast for automatisk at aktivere sikkerhedsanordningen. Start den on-board computer ved at klikke på startikonet til at analysere, ved hjælp af on-screen paneler, anvende en spænding på 2,3 kilovolts til nålen til at generere elektrospray og sikre, at hyppigheden af nålen er tre hertz.Vent i 30 sekunder, før målingen er fuldført. Efter måling af hver prøve skal patronen og nålen bortskaffes i en bortskaffende beholder. For at analysere massespektrene skal du åbne den software, der er forbundet med massespektrometeret.Klik på L-C-D-filen i softwarens datafilbrowservindue. Hvis du vælger at klikke på en enkelt top i massespektretsvinduet, og du automatisk vil vise en E-I-C. Tjek T-I-C og E-I-C, og klik på det gennemsnitlige spektrum ikon for at vælge det interval af tid vindue til at generere massespektret.Eksportér massespektraltekstdataene. For at analysere kropsvæsker, udarbejde op til 10 mikroliter af serumprøven, og dispensere det i en 1,5 milliliter mikrorør. Tilsæt 190 mikroliter på 50% ethanol til røret, så vortex i to minutter ved stuetemperatur.For at fjerne alle røde blodlegemer, centrifuge væsken ved 15, 000 gange G i en til fem minutter ved fire grader Celsius. Overfør 10 mikroliter af supernatanten ind i patronens brønd og fortsæt med at måle på massespektrometeret som tidligere. Denne protokol viser prøveforberedelse til PESI-MS på fast prøve, flydende prøve og levende dyr.Humane renal celle karcinom viser karakteristiske toppe af neutrale lipider. Der var relativt stærke toppe i spektrene ved masse-til-afgift forholdet på 900 fra humant nyrecellekarcinomvæv, som ikke blev identificeret i det omgivende ikke-kræftvæv. Disse toppe repræsenterer hovedsageligt triacyl glycerol.Eksempel på data erhvervet i normale levervæv, afbildet neoplastisk læsion fra en patient med kronisk hepatitis og skrumpelever. Human serum fra tre personer blev analyseret ved hjælp af PESI-MS, der var klare forskelle i de spektrale mønstre blandt individerne. For de metaboliske ændringer i 5-FdU injiceres intravenøst i halen beholder af en mus, meget hurtig og følsom påvisning af 5-FdU med natrium adduct blev opnået i leveren in situ.Som dybden af nålen spidsen fra det sted, hvor vævet, spiller den vigtigste rolle i ionisering, der læser den vellykkede dataindsamling, skal du sørge for at følge instruktionerne. Du kan identificere de molekylære arter ved at kigge ind i den kommercielle database. Dette er en måde at kvalificere den molekylære mekanisme af sygdom.Mange forskere er blevet interesseret i anvendelsen af denne teknik til at forudsige velstand af sygdom, og det er prognose. Især ved hjælp af Ricket biopsi. Bare sørg for ikke at blive prikket af sonden nålen.Dette kan ganske enkelt undgås med et specifikt instrument til at fjerne nålen fra maskinen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation for Kvantitativ massespektrometri Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal forberedelse af Formalin fast prøver for peptid baseret Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation massespektrometri Imaging arbejdsprocesser

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray massespektrometri: En hurtig omgivende ionisering teknik til direkte vurdere metabolitter fra plantevæv

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En forberedelse til plasmaprøve til massespektrometri ved hjælp af en automatiseret arbejdsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...