Name: sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry
Uploaded: 2020-02-19T12:00:00
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Wir danken Ayumi Iizuka für den Betrieb der PESI-MS und Kazuko Sawa-nobori für ihre Sekretariatsunterstützung. Wir danken Bronwen Gardner, Ph.D., von der Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) für die Bearbeitung eines Entwurfs dieses Manuskripts.

Der institutionelle Ausschuss für Tierpflege an der Universität Yamanashi genehmigte alle hier genannten Protokolle und die Verwendung von Versuchstieren. Die Verwendung menschlicher Proben wurde von der institutionellen Ethikkommission der Universität Yamanashi genehmigt.
1. Feststoffpräparation
HINWEIS: Proben müssen nach ihrer Entfernung aus dem tierischen oder menschlichen Körper auf Eis gehalten werden, um die Frische des Gewebes zu erhalten. Wenn die Messu...

<ol>
	<li>Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+for+mass+spectrometry+of+large+biomolecules.">Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules.</a> Science. 246, 64-71 (1989).</li><li>Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-Assisted+Ultraviolet+Laser+Desorption+of+Non-Volatile+Compounds.">Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds.</a> International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).</li><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100000+by+laser+ionization+time-of+flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).</li><li>Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+probe+electrospray+using+a+solid+needle.">Development of probe electrospray using a solid needle.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+analysis+of+living+animals+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).</li><li>Balog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+tissue+identification+using+rapid+evaporative+ionization+mass+spectrometry.">Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry.</a> Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).</li><li>Boughton, B. A., Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+metabolite+profiling+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging.">Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).</li><li>Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-based+imaging+mass+spectrometry+revealed+abnormal+distribution+of+phospholipids+in+colon+cancer+liver+metastasis.">MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).</li><li>Sugiyama, E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+brain+gangliosides+using+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive+tissue+analysis+for+ex+vivo+and+in+vivo+cancer+diagnosis+using+a+handheld+mass+spectrometry+system.">Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system.</a> Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).</li><li>Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+drug+analysis+from+oral+fluid+using+swab+touch+spray+mass+spectrometry.">Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry.</a> Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+probe+electrospray+generated+from+a+solid+needle.">Characterization of probe electrospray generated from a solid needle.</a> Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+and+exhaustive+ionization+of+analytes+with+different+surface+activity+by+probe+electrospray+ionization.">Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+renal+cell+carcinoma+as+a+first+step+for+mass+spectrometry-based+diagnostics.">Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).</li><li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+mass+spectra+database+and+diagnosis+algorithm+for+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).</li><li>Johno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+potential+new+biomarkers+of+atherosclerosis+by+probe+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 14, 38 (2018).</li><li>Zaitsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+endogenous+metabolite+analysis+of+mice+liver+by+probe+electrospray+ionization/triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry+and+its+preliminary+application+to+in+vivo+real-time+analysis.">Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis.</a> Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+diagnosis+of+chemically+induced+hepatocellular+carcinoma+using+a+novel+mass+spectrometry-based+technique.">Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique.</a> Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolic+reprogramming+in+hepatocellular+carcinoma.">Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma.</a> Cancers. 10, 447-461 (2018).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+biomolecules+from+solutions+with+high+concentration+of+salts+using+probe+electrospray+and+nano-electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+non-proximate+probe+electrospray+ionization+for+real-time+analysis+of+living+animal.">Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal.</a> Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+imaging+mass+spectrometry+by+electrospray+ionization+using+solid+needle+as+sampling+probe.">Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+in+analytical+oncology+-+Status+quo+of+mass+spectrometry-based+diagnostics+for+malignant+tumor.">Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor.</a> Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).</li><li>Hiraoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Component+profiling+in+agricultural+applications+using+an+adjustable+acupuncture+needle+for+sheath-flow+probe+electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).</li></ol>

Obwohl PESI ein Derivat von ESI für die Massenspektrometrie4ist, ist es am vorteilhaftesten für die Überwachung von Echtzeit-Metabolomik, sowie für die Analyse biochemischer Reaktionen, ohne komplexe oder zeitaufwändige Vorbehandlungendurchzuführen 5,14,15,17. Es ist eine einfache und sofortige Massenspektrometrie-Technik, die auf den integrierten Zustand lebender ...

Massenspektrometrie (MS) ist eine technologische Erkenntnis des Reduktionismus; es reduziert das Analyseobjekt auf eine Einheit, die auf der Grundlage molekularer Arten oder Kaskaden interpretiert werden kann. Daher ist es eine repräsentative Methode der analytischen Chemie. Es besteht aus vier Prozessen: Ionisierung, Analyse, Detektion und spektrale Erfassung. Da die Ionisierung des Moleküls der erste Prozess in der Massenspektrometrie ist, schränkt es in der Regel die Form der zu verarbeitenden Analyten ein. Die meisten Ionisationsverfahren erfordern die Zerstörung der Struktur, Morphologie und echtzeitbiologischen Prozesse von organischen Proben. Beispielsweise erfordert die Elektrospray-Ionisation (ESI) MS, dass sich die Proben für eine effiziente Ionisierung in einem flüssigen Zustand befinden1. Proben müssen daher eine komplexe biochemische Zubereitung durchlaufen, die die Zusammensetzung von Molekülen verändert. Während die matrixgestützte Laserdesorptionsionisierung (MALDI) MS molekulare Karten von dünnem Schnittgeweberekonstruieren kann,istdieIonisationseffizienz zu gering, um alle Moleküle in den Proben zu erkennen, und es ist besonders schlecht bei der Analyse von Fettsäuren. Unter Berücksichtigung dieser Einschränkungen kann die Sondenelektrospray-Ionisation (PESI)4 verwendet werden, um die Echtzeit-Änderungen in biologischen Systemen in situ zu beobachten, ohne die strukturelle Integrität zu zerstören5, während sich der beobachtete biologische Organismus technisch in einem lebendigen Zustand befindet. In diesem Fall wird eine sehr feine Nadel verwendet, die gleichzeitig als Probenpflücker und Ionenemitter dient. Dies bedeutet, dass die komplexen Probenvorbehandlungssequenzen umgangen werden können, um Massenspektren zu erhalten, die die molekularen Komponenten des lebenden Systems in situ widerspiegeln.
Es gibt mehrere andere Ionisationsmethoden, die PESI-MS Konkurrenz machen. Eine davon ist die schnelle Verdunstungsionisationsmassenspektrometrie (REIMS)6. Diese Technik funktioniert gut während der Operation, weil sie mit einem elektrischen Messer montiert wird und die Ionenfahne sammelt, die während des Schnittes erzeugt wird. Während REIMS sehr nützlich für die Operation ist, ist es im Wesentlichen eine destruktive Methode, die die elektrische Ablation des Gewebes erfordert. Daher ist es nicht nützlich für die detaillierte Analyse von Zellen und Geweben in einer präparativen Probe oder in Laboranalysen. Darüber hinaus, weil es eine große Menge an Pflaumen sammelt, die Gewebeablagerungen enthalten, erfordert es eine lange Wartung der Geräte nach jedem Gebrauch, wodurch die Verwendung dieser Maschine auf spezielle chirurgische Verfahren beschränkt wird. Eine ähnliche Methode, die laserdesorptionionistionionization mass spectrometry (LDI-MS)7genannt wird, ist eine andere Technik, die nicht invasiv und nützlich für die Oberflächenanalyse ist. Da diese Technik gut beim Scannen der Oberfläche einer Probe ist, erreicht sie eine umfassende zweidimensionale Analyse wie die MALDI-Bildmassenspektrometrie8,9. Da LDI-MS jedoch nur auf die Oberflächenanalyse anwendbar ist, ist PESI-MS vorteilhaft für die Analyse der Proben z.B. innerhalb des Gewebes. Eine andere Technik, der MasSpec Pen10, wurde berichtet, um eine hohe Spezifität und Empfindlichkeit bei der Diagnose von Schilddrüsenkrebs zu erreichen, aber der Durchmesser der Sonde ist in der Größenordnung von mm und es ist spezifisch für die Oberflächenanalyse, was bedeutet, dass es nicht erkennen kann, kleine Knötchen von Krebs oder tief lokalisierte Läsionen. Da bei dieser Methode ein im Sondenstift eingebetteter Mikrokapillar-Durchflusskanal verwendet wird, muss die Kreuzkontamination, ähnlich wie Beil-MS, berücksichtigt werden. Es gibt andere Techniken, die auf klinische Umgebungen angewendet wurden, wie die Durchflusssonde und die Ionisationsform Tupfer11, aber sie sind nicht weit verbreitet.
PESI ist die extreme Miniaturisierung von ESI, wobei die Kapillare des Nanoelektrosprays auf einer festen Nadel mit einem Spitzenkrümmungsradius von mehreren hundert nm konvergiert. Die Ionisation erfolgt im extrem eingeschränkten Bereich der Nadelspitze durch Bildung eines Taylor-Kegels, auf dem Proben verbleiben, bis die Ionisierung der gesamten Flüssigkeit auf der Spitze abgeschlossen ist12. Bleibt der Analyt an der Spitze der Metallnadel, wird an der Schnittstelle zwischen metallener Nadel und den Analyten kontinuierlich eine Überladung erzeugt. Daher erfolgt die sequentielle Ionisierung von Molekülen in Abhängigkeit von ihrer Oberflächenaktivität. Diese Eigenschaft macht die Nadelspitze zu einer Art Chromatogramm, das die Analyten je nach Oberflächenaktivität trennt. Technisch gesehen kommen Moleküle mit der stärkeren Oberflächenaktivität an die Oberfläche des Taylor-Kegels und werden früher ionisiert als Moleküle mit schwächerer Oberflächenaktivität, die bis zum Ende des Ionisationsprozesses an der Oberfläche der Nadel haften. So wird eine vollständige Ionisierung aller Moleküle erreicht, die von der Nadel aufgenommen werden13. Da diese Technik nicht die Zugabe von überflüssigem Lösungsmittel in die Probe beinhaltet, reichen mehrere hundert Femtoliter aus, um Massenspektren stark genug für weitere Analysen zu erhalten14. Diese Eigenschaften sind vorteilhaft für die Analyse intakter biologischer Proben. Ein großer Nachteil von PESI-MS liegt jedoch in der Diskontinuität bei der Ionisierung aufgrund der Hubbewegung der Nadel entlang der vertikalen Achse, ähnlich einer Sägemaschine. Die Ionisierung findet nur statt, wenn die Spitze der Sonde den höchsten Punkt erreicht, wenn die Höhe der Ionenöffnung an der horizontalen Achse ausgerichtet ist. Die Ionisierung hört auf, während die Nadel Proben aufnimmt, und so ist die Stabilität der Ionisierung nicht gleich der des konventionellen ESI. Daher ist PESI-MS keine ideale Methode für Proteomik.
Bislang wurde PESI-MS hauptsächlich auf die Analyse biologischer Systeme angewandt, die ein breites Spektrum von Bereichen von der Grundlagenforschung bis hin zu klinischen Umgebungen abdecken. Zum Beispiel konnte die direkte Analyse des menschlichen Gewebes, das während der Operation vorbereitet wurde, die Ansammlung von Triacylglycerol sowohl bei Nierenzellkarzinom15 als auch bei Pharyngeal-Plattenkarzinom16aufdecken. Diese Methode kann auch flüssige Proben messen, wie Blut, um sich auf das Lipidprofil zu konzentrieren. Zum Beispiel wurden einige Moleküle während der Ernährungsumstellung bei Kaninchen abgegrenzt; Es wurde berichtet, dass einige dieser Moleküle in sehr frühen Stadien der Experimente abnahmen, was auf die hohe Empfindlichkeit und Nützlichkeit dieses Systems für die klinische Diagnose17hindeutet. Darüber hinaus ermöglichte die direkte Anwendung auf ein lebendes Tier den Nachweis biochemischer Veränderungen der Leber nach nur einer Fastennacht5. Zaitsu et al.18 besuchten dieses Experiment5 und analysierten die Stoffwechselprofile der Leber fast auf die gleiche Weise, mit Ergebnissen, die die Stabilität und Reproduzierbarkeit unserer ursprünglichen Methode verstärkten. Darüber hinaus konnten wir das Krebsgewebe aus der umgebenden nicht-kanzerösen Leber bei Mäusen mit dieser Technik unterscheiden19. Daher ist dies eine vielseitige Massenspektrometrie-Technik, die in verschiedenen Umgebungen nützlich ist, sowohl in vivo als auch in vitro. Aus einem anderen Blickwinkel kann das PESI-Modul durch Einstellen der Montagebefestigung für verschiedene Massenspektrometer geeignet werden. In diesem kurzen Artikel stellen wir die Grundlagen und Beispiele von Anwendungen vor (Abbildung 1), einschließlich Anwendungen mit lebenden Tieren5.
Gemäß den Vorschriften und Gesetzen in jedem Land müssen Teile dieses Protokolls überarbeitet werden, um die Kriterien der einzelnen Institutionen zu erfüllen. Die Anwendung auf den lebenden Organismus ist die interessanteste und herausforderndste, weil es biochemische oder metabolische Veränderungen in Geweben oder Organen bei lebenden Tieren in situ liefern kann. Während dieser Antrag vom institutionellen Ausschuss für Tierpflege an der Universität Yamanashi genehmigt wurde, wird 20135eine weitere Genehmigungsrunde notwendig sein, da die Vorschriften für die Tierversuche kürzlich geändert wurden. Daher sind mehrere Änderungen des Versuchsschemas ratsam. In Bezug auf die in Experimenten gewonnenen Massenspektren gibt es unter Berücksichtigung der Schwankungen der Massenspektren zwischen den einzelnen Messungen kein System für den Austausch spektraler Informationen, das der Nukleotid-Sequenzierungsgemeinschaft gemeinsam ist. Beim Umgang des Bedieners mit der Nadel ist vorsichtshalber, um Nadelstiche zu vermeiden, insbesondere beim Entfernen der Nadel aus dem Nadelhalter. Ein spezielles Gerät zum Lösen der Nadel ist sehr nützlich für diesen Zweck. Da es sich bei dem Fach des PESI-Moduls um eine luftdichte, geschlossene Kammer handelt, kommt es nicht zu Leckagen der Ionenfahne, wenn das Massenspektrometer gemäß den Anweisungen betrieben wird.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine (5-FdU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8791-25MG</td>
			<td>25mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable biposy punch (Trepan)</td>
			<td>kai Europa GmbH</td>
			<td>BP-30F</td>
			<td>bore size 3mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>extra pure reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>ver. 5.96, Data analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropestle</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>S13091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtube</td>
			<td>Treff</td>
			<td>982855</td>
			<td>0.5 mL clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>DPiMS-2020</td>
			<td>Mass spectrometer equipped with PESI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPGT solition</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ND</td>
			<td>Attached to DPiMS-2020</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry

Die Massenspektrometrie (MS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug in der analytischen Chemie, da es sehr genaue Informationen über Moleküle liefert, wie Z. B. Massen-Zu-Ladungs-Verhältnisse (m/z), die nützlich sind, um Molekulargewichte und -strukturen abzuleiten. Obwohl es sich im Wesentlichen um eine destruktive Analysemethode handelt, haben uns die jüngsten Fortschritte in der Umgebungsionisationstechnik ermöglicht, Daten zu erfassen, während wir Gewebe in einem relativ intakten Zustand in Bezug auf Integrität zurücklassen. Die Probeelektrospray-Ionisation (PESI) ist eine sogenannte direkte Methode, da sie keine komplexe und zeitaufwändige Vorbehandlung von Proben erfordert. Eine feine Nadel dient als Probenpflücker sowie als Ionisationsemitter. Basierend auf der sehr scharfen und feinen Eigenschaft der Sondenspitze ist die Zerstörung der Proben minimal, so dass wir die molekularen Echtzeitinformationen aus Lebewesen vor Ort erfassen können. Hierin stellen wir drei Anwendungen der PESI-MS-Technik vor, die für die biomedizinische Forschung und Entwicklung nützlich sein werden. Zum einen geht es um die Anwendung auf Festgewebe, die die grundlegende Anwendung dieser Technik für die medizinische Diagnose ist. Da diese Technik erfordert nur 10 mg der Probe, Es kann sehr nützlich in der Routine klinischen Einstellungen sein. Die zweite Anwendung betrifft die in vitro medizinische Diagnostik, bei der menschliches Blutserum gemessen wird. Die Fähigkeit, Flüssigkeitsproben zu messen, ist auch in verschiedenen biologischen Experimenten wertvoll, bei denen ein ausreichendes Probenvolumen für herkömmliche Analysetechniken nicht vorgesehen werden kann. Die dritte Anwendung neigt zur direkten Anwendung von Sondennadeln bei lebenden Tieren, wo wir Echtzeit-Dynamik von Metaboliten oder Medikamenten in bestimmten Organen erhalten können. In jeder Anwendung können wir die Moleküle ableiten, die von MS nachgewiesen wurden, oder künstliche Intelligenz verwenden, um eine medizinische Diagnose zu erhalten.

Wie in Abbildung 3dargestellt, sind die durch PESI-MS-Technik erhaltenen Daten die Massenspektren, deren m/z-Bereich in diesem System zwischen 10 und 1.200 liegt. Während man Moleküle bis zu m/z 2.000 erkennen kann, gab es mit dieser Technik nur wenige Spitzen über den Massenbereich von m/z 1.200. Daher haben wir Spitzen wertet von m/z 10 bis 1.200. Es gab auffällige Spitzengruppen um m/z 800 und 900; Erstere s...

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Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

In diesem Artikel werden Beispielvorbereitungsmethoden für eine einzigartige Echtzeitanalysemethode auf der Grundlage der Umgebungsmassenspektrometrie vorgestellt. Mit dieser Methode können wir die biologischen Moleküle in vivo in echtzeit ohne spezielle Vorbehandlungen analysieren.

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Es handelt sich also um eine einzigartige Umgebungsmassenspektrometrie, die sich besonders für die Analyse biologischer Proben sowohl in vitro als auch in vivo eignet. Da dies keine regelmäßige Vorbehandlung von Proben wie Zellsortierung, Fraktionierung und Konzentration erfordert, kann es eine Probe mit minimalem Verlust biologischer Komponenten analysieren, insbesondere solche, die als sehr kleine Menge vorhanden sind. Mit dieser Technik können Sie die Rohgewebematerialien direkt in einer Minute durch Massenspektrometrie analysieren.Schnelligkeit ist unbehindert in der Robustheit des Systems, Hauptvorteile dieser Technik inhärent. Alles, was Sie tun müssen, ist nur Kieselsäure vorzubereiten, 10 Milligramm Gewebe Probe, und 10 Mikroliter von Vermehrung. Und legen Sie sie in Einwegpatrone.Es ist auf den PESI-MS-Computer eingestellt, und Sie erhalten das Ergebnis in wenigen Minuten. Wenn Sie das entsprechende Massenspektrometer auswählen, können Sie die molekulare Identität kommentieren. Um zu beginnen, holen Sie die Leber oder Nierengewebe aus dem Gefrierschrank.Schneiden Sie die Gewebeprobe auf einer Korkplatte mit einem Skalpell oder Messer auf etwa zwei mal zwei mal zwei Millimeter. Alternativ können Sie die Probe mit dem Trepan ausstechen und die Länge der Säule auf zwei Millimeter trimmen. Wenn das Gewebe mit Blut kontaminiert ist, kurz mit eiskalter Phosphat-gepufferter Saline waschen.Etwa 10 Milligramm der geschnittenen oder ausgestanzten Probe in ein Kunststoff-Mikrorohr geben und 100 Mikroliter 50% Ethanol hinzufügen. Verwenden Sie ein Mikroschädling, um die Probe zu homogenisieren. Dann mit dem Pipettenmann 10 Mikroliter des Homogenats in den Brunnen der Patrone des Massenspektrometers legen.Legen Sie die Patrone in die Ionisationskammer des Direct Probe Ionization Mass Spectrometer und installieren Sie die Edelstahl-Steal-Nadelsonde, die für die Probenionisierung verwendet wird. Schließen Sie den Kammerdeckel fest, um die Sicherheitsvorrichtung automatisch zu aktivieren. Starten Sie den Bordcomputer, indem Sie auf das Startsymbol klicken, um mithilfe der Bildschirmpanels eine Spannung von 2,3 Kilovolt auf die Nadel anzuwenden, um das Elektrospray zu erzeugen und sicherzustellen, dass die Frequenz der Nadel drei Hertz beträgt.Warten Sie 30 Sekunden, bis die Messung abgeschlossen ist. Nach der Messung jeder Probe die Patrone und die Nadel in einem Biogefährdungsdeerlader entsorgen. Um die Massenspektren zu analysieren, öffnen Sie die Software, die mit dem Massenspektrometer verknüpft ist.Klicken Sie im Browserfenster der Datendatei der Software auf die Datei L-C-D. Klicken Sie auf eine einzelne Spitze des Massenspektrumfensters und stellen Sie automatisch ein E-I-C dar. Überprüfen Sie die T-I-C und E-I-C, und klicken Sie auf das Symbol des durchschnittlichen Spektrums, um den Bereich des Zeitfensters für die Erzeugung des Massenspektrums auszuwählen.Exportieren Sie die Massenspektraltextdaten. Um Körperflüssigkeiten zu analysieren, ziehen Sie bis zu 10 Mikroliter der Serumprobe und geben Sie sie in ein 1,5 Milliliter Mikrotube. 190 Mikroliter 50% Ethanol in die Röhre geben und dann bei Raumtemperatur zwei Minuten wirbeln.Um alle roten Blutkörperchen zu eliminieren, zentrieren Sie die Flüssigkeit bei 15.000 Mal G für ein bis fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie 10 Mikroliter des Überstandes in den Brunnen der Patrone und messen Sie wie bisher das Massenspektrometer. Dieses Protokoll zeigt die Probenvorbereitung für PESI-MS bei festen Proben, flüssigen Proben und lebenden Tieren.Das karzinom der menschlichen Nierenzell zeigt charakteristische Spitzen neutraler Lipide. Es gab relativ starke Spitzen in den Spektren beim Massen-Zu-Ladungs-Verhältnis von 900 aus dem menschlichen Nierenzellkarzinomgewebe, die im umgebenden nicht-kanzerösen Gewebe nicht identifiziert wurden. Diese Spitzen stellen hauptsächlich Triacylglycerin dar.Beispiel für Daten, die in normalen Lebergeweben erfasst wurden, zeigten die neoplastische Läsion eines Patienten mit chronischer Hepatitis und Leberzirrhose. Humanes Serum von drei Individuen wurde mit PESI-MS analysiert, es gab deutliche Unterschiede in den Spektralmustern zwischen den Individuen. Für die metabolischen Veränderungen in 5-FdU, die intravenely in das Schwanzgefäß einer Maus injiziert wurden, wurde ein sehr schneller und empfindlicher Nachweis von 5-FdU mit Natriumaddukt in der Leber in situ erreicht.Da die Tiefe der Nadelspitze von der Stelle des Gewebes, spielt die wichtigste Rolle bei der Ionisierung, die die erfolgreiche Datenerfassung liest, stellen Sie sicher, die Anweisungen zu befolgen. Sie können die molekularen Arten identifizieren, indem Sie sich die kommerzielle Datenbank ansehen. Dies ist ein Weg, um den molekularen Mechanismus der Krankheit zu qualifizieren.Viele Forscher haben sich für die Anwendung dieser Technik für die Vorhersage des Wohlstands von Krankheiten und es ist Prognose interessiert. Vor allem mit Ricket Biopsie. Achten Sie einfach darauf, nicht von der Sondennadel gestochen zu werden.Dies kann einfach mit einem speziellen Instrument zum Entfernen der Nadel aus der Maschine vermieden werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blatt-Spray-Massenspektrometrie: Eine schnelle Ambient Ionisation Technik direkt Metaboliten von Pflanzengewebe bewerten

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Eine Plasma-Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie mit einer automatisierten Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...