Name: sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry
Uploaded: 2020-02-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

אנו מודים לאיימי איאיזוקא על הפעלת ה-PESI-MS וקזוקו סאווה-נובורי לקבלת סיוע במזכירות. אנו מודים לברוון גרדנר, Ph.D., מקבוצת אדז (www.edanzediting.com/ac) לעריכת טיוטה של כתב יד זה.

הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת יאמאנאשי אישרה את כל הפרוטוקולים והשימוש בבעלי חיים ניסיוניים המובאים להלן. השימוש במדגם האנושי אושר על ידי מועצת האתיקה המוסדית באוניברסיטת יאמאנאשי.
1. הכנת רקמה מוצקה
הערה: יש לשמור את הדגימות על הקרח לאחר הסרת?...

<ol>
	<li>Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+for+mass+spectrometry+of+large+biomolecules.">Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules.</a> Science. 246, 64-71 (1989).</li><li>Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-Assisted+Ultraviolet+Laser+Desorption+of+Non-Volatile+Compounds.">Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds.</a> International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).</li><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100000+by+laser+ionization+time-of+flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).</li><li>Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+probe+electrospray+using+a+solid+needle.">Development of probe electrospray using a solid needle.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+analysis+of+living+animals+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).</li><li>Balog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+tissue+identification+using+rapid+evaporative+ionization+mass+spectrometry.">Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry.</a> Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).</li><li>Boughton, B. A., Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+metabolite+profiling+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging.">Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).</li><li>Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-based+imaging+mass+spectrometry+revealed+abnormal+distribution+of+phospholipids+in+colon+cancer+liver+metastasis.">MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).</li><li>Sugiyama, E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+brain+gangliosides+using+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive+tissue+analysis+for+ex+vivo+and+in+vivo+cancer+diagnosis+using+a+handheld+mass+spectrometry+system.">Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system.</a> Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).</li><li>Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+drug+analysis+from+oral+fluid+using+swab+touch+spray+mass+spectrometry.">Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry.</a> Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+probe+electrospray+generated+from+a+solid+needle.">Characterization of probe electrospray generated from a solid needle.</a> Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+and+exhaustive+ionization+of+analytes+with+different+surface+activity+by+probe+electrospray+ionization.">Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+renal+cell+carcinoma+as+a+first+step+for+mass+spectrometry-based+diagnostics.">Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).</li><li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+mass+spectra+database+and+diagnosis+algorithm+for+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).</li><li>Johno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+potential+new+biomarkers+of+atherosclerosis+by+probe+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 14, 38 (2018).</li><li>Zaitsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+endogenous+metabolite+analysis+of+mice+liver+by+probe+electrospray+ionization/triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry+and+its+preliminary+application+to+in+vivo+real-time+analysis.">Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis.</a> Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+diagnosis+of+chemically+induced+hepatocellular+carcinoma+using+a+novel+mass+spectrometry-based+technique.">Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique.</a> Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolic+reprogramming+in+hepatocellular+carcinoma.">Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma.</a> Cancers. 10, 447-461 (2018).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+biomolecules+from+solutions+with+high+concentration+of+salts+using+probe+electrospray+and+nano-electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+non-proximate+probe+electrospray+ionization+for+real-time+analysis+of+living+animal.">Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal.</a> Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+imaging+mass+spectrometry+by+electrospray+ionization+using+solid+needle+as+sampling+probe.">Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+in+analytical+oncology+-+Status+quo+of+mass+spectrometry-based+diagnostics+for+malignant+tumor.">Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor.</a> Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).</li><li>Hiraoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Component+profiling+in+agricultural+applications+using+an+adjustable+acupuncture+needle+for+sheath-flow+probe+electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).</li></ol>

למרות pesi הוא נגזרת של ESI עבור ספקטרומטר המסה4, זה היתרון ביותר עבור ניטור טבולומיקס בזמן אמת, כמו גם לניתוח התגובות הביוכימי מבלי לבצע כל הטיפולים מורכבים או הזמן לצרוך מראש5,14,15,17. זוהי טכניקה פשוטה ומיידית ?...

ספקטרומטר מסה (MS) הוא מימוש טכנולוגי של הרדונות; היא מקטינה את מטרת הניתוח ליחידה שניתן לפרש על בסיס מינים מולקולריים או מפלים. לכן, זוהי שיטה ייצוגית לכימיה אנליטית. הוא מורכב מארבעה תהליכים: אינון, ניתוח, גילוי ורכישה ספקטרלית. מכיוון שיינון של המולקולה הוא התהליך הראשון בספקטרומטר מסה, הוא בדרך כלל מגביל את צורת האנליטים שיעובדו. רוב ההליכים האינון דורשים השמדת מבנה, מורפולוגיה ותהליכים ביולוגיים בזמן אמת של דגימות אורגניות. לדוגמה, בתרסיס אלקטרונון (ESI) MS דורש כי הדגימות יהיו במצב נוזלי עבור אינון יעיל1. לפיכך, יש לעבור דוגמאות להכנה ביוכימית מורכבת, המשנה את הרכב המולקולות. לחילופין, בעוד באמצעות מטריקס באמצעות לייזר באמצעות desorption (maldi) MS יכול לשחזר מפות מולקולריות דקה רקמות מנות2,3, יעילות יינון שלה הוא נמוך מדי כדי לזהות את כל המולקולות בדגימות, והוא עני במיוחד בניתוח חומצות שומן. בהתחשב מגבלות אלה, בדיקת אלקטרונון בדיקה (PESI)4 ניתן להשתמש כדי להתבונן בזמן אמת שינויים במערכות ביולוגיות באתרו מבלי להרוס את השלמות המבנית5, בעוד האורגניזם הביולוגי להיות נצפתה הוא מבחינה טכנית במצב חי. מחט נאה מאוד משמשת במקרה זה, המשמש בו זמנית כבוחר לדוגמה ופולט יונים. משמעות הדבר היא כי המדגם מורכבים רצפים טרום טיפול ניתן עקף כדי לקבל ספקטרום מסה המשקפים את הרכיבים המולקולריים של מערכת החיים באתרו.
ישנן מספר שיטות אינון אחרות היריבות PESI-MS. האחד הוא מהיר הסלע אינון ספקטרומטר המסה (ריימס)6. טכניקה זו פועלת היטב במהלך הניתוח משום שהוא מורכב עם סכין חשמלי אוספת את הפלומה יון שנוצר במהלך החיתוך. בעוד ריימס הוא מאוד שימושי עבור הניתוח, זה ביסודו שיטה הרסנית הדורשת אבלציה חשמלי של הרקמה. לפיכך, היא אינה שימושית לניתוח מפורט של תאים ורקמות במדגם מוכן או בניתוחי מעבדה. יתר על כן, משום שהיא אוספת כמות גדולה של פלומה המכילה פסולת רקמות, זה דורש תחזוקה ממושכת של המכשירים לאחר כל שימוש, ובכך להגביל את השימוש במכונה זו הליכים כירורגיים מיוחדים. שיטה דומה, הנקראת לייזר הספקטרומטר המסה (LDI-MS)7, היא טכניקה נוספת שאינה פולשנית ושימושית עבור ניתוח פני השטח. מכיוון שטכניקה זו טובה בסריקת פני השטח של הדגימה, היא משיגה ניתוח דו מימדי כולל כגון הדמיה מלדית מיסה מאסיבית8,9. עם זאת, מכיוון LDI-MS חל רק על ניתוח פני השטח, PESI-MS הוא יתרון עבור ניתוח דגימות למשל, בתוך הרקמה. טכניקה נוספת, מספרט עט10, דווחה כדי להשיג ספציפיות ורגישות באבחון סרטן בלוטת התריס, אבל קוטרו של החללית הוא בסדר mm והוא ספציפי עבור ניתוח פני השטח, כלומר זה לא יכול לזהות גושים קטנים של סרטן או נגעים מקומי עמוק. כמו-כן, מאחר ששיטה זו משתמשת בתעלת זרימה מיקרוקפילר המוטבעת בעט המקדח, הזיהום הצולב חייב להילקח בחשבון, בדומה ל-LDI-MS. טכניקות אחרות קיימות שהוחלו על הגדרות קליניות, כגון בדיקת זרימה וטופס יינון בספוגית11, אבל הם לא נפוצים.
PESI הוא המזעור הקיצוני של ESI, שבו הנימים של הננו-electrospray ממיר על מחט מוצק עם עקמומיות טיפ רדיוס של כמה מאות ננומטר. אינון מתרחש באזור המוגבל ביותר של קצה המחט על ידי יצירת חרוט טיילור, על אילו דגימות להישאר עד אינון של כל הנוזלים על הקצה הוא השלים12. אם האנליטה נשאר על קצה המחט מתכת, עודף מטען הוא שנוצר ברציפות בממשק בין מחט מתכת לבין האנליטים. לכן, אינון סדרתי של מולקולות מתרחשת בהתאם לפעילות המשטח שלהם. מאפיין זה הופך את המחט טיפ סוג של chromatogram, הפרדת האנליטים בהתאם לפעילות המשטח שלהם. יותר מבחינה טכנית, מולקולות עם פעילות המשטח חזקה לבוא אל פני השטח של החרוט טיילור והם מוהים מוקדם יותר מאשר אלה עם פעילות משטח חלש, אשר לדבוק פני השטח של המחט עד סוף תהליך יונן. כך, אינון מלאה של כל המולקולות שנאספו על ידי המחט מושגת13. יתר על כן, כי טכניקה זו אינה כרוכה בתוספת של הממס המיותר למדגם, כמה מאות של ליטרים של נשים מספיקות כדי לקבל ספקטרום מסה חזק מספיק לניתוח נוסף14. מאפיינים אלה הם יתרון לניתוח של דגימות ביולוגיות שלמות. עם זאת, החיסרון העיקרי של PESI-MS טמון הרציפות באינון בגלל התנועה המעברת של המחט לאורך הציר האנכי, דומה מכונת ניסור. היינון מתרחש רק כאשר קצה הגשוש מגיע לנקודה הגבוהה ביותר כאשר גובה פתח היונים מיושר על הציר האופקי. אינון מפסיק בזמן שהמחט מרימה דגימות, ולכן היציבות של אינון אינה שווה לזו ב-ESI המקובלת. לכן, PESI-MS אינה שיטה אידיאלית עבור פרוטאומניקס.
עד היום, PESI-MS הוחל בעיקר על ניתוח של מערכות ביולוגיות, כיסוי מגוון רחב של שדות ממחקר בסיסי הגדרות קליניות. לדוגמה, הניתוח הישיר של רקמת האדם שהוכנו במהלך הניתוח היה מסוגל לחשוף את הצטברות של triacylglycerol הן קרצינומה של תאי הכליה15 ו קרצינומה של הלוע הלבן16. שיטה זו יכולה גם למדוד דגימות נוזל, כגון דם, כדי להתמקד בפרופיל השומנים. לדוגמה, מולקולות מסוימות כללו במהלך שינויים תזונתיים בארנבים; זה דווח כי כמה מולקולות אלה ירדו בשלבים מוקדמים מאוד של הניסויים, המציין את רגישות גבוהה והתועלת של מערכת זו עבור אבחון קליני17. יתרה מזאת, בקשה ישירה לבעלי חיים חיה אפשרה גילוי של שינויים ביוכימיים של הכבד לאחר לילה אחד של צום5. Zaitsu et al.18 בקרה זה ניסוי5 וניתח את פרופילי חילוף החומרים של הכבד כמעט באותו האופן, עם תוצאות שחיזקו את היציבות והתוכעות של השיטה המקורית שלנו. יתר על כן, הצלחנו להפלות את רקמת סרטן מתוך הכבד שמסביב סרטניים בעכברים באמצעות טכניקה זו19. לכן, זוהי טכניקה מגוונת של ספקטרומטר המסה השימושית בקביעות שונות, הן בvivo והן במבחנה. מנקודת מבט אחרת, ניתן להכניס את מודול PESI להתאמת מספר גדול של ספקטרומטר מסה על-ידי התאמת הקובץ המצורף הגובר. במאמר קצר זה, אנו מציגים את היסודות ודוגמאות של יישומים (איור 1), כולל יישומים עם חיות חיים5.
על פי התקנות והחוקים בכל מדינה, יש לסדר חלקים מפרוטוקול זה כדי לעמוד בקריטריונים של כל מוסד. היישום לאורגניזם החי הוא המעניין והמאתגר ביותר משום שהוא יכול לספק שינויים ביוכימיים או מטבוליים ברקמות או באיברים בבעלי חיים באתרו. בעוד שיישום זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת יאמאנאשי, בשנת 20135, סיבוב נוסף של אישור יהיה כעת הכרחי בגלל השינויים האחרונים בתקנות עבור ניסויים בבעלי חיים. לכן, מספר שינויים במזימה הניסיונית, מומלץ. לגבי הספקטרום ההמוני שהושג בניסויים, לקיחת תנודות של ספקטרום מסה בין כל מדידה לחשבון, אין מערכת שיתוף מידע ספקטרלי כי הוא משותף הקהילה הרצף נוקלאוטיד. הטיפול חייב להילקח כאשר המפעיל מטפל במחט כדי למנוע תאונות מקל המחט, במיוחד בעת הסרת המחט ממחזיק המחט. מכשיר מיוחד לניתוק המחט הוא מאוד שימושי למטרה זו. מאחר שהתא של מודול PESI הוא תא אטום, סגור, דליפה של הפלומה יון לא מתרחש אם ספקטרומטר המסה מופעל על פי ההוראות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine (5-FdU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8791-25MG</td>
			<td>25mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable biposy punch (Trepan)</td>
			<td>kai Europa GmbH</td>
			<td>BP-30F</td>
			<td>bore size 3mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>extra pure reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>ver. 5.96, Data analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropestle</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>S13091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtube</td>
			<td>Treff</td>
			<td>982855</td>
			<td>0.5 mL clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>DPiMS-2020</td>
			<td>Mass spectrometer equipped with PESI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPGT solition</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ND</td>
			<td>Attached to DPiMS-2020</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry

ספקטרומטר מסה (MS) הוא כלי רב עוצמה בכימיה אנליטית משום שהוא מספק מידע מדויק מאוד על מולקולות, כגון יחס מסה-לתשלום (m/z), אשר שימושיים להסיק משקולות ומבנים מולקולריים. בעוד שזוהי ביסודו שיטה אנליטית הרסנית, הפיתוחים האחרונים בטכניקת הסביבה הסביבתית אפשרו לנו לרכוש נתונים תוך השארת רקמות במצב שאינו שלם יחסית במונחים של יושרה. (PESI) הוא שיטה ישירה שנקראת כביכול, משום שהיא אינה דורשת טיפול מורכב וארוך-זמן של דגימות. מחט עדינה משמשת כבוחר לדוגמא, כמו גם פולט אינון. בהתבסס על המאפיין החריף והעדין של המכשיר, השמדת הדגימות היא מינימלית, המאפשרת לנו לרכוש מידע מולקולרי בזמן אמת מיצורים חיים באתרו. בזאת, אנו מציגים שלושה יישומים של טכניקת PESI-MS שיהיה שימושי עבור מחקר ופיתוח ביו-רפואי. אדם כרוך ביישום לרקמה מוצקה, שהיא היישום הבסיסי של טכניקה זו לאבחנה הרפואית. כמו טכניקה זו דורשת רק 10 מ"ג של המדגם, זה עשוי להיות מאוד שימושי הגדרות קליניות שגרתית. היישום השני הוא לאבחון רפואי מתורבת שבו סרום דם אנושי נמדד. היכולת למדוד דגימות נוזלים הוא גם בעל ערך בניסויים ביולוגיים שונים בהם נפח מספיק של מדגם עבור טכניקות אנליטיות קונבנציונאלי לא ניתן לספק. האפליקציה השלישית נשענת לעבר היישום הישיר של מחטי המחקר בבעלי חיים חיים, שם נוכל להשיג דינמיקה בזמן אמת של מטבוליטים או סמים באיברים ספציפיים. בכל יישום, אנו יכולים להסיק את המולקולות שזוהו על ידי MS או להשתמש באינטליגנציה מלאכותית כדי לקבל אבחנה רפואית.

כפי שתואר באיור 3, הנתונים המתקבלים מטכניקת PESI-MS הם הספקטרום ההמוני, שטווח ה- m/z שלו נע בין 10 ל-1,200 במערכת זו. בעוד אחד יכול לזהות מולקולות עד m/z 2,000, היו כמה פסגות שהתקבלו באמצעות טכניקה זו על הטווח ההמוני של m/z 1,200. לכן ניתחנו את הפסגות מ- m/z 10...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

מאמר זה מציג שיטות הכנה לדוגמה עבור שיטה אנליטית ייחודית בזמן אמת המבוססת על ספקטרומטר מסה סביבתי. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע ניתוח בזמן אמת של המולקולות הביולוגית בvivo ללא כל טיפול מיוחד.

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

לכן, זוהי ספקטרומטריית מסת סביבה ייחודית, המתאימה במיוחד לניתוח דגימות ביולוגיות, הן במבחנה והן במבחנה. מכיוון שזה אינו דורש באופן קבוע טיפול מקדים מיוחד של דגימות, כגון מיון תאים, שברים וריכוז, הוא יכול לנתח מדגם עם אובדן מינימלי של רכיבים ביולוגיים, במיוחד אלה הקיימים כמות קטנה מאוד. טכניקה זו מאפשרת לך לנתח את חומרי רקמת הגלם ישירות בדקה על ידי ספקטרומטריית מסה.המהירות היא ללא הפרעה החוסן של המערכת, היתרונות העיקריים הטבועים בטכניקה זו. כל מה שאתה צריך לעשות הוא רק כדי להכין סיליקה, 10 מיליגרם של דגימת רקמות, ו 10 microliters של להתרבות. ולשים אותם לתוך מחסנית חד פעמית.הוא מוגדר למכונת PESI-MS, ותקבל את התוצאה תוך מספר דקות. על ידי בחירת ספקטרומטר המסה המתאים, אתה יכול להוסיף ביאורים לזהות המולקולרית. כדי להתחיל, לאחזר את הכבד או רקמת הכליה מהמקפיא.על צלחת פקק, לחתוך את דגימת הרקמה על שניים על שניים על שני מילימטרים באמצעות אזמל או סכין. לחלופין, אגרוף את המדגם עם Trepan לקצץ את אורך העמודה לשני מילימטרים. אם הרקמה מזוהמת בדם, יש לשטוף בקצרה עם מלוחים קרים כקרח.מניחים כ -10 מיליגרם של דגימת החתך או אגרוף החוצה לתוך microtube פלסטיק ולהוסיף 100 microliters של 50% אתנול. השתמש micropestle כדי הומוגניזציה המדגם. ואז עם pipetman, למקם 10 microliters של homogenate לתוך הבאר של המחסנית של ספקטרומטר המסה.מניחים את המחסנית בתא היוניזציה של ספקטרומטר מסה יינון בדיקה ישירה ולהתקין את בדיקה מחט לגנוב אל חלד שישמש עבור יינון מדגם. סגור את מכסה התא בחוזקה כדי להפעיל באופן אוטומטי את התקן הבטיחות. הפעל את המחשב על הלוח על ידי לחיצה על סמל ההתחלה לנתח, באמצעות לוחות על המסך, להחיל מתח של 2.3 קילובולטים על המחט כדי ליצור את electrospray ולהבטיח כי התדירות של המחט הוא שלושה הרץ.המתן 30 שניות עד שהמדידה תושלם. לאחר מדידת כל דגימה, יש להשליך את המחסנית והמחט במנושל biohazard. כדי לנתח את ספקטרום המסה, פתח את התוכנה הקשורה לספקטרומטר המסה.לחץ על קובץ L-C-D בחלון דפדפן קובץ הנתונים של התוכנה. בחירה ללחוץ על שיא אחד של חלון ספקטרום המסה, ולתאר באופן אוטומטי E-I-C. בדוק את T-I-C ו- E-I-C, ולחץ על סמל הספקטרום הממוצע כדי לבחור את טווח הזמן ליצירת ספקטרום המסה.יצא את נתוני הטקסט הספקטרליים של המסה. כדי לנתח נוזלי גוף, יש להכין עד 10 מיקרוליטר של דגימת הסרום, ולחלק אותה למיקרו-צינור של 1.5 מיליליטר. מוסיפים 190 מיקרוליטרים של 50% אתנול לצינור, ואז מערבולת לשתי דקות בטמפרטורת החדר.כדי לחסל את כל תאי הדם האדומים, צנטריפוגה הנוזל ב 15, 000 פעמים G במשך 1 עד 5 דקות בארבע מעלות צלזיוס. להעביר 10 microliters של supernatant לתוך הבאר של המחסנית ולהמשיך למדוד על ספקטרומטר המסה כמו קודם לכן. פרוטוקול זה מציג הכנת מדגם עבור PESI-MS על מדגם מוצק, מדגם נוזלי, ובעלי חיים חיים.קרצינומה של תאי הכליה האנושיים מראה פסגות אופייניות של שומנים ניטרליים. היו פסגות חזקות יחסית בספקטרום ביחס מסה לטעינה של 900 מרקמה קרצינומה של תאי הכליה האנושיים שלא זוהו ברקמה הלא סרטנית שמסביב. פסגות אלה מייצגות בעיקר טריאצ'יל גליצרול.דוגמה לנתונים שנרכשו ברקמות כבד רגילות, תיארו את הנגע הניאופלסטי של חולה עם הפטיטיס כרונית ושחמת הכבד. סרום אנושי משלושה אנשים נותח באמצעות PESI-MS, היו הבדלים ברורים בדפוסים הספקטרליים בקרב האנשים. עבור השינויים המטבוליים ב 5-FdU מוזרק דרך הווריד לתוך כלי הזנב של העכבר, זיהוי מהיר מאוד ורגיש של 5-FdU עם adduct נתרן הושג בכבד במקום.כמו העומק של קצה המחט מאתר הרקמה, ממלא את התפקיד החשוב ביותר יינון שקורא את רכישת נתונים מוצלחת, הקפד לעקוב אחר ההוראות. אתה יכול לזהות את המין המולקולרי על ידי התבוננות במסד הנתונים המסחרי. זוהי דרך להכשיר את המנגנון המולקולרי של המחלה.חוקרים רבים הפכו מעוניינים ביישום של טכניקה זו לחיזוי השגשוג של המחלה וזה פרוגנוזה. במיוחד באמצעות ביופסיה של ריקט. רק תוודא שלא תידקר על ידי מחט הגשוש.זה יכול פשוט להימנע עם מכשיר מסוים להסרת המחט מהמכונה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

ספקטרומטר מסה של ספריי עלה: טכניקה מהירה יינון אמביינט להעריך ישירות מטבוליטים רקמות הצמח

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...