Name: sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry
Uploaded: 2020-02-19T12:00:00
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Ringraziamo Ayumi Iizuka per aver operato il PESANTE-MS e Kazuko Sawa-nobori per la sua assistenza di segreteria. Ringraziamo Bronwen Gardner, Ph.D., del Gruppo Edanz (www.edanzediting.com/ac) per aver redatto una bozza di questo manoscritto.

Il comitato istituzionale per la cura degli animali dell'Università di Yamanashi ha approvato tutti i protocolli e l'uso di animali sperimentali indicati nel presente documento. L'utilizzo del campione umano è stato approvato dal comitato etico istituzionale dell'Università di Yamanashi.
1. Preparazione del tessuto solido
NOTA: I campioni devono essere tenuti sul ghiaccio dopo la loro rimozione dal corpo animale o umano per preservare la freschezza del tessuto. Se ...

<ol>
	<li>Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+for+mass+spectrometry+of+large+biomolecules.">Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules.</a> Science. 246, 64-71 (1989).</li><li>Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-Assisted+Ultraviolet+Laser+Desorption+of+Non-Volatile+Compounds.">Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds.</a> International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).</li><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100000+by+laser+ionization+time-of+flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).</li><li>Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+probe+electrospray+using+a+solid+needle.">Development of probe electrospray using a solid needle.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+analysis+of+living+animals+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).</li><li>Balog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+tissue+identification+using+rapid+evaporative+ionization+mass+spectrometry.">Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry.</a> Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).</li><li>Boughton, B. A., Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+metabolite+profiling+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging.">Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).</li><li>Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-based+imaging+mass+spectrometry+revealed+abnormal+distribution+of+phospholipids+in+colon+cancer+liver+metastasis.">MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).</li><li>Sugiyama, E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+brain+gangliosides+using+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive+tissue+analysis+for+ex+vivo+and+in+vivo+cancer+diagnosis+using+a+handheld+mass+spectrometry+system.">Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system.</a> Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).</li><li>Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+drug+analysis+from+oral+fluid+using+swab+touch+spray+mass+spectrometry.">Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry.</a> Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+probe+electrospray+generated+from+a+solid+needle.">Characterization of probe electrospray generated from a solid needle.</a> Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+and+exhaustive+ionization+of+analytes+with+different+surface+activity+by+probe+electrospray+ionization.">Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+renal+cell+carcinoma+as+a+first+step+for+mass+spectrometry-based+diagnostics.">Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).</li><li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+mass+spectra+database+and+diagnosis+algorithm+for+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).</li><li>Johno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+potential+new+biomarkers+of+atherosclerosis+by+probe+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 14, 38 (2018).</li><li>Zaitsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+endogenous+metabolite+analysis+of+mice+liver+by+probe+electrospray+ionization/triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry+and+its+preliminary+application+to+in+vivo+real-time+analysis.">Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis.</a> Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+diagnosis+of+chemically+induced+hepatocellular+carcinoma+using+a+novel+mass+spectrometry-based+technique.">Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique.</a> Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolic+reprogramming+in+hepatocellular+carcinoma.">Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma.</a> Cancers. 10, 447-461 (2018).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+biomolecules+from+solutions+with+high+concentration+of+salts+using+probe+electrospray+and+nano-electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+non-proximate+probe+electrospray+ionization+for+real-time+analysis+of+living+animal.">Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal.</a> Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+imaging+mass+spectrometry+by+electrospray+ionization+using+solid+needle+as+sampling+probe.">Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+in+analytical+oncology+-+Status+quo+of+mass+spectrometry-based+diagnostics+for+malignant+tumor.">Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor.</a> Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).</li><li>Hiraoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Component+profiling+in+agricultural+applications+using+an+adjustable+acupuncture+needle+for+sheath-flow+probe+electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).</li></ol>

Anche se PESI è un derivato di ESI per la spettrometria di massa4, è più vantaggioso per il monitoraggio della metabolomica in tempo reale, così come per l'analisi delle reazioni biochimiche senza eseguire alcun pretrattamento complesso o dispendioso in termini di tempo5,14,15,17. È una tecnica di spettrometria di massa facile e istantanea che può essere applicata ...

La spettrometria di massa (MS) è una realizzazione tecnologica del riduzionismo; riduce l'oggetto dell'analisi a un'unità che può essere interpretata sulla base di specie molecolari o cascate. Pertanto, è un metodo rappresentativo di chimica analitica. È costituito da quattro processi: ionizzazione, analisi, rilevamento e acquisizione spettrale. Poiché la ionizzazione della molecola è il primo processo nella spettrometria di massa, generalmente limita la forma degli analiti da elaborare. La maggior parte delle procedure di ionizzazione richiedono la distruzione della struttura, della morfologia e dei processi biologici in tempo reale di campioni organici. Ad esempio, la ionizzazione dell'elettrospray (ESI) MS richiede che i campioni siano in uno stato liquido per una ionizzazione efficiente1. I campioni, quindi, devono passare attraverso una complessa preparazione biochimica, che altera la composizione delle molecole. In alternativa, mentre la SM per la desorptizione laser assistita da matrice può ricostruire mappe molecolari del tessuto sezionatosottile2,3, la sua efficienza di ionizzazione è troppo bassa per rilevare tutte le molecole nei campioni ed è particolarmente scarsa nell'analisi degli acidi grassi. Considerando queste limitazioni, la ionizzazione dell'elettrospray a sonda (PESI)4 può essere utilizzata per osservare i cambiamenti in tempo reale nei sistemi biologici in situ senza distruggere l'integrità strutturale5, mentre l'organismo biologico osservato è tecnicamente in uno stato vivente. In questo caso viene utilizzato un ago molto fine che funge simultaneamente da raccoglitore di campioni e come emettitore di ioni. Ciò significa che le complesse sequenze di pretrattamento del campione possono essere bypassate per ottenere spettri di massa che riflettano i componenti molecolari del sistema vivente in situ.
Ci sono diversi altri metodi di ionizzazione che rivaleggiano con PESI-MS. Uno è la spettrometria di massa evaporativa rapida evaporativa (REIMS)6. Questa tecnica funziona bene durante l'intervento chirurgico perché è assemblato con un coltello elettrico e raccoglie il pennacchio di ioni generato durante l'incisione. Mentre REIMS è molto utile per l'intervento chirurgico, è essenzialmente un metodo distruttivo che richiede l'ablazione elettrica del tessuto. Pertanto, non è utile per l'analisi dettagliata di cellule e tessuti in un campione preparativo o in analisi di laboratorio. Inoltre, poiché raccoglie una grande quantità di pennacchio contenente detriti tissutali, richiede una lunga manutenzione dei dispositivi dopo ogni utilizzo, limitando così l'uso di questa macchina a procedure chirurgiche speciali. Un metodo simile, chiamato spettrometria di massa di desorption laser desorption (LDI-MS)7, è un'altra tecnica che non è invasiva e utile per l'analisi della superficie. Poiché questa tecnica è efficace nella scansione della superficie di un campione, ottiene un'analisi bidimensionale completa come la spettrometria di massa di imaging MALDI8,9. Tuttavia, poiché LDI-MS è applicabile solo all'analisi della superficie, IL PESI-MS è vantaggioso per l'analisi dei campioni, ad esempio all'interno del tessuto. Un'altra tecnica, la MasSpec Pen10, è stata segnalata per ottenere un'elevata specificità e sensibilità nella diagnosi del cancro della tiroide, ma il diametro della sonda è nell'ordine di mm ed è specifico per l'analisi della superficie, il che significa che non è in grado di rilevare piccoli noduli di cancro o lesioni profondamente localizzate. Inoltre, poiché questo metodo utilizza un canale di flusso microcapillare incorporato nella penna della sonda, la contaminazione incrociata deve essere presa in considerazione, in modo simile a LDI-MS. Esistono altre tecniche che sono state applicate a impostazioni cliniche, come la sonda di flusso e il modulo di ionizzazione tamponato11, ma non sono diffusi.
IL PESI è la miniaturizzazione estrema dell'ESI, in cui il capillare del nano-elettrospray converge su un ago solido con un raggio di curvatura della punta di diverse centinaia di nm. La ionizzazione avviene nell'area estremamente ristretta della punta dell'ago formando un cono Taylor, su cui rimangono campioni fino a quando la ionizzazione di tutto il fluido sulla punta è completata12. Se l'analita rimane sulla punta dell'ago metallico, la carica in eccesso viene continuamente generata all'interfaccia tra l'ago metallico e gli analiti. Pertanto, la ionizzazione sequenziale delle molecole si verifica a seconda della loro attività superficiale. Questa proprietà rende l'ago punta una sorta di cromatogramma, separando gli analiti a seconda della loro attività superficiale. Più tecnicamente, le molecole con l'attività superficiale più forte arrivano alla superficie del cono Taylor e vengono ionizzate prima di quelle con un'attività superficiale più debole, che aderiscono alla superficie dell'ago fino alla fine del processo di ionizzazione. Così, la ionizzazione completa di tutte le molecole raccolte dall'ago è raggiunto13. Inoltre, poiché questa tecnica non comporta l'aggiunta di solvente superfluo al campione, diverse centinaia di femtolitri sono sufficienti per ottenere spettri di massa abbastanza forti per ulteriori analisi14. Queste proprietà sono vantaggiose per l'analisi di campioni biologici intatti. Tuttavia, uno svantaggio maggiore dell'AMM risiede nella discontinuità nella ionizzazione a causa del movimento reciproco dell'ago lungo l'asse verticale, simile a una macchina di segatura. La ionizzazione avviene solo quando la punta della sonda raggiunge il punto più alto quando l'altezza dell'orifizio io. La ionizzazione cessa mentre l'ago raccoglie i campioni, e quindi la stabilità della ionizzazione non è uguale a quella nell'ESI convenzionale. Pertanto, IL PESI-MS non è un metodo ideale per la proteomica.
Ad oggi, IL PESI-MS è stato applicato principalmente all'analisi dei sistemi biologici, coprendo un'ampia gamma di campi, dalla ricerca di base agli ambienti clinici. Ad esempio, l'analisi diretta del tessuto umano preparato durante l'intervento è stato in grado di rivelare l'accumulo di triacylglycerolo sia nel carcinoma a cellule renali15 che nel carcinoma squamoso pharyeal16. Questo metodo può anche misurare campioni liquidi, come il sangue, per concentrarsi sul profilo lipidico. Ad esempio, alcune molecole sono state delineate durante i cambiamenti dietetici nei conigli; è stato riferito che alcune di queste molecole sono diminuite nelle fasi molto iniziali degli esperimenti, indicando l'elevata sensibilità e utilità di questo sistema per la diagnosi clinica17. Inoltre, l'applicazione diretta ad un animale vivente ha permesso la rilevazione di cambiamenti biochimici del fegato dopo appena una notte di digiuno5. Questo esperimento 5 harivisitato questo esperimento5 e ha analizzato i profili metabolici del fegato quasi allo stesso modo, con risultati che hanno rafforzato la stabilità e la riproducibilità del nostro metodo originale. Inoltre, siamo stati in grado di discriminare il tessuto tumorale dal fegato non canceroso circostante nei topi utilizzando questa tecnica19. Pertanto, si tratta di una tecnica di spettrometria di massa versatile che è utile in vari ambienti, sia in vivo che in vitro. Da un altro punto di vista, il modulo può essere realizzato per adattarsi a vari spettrometri di massa regolando l'attacco di montaggio PESI. In questo breve articolo vengono presentate le nozioni di base e gli esempi di applicazioni (Figura 1), incluse le applicazioni con animali viventi5.
Secondo i regolamenti e le leggi di ciascun paese, parti di questo protocollo dovranno essere riviste per soddisfare i criteri di ciascuna istituzione. L'applicazione all'organismo vivente è la più interessante e stimolante perché può fornire cambiamenti biochimici o metabolici nei tessuti o negli organi negli animali viventi in situ. Mentre questa domanda è stata approvata dal comitato istituzionale per la cura degli animali presso l'Università di Yamanashi, nel 20135, un altro ciclo di approvazione sarà ora necessario a causa dei recenti cambiamenti nelle normative per gli esperimenti sugli animali. Sono pertanto consigliabili apportare diverse modifiche al regime sperimentale. Per quanto riguarda gli spettri di massa ottenuti negli esperimenti, tenendo conto delle fluttuazioni degli spettri di massa tra ogni misurazione, non esiste un sistema di condivisione delle informazioni spettrali comune alla comunità di sequenziamento dei nucleotidi. La cura deve essere presa quando l'operatore gestisce l'ago per evitare incidenti aghi, soprattutto quando si rimuove l'ago dal supporto dell'ago. Un dispositivo speciale per staccare l'ago è molto utile per questo scopo. Poiché il compartimento del modulo PESI è ermetico, la perdita del pennacchio ionica non si verifica se lo spettrometro di massa viene azionato secondo le istruzioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine (5-FdU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8791-25MG</td>
			<td>25mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable biposy punch (Trepan)</td>
			<td>kai Europa GmbH</td>
			<td>BP-30F</td>
			<td>bore size 3mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>extra pure reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>ver. 5.96, Data analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropestle</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>S13091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtube</td>
			<td>Treff</td>
			<td>982855</td>
			<td>0.5 mL clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>DPiMS-2020</td>
			<td>Mass spectrometer equipped with PESI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPGT solition</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ND</td>
			<td>Attached to DPiMS-2020</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry

La spettrometria di massa (MS) è un potente strumento nella chimica analitica perché fornisce informazioni molto accurate sulle molecole, come i rapporti massa-carica (m/z), utili per dedurre pesi e strutture molecolari. Mentre è essenzialmente un metodo analitico distruttivo, recenti progressi nella tecnica di ionizzazione ambientale ci hanno permesso di acquisire dati lasciando il tessuto in uno stato relativamente intatto in termini di integrità. La ionizzazione dell'elettrospray a sonda (PESI) è un cosiddetto metodo diretto perché non richiede un pretrattamento complesso e dispendioso in termini di tempo dei campioni. Un ago sottile funge da raccoglitore campione, nonché come emettitore di ionizzazione. Sulla base della proprietà molto nitida e fine della punta della sonda, la distruzione dei campioni è minima, permettendoci di acquisire le informazioni molecolari in tempo reale da esseri viventi in situ. Qui, introduciamo tre applicazioni della tecnica PESI-MS che saranno utili per la ricerca e lo sviluppo biomedico. Uno riguarda l'applicazione al tessuto solido, che è l'applicazione di base di questa tecnica per la diagnosi medica. Poiché questa tecnica richiede solo 10 mg del campione, può essere molto utile nelle impostazioni cliniche di routine. La seconda applicazione è per la diagnostica medica in vitro in cui viene misurato il siero del sangue umano. La capacità di misurare campioni di liquidi è preziosa anche in vari esperimenti biologici in cui non è possibile fornire un volume sufficiente di campione per le tecniche analitiche convenzionali. La terza applicazione si appoggia verso l'applicazione diretta di aghi sonda in animali viventi, dove possiamo ottenere la dinamica in tempo reale di metaboliti o farmaci in organi specifici. In ogni applicazione, possiamo dedurre le molecole che sono state rilevate dalla SM o utilizzare l'intelligenza artificiale per ottenere una diagnosi medica.

Come illustrato nella Figura 3, i dati ottenuti dalla tecnica DEI PESI-MS sono gli spettri di massa, la cui gamma m/z va da 10 a 1.200 in questo sistema. Mentre si possono rilevare molecole fino a m/z 2.000, ci sono stati pochi picchi ottenuti utilizzando questa tecnica sulla gamma di massa di m/z 1.200. Pertanto, abbiamo analizzato picchi da m/z 10 a 1.200. C'erano gruppi cospicui di picchi intorno m/z 800 e 900; ...

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Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Questo articolo introduce metodi di preparazione di esempio per un metodo analitico unico in tempo reale basato sulla spettrometria di massa ambientale. Questo metodo ci permette di eseguire analisi in tempo reale delle molecole biologiche in vivo senza particolari pretrattamenti.

Preparazione del campione per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quindi, questa è una spettrometria di massa ambientale unica, particolarmente adatta per l'analisi di campioni biologici, sia in vitro che in vivo. Poiché ciò non richiede regolarmente uno speciale pretrattamento di campioni, come lo smistamento cellulare, il frazionamento e la concentrazione, può analizzare un campione con perdita minima di componenti biologici, specialmente quelli che esistono come quantità molto piccola. Questa tecnica consente di analizzare le materie prime direttamente in un minuto mediante spettrometria di massa.La rapidità è senza resistenza nel sistema, i principali vantaggi inerenti a questa tecnica. Tutto quello che devi fare è solo preparare silice, 10 milligrammi di campioni di tessuti e 10 microlitri di proliferano. E mettili in una cartuccia usa e getta.È impostato sulla macchina PESI-MS e otterrai il risultato in pochi minuti. Scegliendo lo spettrometro di massa appropriato, è possibile annotare l'identità molecolare. Per iniziare, recuperare il fegato o il tessuto renale dal congelatore.Su una piastra di sughero, tagliare il campione di tessuto a circa due per due per due millimetri usando un bisturi o un coltello. In alternativa, punzonare il campione con il Trepan e tagliare la lunghezza della colonna a due millimetri. Se il tessuto è contaminato dal sangue, lavare brevemente con soluzione salina tamponata da fosfati ghiacciati.Posizionare circa 10 milligrammi del campione tagliato o perforato in un microtubo di plastica e aggiungere 100 microlitri di 50%etanolo. Utilizzare una micropestola per omogeneizzare il campione. Quindi, con il pipettaio, posizionare 10 microlitri dell'omogeneato nel pozzo della cartuccia dello spettrometro di massa.Posizionare la cartuccia nella camera di ionizzazione dello spettrometro di massa di ionizzazione a sonda diretta e installare la sonda dell'ago di furto inossidabile che verrà utilizzata per la ionizzazione del campione. Chiudere saldamente il coperchio della camera per attivare automaticamente il dispositivo di sicurezza. Avviare il computer di bordo facendo clic sull'icona di avvio per analizzare, utilizzando i pannelli sullo schermo, applicare una tensione di 2,3 kilovolt all'ago per generare l'elettrospray e assicurarsi che la frequenza dell'ago sia di tre hertz.Attendere 30 secondi per il completamento della misurazione. Dopo aver misurato ogni campione, smaltire la cartuccia e l'ago in uno smaltitore a rischio biologico. Per analizzare gli spettri di massa, aprire il software associato allo spettrometro di massa.Fare clic sul file L-C-D nella finestra del browser dei file di dati del software. Scegliere di fare clic su un singolo picco della finestra dello spettro di massa e di rappresentare automaticamente un E-I-C. Controllare il T-I-C e l'E-I-C e fare clic sull'icona dello spettro medio per selezionare l'intervallo di tempo per generare lo spettro di massa.Esportare i dati di testo spettrale di massa. Per analizzare i fluidi corporei, disegnare fino a 10 microlitri del campione di siero e disrogarlo in un microtubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 190 microlitri di 50% di etanolo al tubo, quindi vortice per due minuti a temperatura ambiente.Per eliminare tutti i globuli rossi, centrifugare il liquido a 15.000 volte G per uno o cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 10 microlitri del supernatante nel pozzo della cartuccia e procedere a misurare sullo spettrometro di massa come in precedenza. Questo protocollo mostra la preparazione del campione per PESI-MS su campione solido, campione liquido e animale vivente.Il carcinoma a cellule renali umane mostra picchi caratteristici di lipidi neutri. Ci sono stati picchi relativamente forti negli spettri al rapporto massa-carica di 900 dal tessuto carcinoma a cellule renali umane che non sono stati identificati nel tessuto non canceroso circostante. Questi picchi rappresentano principalmente il glicerolo triacile.Esempi di dati acquisiti nei normali tessuti epatici, hanno raffigurato la lesione neoplastica di un paziente con epatite cronica e cirrosi epatica. Il siero umano di tre individui è stato analizzato usando PESI-MS, c'erano chiare differenze nei modelli spettrali tra gli individui. Per i cambiamenti metabolici in 5-FdU iniettati per via endovene nel vaso di coda di un topo, è stato ottenuto un rilevamento molto rapido e sensibile di 5-FdU con addotto di sodio nel fegato in situ.Poiché la profondità della punta dell'ago dal sito del tessuto, svolge il ruolo più importante nella ionizzazione che legge l'acquisizione dei dati di successo, assicurati di seguire le istruzioni. È possibile identificare le specie molecolari esaminando il database commerciale. Questo è un modo per qualificare il meccanismo molecolare della malattia.Molti ricercatori si sono interessati all'applicazione di questa tecnica per prevedere la prosperità della malattia ed è la prognosi. Soprattutto usando la biopsia di Ricket. Assicurati solo di non essere pungolato dall'ago della sonda.Questo può essere semplicemente evitato con uno strumento specifico per rimuovere l'ago dalla macchina.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Ricerca

Biochimica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Isolamento Droplet per l&#39;analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Preparazione ottimale di formalina riparata campioni per Peptide basati su matrice assistita spettrometria totale di desorbimento/ionizzazione Laser i flussi di lavoro di Imaging

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Spettrometria di massa di foglia Spray: Una tecnica di ionizzazione ambiente rapido per valutare direttamente metaboliti dai tessuti vegetali

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide Profilazione e identificazione illustrata da Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

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Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Analisi metabolomica a base di cromomia liquida non mirata del grano di grano di grano

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...