Name: sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry
Uploaded: 2020-02-19T12:00:00
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Agradecemos a Ayumi Iizuka por operar el PESI-MS y Kazuko Sawa-nobori por su asistencia de secretaría. Agradecemos a Bronwen Gardner, Ph.D., del Grupo Edanz (www.edanzediting.com/ac) por editar un borrador de este manuscrito.

El comité institucional para el cuidado de animales de la Universidad de Yamanashi aprobó todos los protocolos y el uso de animales experimentales aquí indicados. El uso de muestras humanas fue aprobado por la junta de ética institucional de la Universidad de Yamanashi.
1. Preparación de tejidos sólidos
NOTA: Las muestras deben mantenerse en hielo después de su eliminación del cuerpo animal o humano para preservar la frescura del tejido. Si las mediciones no s...

<ol>
	<li>Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+for+mass+spectrometry+of+large+biomolecules.">Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules.</a> Science. 246, 64-71 (1989).</li><li>Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-Assisted+Ultraviolet+Laser+Desorption+of+Non-Volatile+Compounds.">Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds.</a> International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).</li><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100000+by+laser+ionization+time-of+flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).</li><li>Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+probe+electrospray+using+a+solid+needle.">Development of probe electrospray using a solid needle.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+analysis+of+living+animals+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).</li><li>Balog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+tissue+identification+using+rapid+evaporative+ionization+mass+spectrometry.">Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry.</a> Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).</li><li>Boughton, B. A., Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+metabolite+profiling+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging.">Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).</li><li>Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-based+imaging+mass+spectrometry+revealed+abnormal+distribution+of+phospholipids+in+colon+cancer+liver+metastasis.">MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).</li><li>Sugiyama, E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+brain+gangliosides+using+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive+tissue+analysis+for+ex+vivo+and+in+vivo+cancer+diagnosis+using+a+handheld+mass+spectrometry+system.">Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system.</a> Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).</li><li>Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+drug+analysis+from+oral+fluid+using+swab+touch+spray+mass+spectrometry.">Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry.</a> Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+probe+electrospray+generated+from+a+solid+needle.">Characterization of probe electrospray generated from a solid needle.</a> Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+and+exhaustive+ionization+of+analytes+with+different+surface+activity+by+probe+electrospray+ionization.">Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+renal+cell+carcinoma+as+a+first+step+for+mass+spectrometry-based+diagnostics.">Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).</li><li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+mass+spectra+database+and+diagnosis+algorithm+for+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).</li><li>Johno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+potential+new+biomarkers+of+atherosclerosis+by+probe+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 14, 38 (2018).</li><li>Zaitsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+endogenous+metabolite+analysis+of+mice+liver+by+probe+electrospray+ionization/triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry+and+its+preliminary+application+to+in+vivo+real-time+analysis.">Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis.</a> Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+diagnosis+of+chemically+induced+hepatocellular+carcinoma+using+a+novel+mass+spectrometry-based+technique.">Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique.</a> Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolic+reprogramming+in+hepatocellular+carcinoma.">Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma.</a> Cancers. 10, 447-461 (2018).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+biomolecules+from+solutions+with+high+concentration+of+salts+using+probe+electrospray+and+nano-electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+non-proximate+probe+electrospray+ionization+for+real-time+analysis+of+living+animal.">Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal.</a> Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+imaging+mass+spectrometry+by+electrospray+ionization+using+solid+needle+as+sampling+probe.">Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+in+analytical+oncology+-+Status+quo+of+mass+spectrometry-based+diagnostics+for+malignant+tumor.">Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor.</a> Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).</li><li>Hiraoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Component+profiling+in+agricultural+applications+using+an+adjustable+acupuncture+needle+for+sheath-flow+probe+electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).</li></ol>

Aunque PESI es un derivado de ESI para espectrometría de masas4, es más ventajoso para el seguimiento de metabolómica en tiempo real, así como para el análisis de reacciones bioquímicas sin realizar ningún pretratamiento complejo o lento5,14,15,17. Es una técnica de espectrometría de masas fácil e instantánea que se puede aplicar al estado integrado de los org...

La espectrometría de masas (Em) es una realización tecnológica del reduccionismo; reduce el objeto de análisis a una unidad que puede interpretarse sobre la base de especies moleculares o cascadas. Por lo tanto, es un método representativo de química analítica. Se compone de cuatro procesos: ionización, análisis, detección y adquisición espectral. Debido a que la ionización de la molécula es el primer proceso en espectrometría de masas, generalmente restringe la forma de los analitos a procesar. La mayoría de los procedimientos de ionización requieren la destrucción de la estructura, morfología y procesos biológicos en tiempo real de muestras orgánicas. Por ejemplo, la ionización por electrospray (ESI) MS requiere que las muestras estén en estado líquido para una ionización eficiente1. Las muestras, por lo tanto, deben pasar por una compleja preparación bioquímica, que altera la composición de las moléculas. Alternativamente, mientras que la ionización de desorción láser asistida por matriz (MALDI) MS puede reconstruir mapas moleculares de tejido seccionado delgado2,3, su eficiencia de ionización es demasiado baja para detectar todas las moléculas en las muestras, y es particularmente pobre en el análisis de ácidos grasos. Teniendo en cuenta estas limitaciones, la ionización de electrospray de sonda (PESI)4 se puede utilizar para observar los cambios en tiempo real en los sistemas biológicos in situ sin destruir la integridad estructural5,mientras que el organismo biológico que se observa está técnicamente en un estado vivo. Una aguja muy fina se utiliza en este caso que sirve simultáneamente como un selector de muestras y un emisor de iones. Esto significa que las complejas secuencias de pretratamiento de muestras se pueden omitir para obtener espectros de masa que reflejen los componentes moleculares del sistema vivo in situ.
Hay varios otros métodos de ionización que rivalizan con PESI-MS. Una es la espectrometría de masas de ionización evaporativa rápida (REIMS)6. Esta técnica funciona bien durante la cirugía porque se ensambla con un cuchillo eléctrico y recoge el penacho iónico generado durante la incisión. Si bien REIMS es muy útil para la cirugía, es esencialmente un método destructivo que requiere la ablación eléctrica del tejido. Por lo tanto, no es útil para el análisis detallado de células y tejidos en una muestra preparatoria o en análisis de laboratorio. Además, debido a que recoge una gran cantidad de residuos de tejido que contienen penacho, requiere un largo mantenimiento de los dispositivos después de cada uso, limitando así el uso de esta máquina a procedimientos quirúrgicos especiales. Un método similar, llamado espectrometría de masas de ionización láser (LDI-MS)7, es otra técnica que no es invasiva y útil para el análisis de superficie. Debido a que esta técnica es buena para escanear la superficie de una muestra, logra un análisis bidimensional integral como espectrometría de masas de imágenes MALDI8,9. Sin embargo, debido a que LDI-MS sólo es aplicable al análisis de superficie, PESI-MS es ventajoso para analizar las muestras, por ejemplo, dentro del tejido. Otra técnica, la MasSpec Pen10,se informó para lograr una alta especificidad y sensibilidad en el diagnóstico del cáncer de tiroides, pero el diámetro de la sonda está en el orden de mm y es específico para el análisis de la superficie, lo que significa que no puede detectar pequeños nódulos de cáncer o lesiones profundamente localizadas. Además, dado que este método utiliza un canal de flujo microcapilar incrustado en la pluma de la sonda, debe tenerse en cuenta la contaminación cruzada, similar a LDI-MS. Existen otras técnicas que se han aplicado a entornos clínicos, como la sonda de flujo y la forma de ionización del hisopo11,pero no están muy extendidas.
PESI es una miniaturización extrema de ESI, donde el capilar del nanoelectrospray converge en una aguja sólida con un radio de curvatura de la punta de varios cientos de nm. La ionización tiene lugar en el área extremadamente restringida de la punta de la aguja mediante la formación de un cono Taylor, en el que quedan muestras hasta la ionización de todo el líquido en la punta se completa12. Si el analito permanece en la punta de la aguja de metal, el exceso de carga se genera continuamente en la interfaz entre la aguja de metal y los analitos. Por lo tanto, la ionización secuencial de moléculas ocurre dependiendo de su actividad superficial. Esta propiedad hace que la punta de la aguja sea una especie de cromatograma, separando los analitos dependiendo de su actividad superficial. Más técnicamente, las moléculas con la actividad superficial más fuerte llegan a la superficie del cono Taylor y se ionizan antes que aquellas con una actividad superficial más débil, que se adhieren a la superficie de la aguja hasta el final del proceso de ionización. Por lo tanto, la ionización completa de todas las moléculas recogidas por la aguja se logra13. Además, debido a que esta técnica no implica la adición de disolvente superfluo a la muestra, varios cientos de femtolitros son suficientes para obtener espectros de masa lo suficientemente fuertes para un análisis posterior14. Estas propiedades son ventajosas para el análisis de muestras biológicas intactas. Sin embargo, una desventaja importante de PESI-MS radica en la discontinuidad de la ionización debido al movimiento recíproco de la aguja a lo largo del eje vertical, similar a una máquina de aserrado. La ionización sólo tiene lugar cuando la punta de la sonda alcanza el punto más alto cuando la altura del orificio iónico está alineada en el eje horizontal. La ionización cesa mientras la aguja recoge muestras, por lo que la estabilidad de la ionización no es igual a la de la ESI convencional. Por lo tanto, PESI-MS no es un método ideal para la proteómica.
Hasta la fecha, PESI-MS se ha aplicado principalmente al análisis de sistemas biológicos, cubriendo una amplia gama de campos, desde la investigación básica hasta los entornos clínicos. Por ejemplo, el análisis directo del tejido humano preparado durante la cirugía fue capaz de revelar la acumulación de triacilglycerol tanto en el carcinoma de células renales15 como en el carcinoma escamoso faríngeo16. Este método también puede medir muestras líquidas, como la sangre, para centrarse en el perfil lipídico. Por ejemplo, algunas moléculas se han delineado durante los cambios en la dieta en los conejos; se informó que algunas de estas moléculas disminuyeron en etapas muy tempranas de los experimentos, lo que indica la alta sensibilidad y utilidad de este sistema para el diagnóstico clínico17. Además, la aplicación directa a un animal vivo permitió la detección de cambios bioquímicos del hígado después de sólo una noche de ayuno5. 18 revisitó este experimento5 y analizó los perfiles metabólicos del hígado de casi la misma manera, con resultados que reforzaron la estabilidad y reproducibilidad de nuestro método original. Además, pudimos discriminar el tejido canceroso del hígado no canceroso circundante en ratones utilizando esta técnica19. Por lo tanto, esta es una técnica de espectrometría de masas versátil que es útil en varios entornos, tanto in vivo como in vitro. Desde otro punto de vista, el módulo PESI se puede hacer para adaptarse a varios espectrómetros de masa ajustando el accesorio de montaje. En este breve artículo, presentamos los conceptos básicos y ejemplos de aplicaciones(Figura 1), incluidas las aplicaciones con animales vivos5.
De acuerdo con las regulaciones y leyes de cada país, algunas partes de este protocolo tendrán que ser revisadas para cumplir con los criterios de cada institución. La aplicación al organismo vivo es la más interesante y desafiante porque puede proporcionar cambios bioquímicos o metabólicos en tejidos u órganos en animales vivos in situ. Si bien esta solicitud fue aprobada por el comité institucional para el cuidado de animales en la Universidad de Yamanashi, en 20135, otra ronda de aprobación será ahora necesaria debido a los recientes cambios en las regulaciones para los experimentos con animales. Por lo tanto, son aconsejables varias modificaciones en el esquema experimental. En cuanto a los espectros de masa obtenidos en experimentos, teniendo en cuenta las fluctuaciones de los espectros de masa entre cada medición, no existe un sistema de intercambio de información espectral que sea común a la comunidad de secuenciación de nucleótidos. Se debe tener cuidado cuando el operador manihace la aguja para evitar accidentes con aguja, especialmente cuando se retira la aguja del soporte de la aguja. Un dispositivo especial para desmontar la aguja es muy útil para este propósito. Dado que el compartimiento del módulo PESI es una cámara hermética y cerrada, la fuga del penacho iónico no se produce si el espectrómetro de masas funciona de acuerdo con las instrucciones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine (5-FdU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8791-25MG</td>
			<td>25mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable biposy punch (Trepan)</td>
			<td>kai Europa GmbH</td>
			<td>BP-30F</td>
			<td>bore size 3mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>extra pure reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>ver. 5.96, Data analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropestle</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>S13091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtube</td>
			<td>Treff</td>
			<td>982855</td>
			<td>0.5 mL clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>DPiMS-2020</td>
			<td>Mass spectrometer equipped with PESI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPGT solition</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ND</td>
			<td>Attached to DPiMS-2020</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry

La espectrometría de masas (MS) es una herramienta poderosa en la química analítica porque proporciona información muy precisa sobre moléculas, como las relaciones masa-carga(m/z),que son útiles para deducir pesos y estructuras moleculares. Si bien es esencialmente un método analítico destructivo, los recientes avances en la técnica de ionización ambiental nos han permitido adquirir datos mientras demos el tejido en un estado relativamente intacto en términos de integridad. La ionización por electrospray de sonda (PESI) es un método llamado directo porque no requiere un pretratamiento complejo y lento de las muestras. Una aguja fina sirve como un selector de muestras, así como un emisor de ionización. Sobre la base de la propiedad muy afilada y fina de la punta de la sonda, la destrucción de las muestras es mínima, lo que nos permite adquirir la información molecular en tiempo real de los seres vivos in situ. En este documento, presentamos tres aplicaciones de la técnica PESI-MS que serán útiles para la investigación y el desarrollo biomédicos. Se trata de la aplicación al tejido sólido, que es la aplicación básica de esta técnica para el diagnóstico médico. Como esta técnica requiere sólo 10 mg de la muestra, puede ser muy útil en los entornos clínicos de rutina. La segunda aplicación es para el diagnóstico médico in vitro donde se mide el suero sanguíneo humano. La capacidad de medir muestras de fluidos también es valiosa en varios experimentos biológicos en los que no se puede proporcionar un volumen suficiente de muestras para técnicas analíticas convencionales. La tercera aplicación se inclina hacia la aplicación directa de agujas de sonda en animales vivos, donde podemos obtener dinámica sin tiempo de metabolitos o fármacos en órganos específicos. En cada aplicación, podemos inferir las moléculas que han sido detectadas por la EP o utilizar inteligencia artificial para obtener un diagnóstico médico.

Como se muestra en la Figura 3,los datos obtenidos por la técnica PESI-MS son los espectros de masa, cuyo rango m/z de 10 a 1.200 en este sistema. Mientras que uno puede detectar moléculas de hasta m/z 2,000, hubo pocos picos obtenidos utilizando esta técnica en el rango de masa de m/z 1,200. Por lo tanto, analizamos picos de m/z 10 a 1.200. Había grupos visibles de picos alrededor de m/z 800 y 900; el primero ...

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Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

En este artículo se presentan métodos de preparación de muestras para un método analítico único en tiempo real basado en la espectrometría de masas ambientales. Este método nos permite realizar análisis en tiempo real de las moléculas biológicas in vivo sin ningún pretratamiento especial.

Preparación de muestras para espectrometría de masas de ionización por electrospray de sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Por lo tanto, se trata de espectrometría de masas ambientales única, especialmente adecuada para analizar muestras biológicas, tanto in vitro como in vivo. Como esto no requiere regularmente un pretratamiento especial de muestras, como la clasificación celular, el fraccionamiento y la concentración, puede analizar una muestra con una pérdida mínima de componentes biológicos, especialmente aquellas que existen como cantidad muy pequeña. Esta técnica le permite analizar las materias primas directamente en un minuto por espectrometría de masas.La rapidez es un obstáculo en la robustez del sistema, principales ventajas inherentes a esta técnica. Todo lo que tienes que hacer es preparar sílice, 10 miligramos de tejido muestra, y 10 microlitros de proliferar. Y ponlos en un cartucho desechable.Se establece en la máquina PESI-MS, y obtendrá el resultado en unos minutos. Al elegir el espectrómetro de masas adecuado, puede anotar la identidad molecular. Para comenzar, recupere el hígado o el tejido renal del congelador.En una placa de corcho, corte la muestra de tejido a aproximadamente dos por dos por dos milímetros usando un bisturí o cuchillo. Alternativamente, perforar la muestra con el Trepan y recortar la longitud de la columna a dos milímetros. Si el tejido está contaminado con sangre, lave brevemente con solución salina con fosfato frío helado.Coloque aproximadamente 10 miligramos de la muestra cortada o perforada en un microtubo de plástico y agregue 100 microlitros de 50% de etanol. Utilice una micropesta para homogeneizar la muestra. A continuación, con el pipetman, coloque 10 microlitros del homogeneizar en el pozo del cartucho del espectrómetro de masas.Coloque el cartucho en la cámara de ionización del espectrómetro de masas de ionización directa de la sonda e instale la sonda de aguja de acero inoxidable que se utilizará para la ionización de la muestra. Cierre firmemente la tapa de la cámara para activar automáticamente el dispositivo de seguridad. Inicie el ordenador de a bordo haciendo clic en el icono de inicio para analizar, utilizando los paneles en pantalla, aplicar una tensión de 2,3 kilovoltas a la aguja para generar la electrospray y asegurarse de que la frecuencia de la aguja es de tres hercios.Espere 30 segundos a que se complete la medición. Después de medir cada muestra, deseche el cartucho y la aguja en un eliminador de riesgo biológico. Para analizar los espectros de masa, abra el software asociado con el espectrómetro de masas.Haga clic en el archivo L-C-D en la ventana del navegador de archivos de datos del software. Al elegir, haga clic en un único pico de la ventana del espectro de masas y para representar automáticamente un E-I-C. Marque el T-I-C y el E-I-C, y haga clic en el icono del espectro promedio para seleccionar el rango de la ventana de tiempo para generar el espectro de masas.Exporte los datos de texto espectral de masa. Para analizar los fluidos corporales, extraiga hasta 10 microlitros de la muestra de suero y prescinda en un microtubo de 1,5 mililitros. Añadir 190 microlitros de 50% etanol al tubo, luego vórtice durante dos minutos a temperatura ambiente.Para eliminar todos los glóbulos rojos, centrifuga el líquido a 15.000 veces G durante uno a cinco minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera 10 microlitros del sobrenadante al pozo del cartucho y proceda a medir en el espectrómetro de masas como anteriormente. Este protocolo muestra la preparación de muestras para PESI-MS en muestras sólidas, muestras líquidas y animales vivos.El carcinoma de células renales humanas muestra picos característicos de lípidos neutros. Hubo picos relativamente fuertes en los espectros en la relación masa-carga de 900 de tejido de carcinoma de células renales humanas que no fueron identificados en el tejido no canceroso circundante. Estos picos representan principalmente glicerol triacílico.Ejemplo de datos adquiridos en tejidos hepáticos normales, representa la lesión neoplásica de un paciente con hepatitis crónica y cirrosis hepática. Suero humano de tres individuos fue analizado usando PESI-MS, había claras diferencias en los patrones espectrales entre los individuos. Para los cambios metabólicos en 5-FdU inyectado intravenosamente en el vaso de cola de un ratón, se logró una detección muy rápida y sensible de 5-FdU con aducto de sodio en el hígado in situ.Como la profundidad de la punta de la aguja desde el sitio del tejido, juega el papel más importante en la ionización que lee la adquisición exitosa de datos, asegúrese de seguir las instrucciones. Puede identificar las especies moleculares examinando la base de datos comercial. Esta es una manera de calificar el mecanismo molecular de la enfermedad.Muchos investigadores se han interesado en la aplicación de esta técnica para predecir la prosperidad de la enfermedad y su pronóstico. Especialmente usando la biopsia de Ricket. Sólo asegúrese de no ser pinchado por la aguja de la sonda.Esto se puede evitar simplemente con un instrumento específico para extraer la aguja de la máquina.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigación

Bioquímica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Óptima preparación de formol fijada muestras para péptidos basados en matriz asistida por láser de desorción/ionización espectrometría de masas de flujos de trabajo

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Espectrometría de masa de hoja aerosol: Una técnica rápida ionización ambiental evaluar directamente los metabolitos de los tejidos vegetales

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfilado e identificación de nitropéptidos ilustrados por Angiotensin A II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Una preparación de muestra de plasma para espectrometría de masas utilizando una estación de trabajo automatizada

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Análisis de metabolómica basada en cromatografía líquida no dirigida de grano de trigo

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...