Name: sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry
Uploaded: 2020-02-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

Vi tackar Ayumi Iizuka för att driva PESI-MS och Kazuko Sawa-nobori för hennes sekreterarhjälp. Vi tackar Bronwen Gardner, Ph.D., från Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) för att redigera ett utkast till detta manuskript.

Den institutionella kommittén för djurvård vid universitetet i Yamanashi godkände alla protokoll och användning av försöksdjur som anges häri. Användning av humanprov godkändes av den institutionella etiknämnden vid universitetet i Yamanashi.
1. Beredning av fast vävnad
OBS: Proverna skall förvaras på is efter avlägsnande från djuret eller människokroppen för att bevara vävnadens färskhet. Om mätningarna inte omedelbart följer dissekering rekomme...

<ol>
	<li>Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+for+mass+spectrometry+of+large+biomolecules.">Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules.</a> Science. 246, 64-71 (1989).</li><li>Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-Assisted+Ultraviolet+Laser+Desorption+of+Non-Volatile+Compounds.">Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds.</a> International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).</li><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100000+by+laser+ionization+time-of+flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).</li><li>Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+probe+electrospray+using+a+solid+needle.">Development of probe electrospray using a solid needle.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+analysis+of+living+animals+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).</li><li>Balog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+tissue+identification+using+rapid+evaporative+ionization+mass+spectrometry.">Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry.</a> Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).</li><li>Boughton, B. A., Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+metabolite+profiling+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging.">Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).</li><li>Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-based+imaging+mass+spectrometry+revealed+abnormal+distribution+of+phospholipids+in+colon+cancer+liver+metastasis.">MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).</li><li>Sugiyama, E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+brain+gangliosides+using+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive+tissue+analysis+for+ex+vivo+and+in+vivo+cancer+diagnosis+using+a+handheld+mass+spectrometry+system.">Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system.</a> Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).</li><li>Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+drug+analysis+from+oral+fluid+using+swab+touch+spray+mass+spectrometry.">Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry.</a> Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+probe+electrospray+generated+from+a+solid+needle.">Characterization of probe electrospray generated from a solid needle.</a> Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+and+exhaustive+ionization+of+analytes+with+different+surface+activity+by+probe+electrospray+ionization.">Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+renal+cell+carcinoma+as+a+first+step+for+mass+spectrometry-based+diagnostics.">Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).</li><li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+mass+spectra+database+and+diagnosis+algorithm+for+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).</li><li>Johno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+potential+new+biomarkers+of+atherosclerosis+by+probe+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 14, 38 (2018).</li><li>Zaitsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+endogenous+metabolite+analysis+of+mice+liver+by+probe+electrospray+ionization/triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry+and+its+preliminary+application+to+in+vivo+real-time+analysis.">Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis.</a> Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+diagnosis+of+chemically+induced+hepatocellular+carcinoma+using+a+novel+mass+spectrometry-based+technique.">Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique.</a> Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolic+reprogramming+in+hepatocellular+carcinoma.">Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma.</a> Cancers. 10, 447-461 (2018).</li><li>Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+biomolecules+from+solutions+with+high+concentration+of+salts+using+probe+electrospray+and+nano-electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).</li><li>Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+non-proximate+probe+electrospray+ionization+for+real-time+analysis+of+living+animal.">Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal.</a> Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).</li><li>Chen, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+imaging+mass+spectrometry+by+electrospray+ionization+using+solid+needle+as+sampling+probe.">Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).</li><li>Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+the+probe+electrospray+ionization+(PESI)+needle+applied+to+the+biological+samples.">Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples.</a> Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).</li><li>Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovations+in+analytical+oncology+-+Status+quo+of+mass+spectrometry-based+diagnostics+for+malignant+tumor.">Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor.</a> Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).</li><li>Hiraoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Component+profiling+in+agricultural+applications+using+an+adjustable+acupuncture+needle+for+sheath-flow+probe+electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).</li></ol>

Även pesi är ett derivat av ESI för massa pektrometri4, är det mest fördelaktigt för övervakning realtid metabolomics, samt för att analysera biokemiska reaktioner utan att utföra några komplexa eller tidskrävande förbehandlingar5,14,15,17. Det är en enkel och ögonblicklig masspektrometri teknik som kan tillämpas på det integrerade tillståndet av levande...

Masspektrometri (MS) är en teknisk förverkligande av reduktionism; Det minskar föremålet för analys till en enhet som kan tolkas på grundval av molekylära arter eller kaskader. Därför är det en representativ metod för analytisk kemi. Den består av fyra processer: jonisering, analys, detektion och spektralförvärv. Eftersom jonisering av molekylen är den första processen i masspektrometri, begränsar det i allmänhet formen av analyterna som ska bearbetas. De flesta joniseringsförfaranden kräver förstörelse av strukturen, morfologi och biologiska processer i realtid av organiska prover. Till exempel kräver elektrosprayjonisering (ESI) MS att proverna är i ett flytande tillstånd för effektiv jonisering1. Prover måste därför gå igenom en komplex biokemisk beredning, som förändrar molekylernas sammansättning. Alternativt, medan matris-assisterad laser desorption jonisering (MALDI) MS kan rekonstruera molekylära kartor över tunn sektionerad vävnad2,3, dess jonisering effektivitet är för låg för att upptäcka alla molekyler i proverna, och det är särskilt dålig på att analysera fettsyror. Med tanke på dessa begränsningar kan sondelektrosprayjonisering (PESI)4 användas för att observera förändringar i realtid i biologiska system på plats utan att förstöra den strukturellaintegriteten 5, medan den biologiska organismen observeras är tekniskt i ett levande tillstånd. En mycket fin nål används i detta fall som fungerar samtidigt som ett provplockare och en jonavsändare. Detta innebär att de komplexa provförbehandlingssekvenserna kan kringgås för att erhålla massspektra som återspeglar de molekylära komponenterna i det levande systemet på plats.
Det finns flera andra joniseringsmetoder som konkurrerar med PESI-MS. En är snabb avdunstning jonisering massa pektrometri (REIMS)6. Denna teknik fungerar bra under operationen eftersom den är monterad med en elektrisk kniv och samlar jonplym genereras under snitt. Medan REIMS är mycket användbart för operationen, är det i huvudsak en destruktiv metod som kräver elektrisk ablation av vävnaden. Det är därför inte användbart för detaljerad analys av celler och vävnader i ett preparativt prov eller i laboratorieanalyser. Dessutom, eftersom det samlar en stor mängd plym som innehåller vävnad skräp, det kräver långt underhåll av enheterna efter varje användning, vilket begränsar användningen av denna maskin till särskilda kirurgiska ingrepp. En liknande metod, som kallas laser desorption jonisering massa pektrometri (LDI-MS)7, är en annan teknik som är noninvasive och användbar för ytanalysen. Eftersom denna teknik är bra på att skanna ytan av ett exemplar, uppnår den omfattande tvådimensionell analys som MALDI imaging masspektrometri8,9. Eftersom LDI-MS endast är tillämpligt på ytanalysen är PESI-MS dock fördelaktigt för att analysera proverna t.ex. En annan teknik, MasSpec Pen10, rapporterades för att uppnå hög specificitet och känslighet i diagnos sköldkörtelcancer, men diametern på sonden är i storleksordningen mm och det är specifikt för ytanalysen, vilket innebär att det inte kan upptäcka små knölar av cancer eller djupt lokaliserade skador. Eftersom denna metod använder en mikrokapillär flödeskanal inbäddad i sondpennan måste dessutom korskontaminering beaktas, liknande LDI-MS. Andra tekniker finns som har tillämpats på kliniska inställningar, såsom flödessonden och joniseringsformuläret swab11, men de är inte utbredda.
PESI är extrem miniatyrisering av ESI, där nanoelektrosprayens kapillär konvergerar på en fast nål med en spetskrökningsradie på flera hundra nm. Jonisering sker i det extremt begränsade området av nålspetsen genom att bilda en Taylor kon, där prover kvar tills jonisering av all vätska på spetsen är klar12. Om analyten stannar på metallnålens spets genereras överladdningen kontinuerligt vid gränssnittet mellan metallnålen och analyterna. Därför uppstår sekventiell jonisering av molekyler beroende på deras ytaktivitet. Denna egenskap gör nålspetsen till ett slags kromatogram, som skiljer analyterna beroende på deras ytaktivitet. Mer tekniskt, molekyler med starkare ytbehandlar aktivitet kommer till ytbehandla av Taylorkonen och joniseras tidigare än de med svagare ytbehandlar aktivitet, som fäster till ytbehandla av nålen till avsluta av joniseringen. Således uppnås fullständig jonisering av alla molekyler som plockas upp av nålen13. Dessutom, eftersom denna teknik inte innebär tillsats av överflödigt lösningsmedel till provet, flera hundra femtoliter är tillräckliga för att få massa spektra tillräckligt stark för ytterligare analys14. Dessa egenskaper är fördelaktiga för analys av intakta biologiska prover. En stor nackdel med PESI-MS ligger dock i diskontinuiteten i joniseringen på grund av nålens återgående rörelse längs den vertikala axeln, liknande en sågmaskin. Jonisering sker endast när spetsen på sonden når den högsta punkten när höjden på jonöppningen är justerad på den horisontella axeln. Jonisering upphör medan nålen plockar upp prover, och så stabiliteten i jonisering är inte lika med den i konventionella ESI. Därför är PESI-MS inte en idealisk metod för proteomik.
Pesi-MS har hittills huvudsakligen tillämpats på analys av biologiska system, som omfattar ett brett spektrum av områden från grundforskning till kliniska miljöer. Till exempel, den direkta analysen av mänsklig vävnad som utarbetats under operationen kunde avslöja ansamling av triacylglycerol i både njurcellscancercarcinom 15 och faryngeal skivepitelcancer16. Denna metod kan också mäta flytande prover, såsom blod, att fokusera på lipidprofilen. Till exempel har vissa molekyler avgränsats under kostförändringar hos kaniner; det rapporterades att vissa av dessa molekyler minskade i mycket tidiga skeden av experimenten, vilket tyder på den höga känsligheten och nyttan av detta system för klinisk diagnos17. Dessutom, direkt tillämpning på ett levande djur får detektion av biokemiska förändringar i levern efter bara en natt av fasta5. Zaitsu et al.18 revisited detta experiment5 och analyserade metaboliska profiler av levern på nästan samma sätt, med resultat som förstärktstabilitet och reproducerbarhet av vår ursprungliga metod. Dessutom kunde vi diskriminera cancervävnaden från omgivande icke-cancerlever hos möss med hjälp av denna teknik19. Därför är detta en mångsidig masspektrometri teknik som är användbar i olika inställningar, både in vivo och in vitro. Ur en annan synvinkel kan PESI-modulen göras för att passa olika masspektrometrar genom att justera monteringsfästet. I denna korta artikel introducerar vi grunderna och exemplen på tillämpningar(figur 1), inklusive tillämpningar med levande djur5.
Enligt bestämmelserna och lagarna i varje land måste delar av detta protokoll ses över för att uppfylla varje institutions kriterier. Tillämpning till den levande organismen är den mest intressanta och utmanande eftersom det kan ge biokemiska eller metaboliska förändringar i vävnader eller organ hos levande djur på plats. Även om denna ansökan godkändes av den institutionella kommittén för djurvård vid universitetet i Yamanashi, 20135, kommer en annan omgång godkännande nu att vara nödvändig på grund av den senaste tidens ändringar i reglerna för djurförsöken. Flera ändringar i det experimentella systemet är därför tillrådliga. När det gäller massa spektra erhålls i experiment, med fluktuationer i massa spektra mellan varje mätning beaktas, det finns inget spektralt informationsutbyte system som är vanligt att nukleotid sekvensering samhället. Försiktighet skall iakttas när föraren hanterar nålen för att undvika nålsticksolyckor, särskilt när nålen avlägsnas från nålhållaren. En speciell anordning för att lossa nålen är mycket användbar för detta ändamål. Eftersom PESI-modulens fack är en lufttät, sluten kammare uppstår inte läckage av jonplym om masspektrometern används enligt instruktionerna.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine (5-FdU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8791-25MG</td>
			<td>25mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable biposy punch (Trepan)</td>
			<td>kai Europa GmbH</td>
			<td>BP-30F</td>
			<td>bore size 3mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>extra pure reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>ver. 5.96, Data analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropestle</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>S13091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtube</td>
			<td>Treff</td>
			<td>982855</td>
			<td>0.5 mL clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>DPiMS-2020</td>
			<td>Mass spectrometer equipped with PESI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPGT solition</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ND</td>
			<td>Attached to DPiMS-2020</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for probe electrospray ionization mass spectrometry

Masspektrometri (MS) är ett kraftfullt verktyg i analytisk kemi eftersom det ger mycket exakt information om molekyler, såsom mass-till-charge nyckeltal (m / z), som är användbara för att härleda molekylvikter och strukturer. Även om det är i huvudsak en destruktiv analytisk metod, senaste framsteg i den omgivande jonisering teknik har gjort det möjligt för oss att förvärva data samtidigt som vävnad i ett relativt intakt tillstånd när det gäller integritet. Sond elektrosprayjonisering (PESI) är en så kallad direkt metod eftersom det inte kräver komplex och tidskrävande förbehandling av prover. En fin nål fungerar som ett prov plockare, samt en jonisering utsläppare. Baserat på den mycket skarpa och fina egenskapen hos sonden spets, förstörelse av proverna är minimal, så att vi kan förvärva realtid molekylär information från levande ting på plats. Häri introducerar vi tre tillämpningar av PESI-MS-teknik som kommer att vara användbara för biomedicinsk forskning och utveckling. Man innebär tillämpningen på fast vävnad, vilket är den grundläggande tillämpningen av denna teknik för medicinsk diagnos. Eftersom denna teknik kräver endast 10 mg av provet, Det kan vara mycket användbart i rutinkliniska inställningar. Den andra ansökan är för in vitro medicinsk diagnostik där humant blod serum mäts. Förmågan att mäta vätskeprover är också värdefull i olika biologiska experiment där en tillräcklig provvolym för konventionella analystekniker inte kan tillhandahållas. Den tredje applikationen lutar mot direkt applicering av sondnålar hos levande djur, där vi kan få realtidsdynamik av metaboliter eller läkemedel i specifika organ. I varje ansökan kan vi dra slutsatsen de molekyler som har upptäckts av MS eller använda artificiell intelligens för att få en medicinsk diagnos.

Som avbildas i figur 3, de uppgifter som erhållits genom PESI-MS teknik är masspektra, vars m / z varierar från 10 till 1.200 i detta system. Medan man kan upptäcka molekyler upp till m /z 2000, det fanns få toppar erhålls med hjälp av denna teknik över massområdet m / z 1.200. Därför analyserade vi toppar från m/z 10 till 1 200. Det fanns iögonfallande grupper av toppar runt m/z 800 och 900; Den förs...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

I den här artikeln införs provberedningsmetoder för en unik analysmetod i realtid baserad på den omgivande masspektrometrimen. Denna metod gör att vi kan utföra realtidsanalys av de biologiska molekylerna in vivo utan några speciella förbehandlingar.

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Så, detta är unik omgivande masspektrometri, särskilt lämplig för att analysera biologiska prover, både in vitro och in vivo. Eftersom detta inte kräver regelbundet en särskild förbehandling av prover, såsom cellsortering, fraktionering och koncentration, kan det analysera ett prov med minsta förlust av biologiska komponenter, särskilt de som finns som mycket liten mängd. Denna teknik gör att du kan analysera de råvaror material direkt i en minut av masspektrometri.Snabbhet är obehindrat i robusthet av systemet, främsta fördelar inneboende i denna teknik. Allt du behöver göra är att bara förbereda kiseldioxid, 10 milligram vävnader exemplar, och 10 mikroliter av föröka sig. Och lägg dem i engångspatron.Den är inställd på PESI-MS-maskinen, och du får resultatet på några minuter. Genom att välja lämplig masspektrometer kan du kommentera den molekylära identiteten. Till att börja med hämta levern eller njurvävnaden från frysen.På en korkplatta skär du vävnadsprovet till en cirka två gånger två gånger två millimeter med hjälp av en skalpell eller kniv. Alternativt, stansa ut provet med Trepan och trimma längden på kolonnen till två millimeter. Om vävnaden är förorenad med blod, tvätta kort med iskall fosfatbuffrad saltlösning.Placera cirka 10 milligram av snittet eller stansade ut provet i en plast microtube och tillsätt 100 mikroliter av 50%etanol. Använd en mikropestel för att homogenisera provet. Sedan med pipetman, placera 10 mikroliter av homogenatet i brunnen av patronen av masspektrometern.Placera patronen i joniseringskammaren i Direktsonds jonisering Mass Spectrometer och installera den rostfria stjäla nål sond som kommer att användas för provjonisering. Stäng kammarlocket ordentligt för att automatiskt aktivera säkerhetsanordningen. Starta den inbyggda datorn genom att klicka på startikonen för att analysera, med hjälp av panelerna på skärmen, applicera en spänning på 2,3 kilovolt på nålen för att generera elektrosprayen och se till att nålens frekvens är tre hertz.Vänta i 30 sekunder så att mätningen är avslutad. Efter mätning av varje prov, kassera patronen och nålen i en biohazard disposer. För att analysera massspektra, öppna programvaran som är associerad med masspektrometern.Klicka på L-C-D filen i datafil webbläsarfönstret av programvaran. Välja klicka på en enda topp av massspektrumfönstret, och att automatiskt avbilda en E-I-C. Kontrollera T-I-C och E-I-C, och klicka på den genomsnittliga spektrumikonen för att välja tidsintervallet för att generera massspektrumet.Exportera massspektraltextdata. För att analysera kroppsvätskor, dra upp till 10 mikroliter av serumprovet, och fördela den i en 1,5 milliliter microtube. Tillsätt 190 mikroliter av 50%etanol till röret, sedan virvel i två minuter vid rumstemperatur.För att eliminera alla röda blodkroppar, centrifug vätskan vid 15, 000 gånger G i en till fem minuter vid fyra grader Celsius. Överför 10 mikroliter av supernatanten i brunnen på patronen och fortsätt att mäta på masspektrometern som tidigare. Detta protokoll visar provberedning för PESI-MS på fast prov, flytande prov och levande djur.Mänskliga njurmedicinska cell carcinom visar karakteristiska toppar av neutrala lipider. det fanns relativt starka toppar i spektra vid massa-till-charge förhållandet mellan 900 från mänskliga njurmedicinska cell carcinom vävnad som inte identifierades i den omgivande icke-cancerogena vävnaden. Dessa toppar representerar främst triacyl glycerol.Exempel på data som förvärvats i normala levervävnader, avbildas den neoplastiska lesion från en patient med kronisk hepatit och levercirros. Human serum från tre individer analyserades med hjälp av PESI-MS, fanns det tydliga skillnader i de spektrala mönster bland individerna. För de metaboliska förändringar i 5-FdU injiceras intraveneously i svansen fartyget av en mus, mycket snabb och känslig detektering av 5-FdU med natriumadduct uppnåddes i levern in situ.Som djupet av nålen spets från platsen för vävnaden, spelar den viktigaste rollen i jonisering som läser den framgångsrika datainsamling, se till att följa instruktionerna. Du kan identifiera de molekylära arterna genom att titta in i den kommersiella databasen. Detta är ett sätt att kvalificera den molekylära mekanismen för sjukdom.Många forskare har blivit intresserade av tillämpningen av denna teknik för att förutsäga välståndet av sjukdom och det är prognos. Speciellt med hjälp av Ricket biopsi. Se bara till att inte bli stucken av sondnålen.Detta kan enkelt undvikas med ett specifikt instrument för att ta bort nålen från maskinen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation för Kvantitativ masspektrometri Analys

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal förberedelse av formalinbeständiga prover för peptid baserat Matrix assisterad Laser Desorption/jonisering masspektrometri Imaging arbetsflöden

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray masspektrometri: En snabb omgivande jonisering teknik för att direkt bedöma metaboliter från växt vävnader

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Ett plasmaprovförberedelse för masspektrometri med hjälp av en automatiserad arbetsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Oriktad flytande kromatografi-Mass Pektrometri-Baserade metabolomika analys av vetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...