Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال التمويل الذي قدمته شركه نوفارتس للادويه من خلال تحالف بحثي مع جامعه بنسلفانيا (مايكل c. Milone) ، فضلا عن جائزه العالم لمؤسسه سانت بالدريك (سابا غاسيمي).

تمت الموافقة علي جميع الدراسات الحيوانية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام من جامعه بنسلفانيا.
1. T تنشيط الخلية ، والتوصيل ، والتوسع
<ol><li>تنشيط الخلايا الاساسيه البشرية الاوليه الطازجة أو بالتبريد عن طريق خلط مع الخرز المغناطيسي المضادة CD3/CD28 (علي سبيل الم?...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

هنا ونحن وصف النهج لقياس وظيفة وفعالية الخلايا السيارات T تحصد علي فترات متفاوتة في جميع انحاء الثقافة المجرية السابقة. توفر أساليبنا رؤية شامله في الاختبارات المصممة لتقييم القدرة التكاثرية وكذلك وظيفة المستجيب في المختبر. ونحن وصف كيفيه قياس النشاط الخلية T السيارات بعد التحفيز من خلال...

مستقبلات مستضد تشيريك (السيارات) توفير نهج واعده لأعاده توجيه الخلايا T ضد مستضدات الأورام متميزة. السيارات هي المستقبلات الاصطناعية التي تربط هدف مستضد. وفي حين ان تكوينها الدقيق متغير ، فان السيارات تحتوي عموما علي 3 مجالات متميزة. المجال خارج الخلية يوجه ملزمه لمستضد الهدف ويتكون عاده من قطعه واحده الجسم المضاد سلسله مرتبطة بالسيارة عن طريق المفصلي خارج الخلية. المجال الثاني ، المستمدة عاده من سلسله CD3ζ من مستقبلات الخلية T (TCR) المعقدة ، ويعزز التنشيط الخلية T بعد مشاركه السيارة. يتم تضمين مجال كوستيمولاتوري الثالث لتعزيز وظيفة الخلية T, التجهيز, الأيض, والمثابرة. نجاح العلاج بالخلايا T السيارة في مختلف الأورام الخبيثة التي تكون الدم بما في ذلك خلايا الدم الليمفاوية الحاده (ALL) ، سرطان الدم اللمفاوي المزمن (cll) والورم النخاعي المتعدد يسلط الضوء علي وعد العلاجية لهذا النهج1،2،3،4،5،6. الاخيره أداره الاغذيه والعقاقير (FDA) الموافقات لاثنين من العلاجات الخلوية CD19 الخاصة بالسيارة t, تيساجنليكلوسيل للأطفال والشباب البالغين ALL و axicabtagene ciloleucel لانتشار الأورام اللمفاوية ب الخلية الكبيرة, يعزز الجدارة الانتقالية من العلاج بالخلايا
وتشمل النهج المستندة إلى T السيارات عزل الخلايا T من الدم المحيطي ، والتنشيط ، والتعديل الجيني ، والتوسع الجسم السابق. التمايز هو معلمه هامه تنظم فعاليه الخلية تي السيارة. وفقا لذلك ، وتقييد التمايز الخلية T خلال الثقافة السابقة فيفو يعزز قدره المنتج غرست لكسب الطعم ، وتوسيع ، وتستمر ، وتوفير المناعة علي المدى الطويل بعد نقل التبني2،7،8،9. تتكون الخلايا t من عده مجموعات فرعيه متميزة بما في ذلك: الخلايا الساذجة T (Tn) ، والذاكرة المركزية (الطب الأساسي) ، والذاكرة المستجيب (تيم) ، والمنحرف متمايزة (Tte) وذاكره الخلايا الجذعية (Tscm). المستجيب المتمايزة الخلايا T لديها قدره لحل قويه. ومع ذلك ، فهي قصيرة الأمد والطعم سيئه10،11،12. وعلي النقيض من ذلك ، t الخلايا مع النمط الظاهري اقل تمايزا بما في ذلك الخلايا الساذجة t والطب العام معرض متفوقة التجهيز والقدرات التكاثري بعد نقل الخلية بالتبني13،14،15،16،17،18. تكوين الخلايا T التي تم جمعها في المنتجات المصنعة مسبقا يمكن ان تختلف عبر المرضي ويرتبط مع الإمكانات العلاجية للخلايا السيارات T. ترتبط نسبه الخلايا التائية ذات الτ الشبيهة بالسذاجة في منتج البدايات الاوليه بالاستجابة السريرية والعلاجية19.
مده الثقافة هي معلمه هامه تؤثر علي التمايز في خلايا السيارات T المعدة لنقل التبني. وضعنا مؤخرا نهجا لتوليد اعلي جوده الخلايا السيارات T باستخدام نموذج الثقافة مختصر20. وباستخدام نهجنا ، أظهرنا ان الثقافة المحدودة تؤدي إلى ظهور خلايا السيارات T مع وظيفة المستجيب المتفوقة والمثابرة بعد نقل التبني في نماذج الكسب غير المزروع من ابيضاض الدم. هنا ، نقدم النهج لتوليد موثوق بها خلايا CART19 (الخلايا الذاتية T هندستها للتعبير عن المضادة لCD19 scFv تعلق علي CD3ζ والمجالات الإشارات 4-1BB) وتشمل وصفا مفصلا لمقايسات التي توفر نظره ثاقبه في النشاط الحيوي للسيارة وفعالية قبل نقل التبني.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

العلاج المناعي بالتبني يبشر بمعالجه السرطان والامراض المعدية. نحن وصف نهج بسيط لنقل الخلايا الاساسيه الإنسان T مع مستقبلات مستضد تشيريك (CAR) وتوسيع ذريه السابقين الجسم البشري. ونحن تشمل المقايسات لقياس التعبير سيارة ، فضلا عن التمايز ، والقدرة التكاثري والنشاط لحل. ونحن وصف الاختبارات لقياس إنتاج السايسيسين المستجيب وإفراز خلوية التهابيه في خلايا السيارات T. نهجنا يوفر طريقه موثوقه وشامله للثقافة الخلايا السيارات T للنماذج السريرية للعلاج المناعي بالتبني.

باستخدام الطرق الموصوفة أعلاه ، قمنا بتحفيز وتوسيع خلايا T لمده 3 أو 9 أيام (الشكل 1ا ، ب). وحللنا أيضا ملامح التمايز الخاصة بهم ، علي النحو المبين في استراتيجية النابض المبينة في الشكل 1جيم، عن طريق قياس وفره البروتينات السكرية المميزة التي ...

Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

نحن وصف نهج لتوليد موثوق مستقبلات مستضد الشمبانزي (CAR) T الخلايا واختبار تمايزها ووظيفتها في المختبر والجسم الخارجي.

تصنيع مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) خلايا T للعلاج المناعي بالتبني

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating منتج CELL CAR T Cell مع الكفاءة الوظيفية التي تُنْشَف وتتكاثر، ولها نشاط cit-el-uric بعد التسريب هو مكون أساسي للعلاج المناعي بالتبني الفعال. على سبيل المثال، في الأورام الصلبة، والخلايا T CAR أنها يمكن أن تخترق الأورام الصلبة وأنها تتلقى التحفيز المستضد الأمثل؛ ومع ذلك، يتم إعاقة بهم عموما engraftment وانتشار في الناس. وتتمثل الفائدة الرئيسية لهذا النهج في أنه يمكن أن تحتفظ بنوعية الخلايا T CAR أو حالة التمايز من الخلايا T CAR دون توليد خلايا تائية متمايزة أو منهكة، والتي من شأنها أن تكون قد تضاءلت القدرة التكاثرية أو ضعف وظيفة فعالة بعد التسريب.يمكن أن تكون هذه التقنية صعبة لأن الخلايا التائية حساسة للغاية لتركيز الخلايا أو المساحة السطحية للسفن التي ازرع فيها. وكذلك احتياجاتهم الأيضية. في الأساس تحتاج الخلايا التائية إلى أن تبقى سعيدة طوال العملية ، وإلا فإنها لن تنمو.لبدء هذا الإجراء، وضعت الأطباق ثقافة 6-جيدا. قم بتنشيط الخلايا التائية البشرية الأولية الطازجة أو المحفوظة بالتبريد عن طريق خلطها مع الخرز المغناطيسي CD3 المضاد لـ CD3، بنسبة ثلاثة حبات لكل خلية T في آبار أطباق الثقافة. ثقافة الخلايا التائية في X-Vivo 15 المتوسطة تكمل مع مصل AB الإنسان العادي, L-الجلوتامين, انه يتبول وIL2.تنشيط الخلايا التائية بتركيز مليون خلية T لكل ملليلتر أثناء التوسع. وتربية لهم في 37 درجة مئوية مع 20٪ من الأوكسجين، 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 95٪. بعد التحفيز بين عشية وضحاها، إضافة عظمى العدسي إلى الخلايا التائية المنشطة.حساب حجم المابير اللازمة لتحقيق تعدد العدوى بين ثلاثة وخمسة. مواصلة زراعة الخلايا باستخدام نفس الشروط. في اليوم الثالث، جمع aliquot ممثل من خلايا الحفاظ على التبريد.قبل الحفاظ على التبريد، وإزالة الخرز المغناطيسي عن طريق الأنابيب بلطف وفصل المغناطيسي. إعداد الوسيلة تجميد، الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ DMSO. وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.بعد ذلك، الطرد المركزي الخلايا T في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل المابير الزائد وإضافة خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 300 مرة G لمدة خمس دقائق والتخلص من برنامج تلفزيوني.نعلق بيلانت في ملليلتر واحد من الباردة الحفاظ على المتوسط. تجميد الخلايا T في وعاء تجميد مبردة. وتخزينها عند 80 درجة مئوية ناقص لمدة 48 ساعة.بعد ذلك، نقل الخلايا المجمدة إلى النيتروجين السائل. اغسل بقية الخلايا التائية مرة واحدة في خمسة ملليلترات من برنامج تلفزيوني للقضاء على أي ناقل المتبقية. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق.ثم، decant برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق بيلانت الخلية في خلية T ثقافة المتوسطة بتركيز 500،000 خلية لكل ملليلتر. تقسيم الخلايا التائية إلى ثقافتين مصممة 45 و 9. عد الخلايا T بواسطة تدفق cytometry باستخدام عد الخرز والأجسام المضادة أحادية النسيلة إلى CD4 الإنسان وD8.فضلا عن صبغة قابلة للحياة. إعادة تغذية الثقافات كل يوم للحفاظ عليها بتركيز 500،000 خلية لكل ملليلتر. في اليوم الخامس، عد والتبريد الحفاظ على الثقافات اليوم الخامس كما وصف سابقا.في اليوم السابع، اغسل 500 ألف خلية في برنامج تلفزيوني. وإعادة تعليقها في 100 ميكرولترات من الفلوريسنس تنشيط خلية فرز العازلة. ثم، والكشف عن التعبير عن بروتين سطح CAR عن طريق تلطيخ المناعة مع الفلوري المقترنة المضادة CAR 19 idio-نوع بواسطة تدفق cytometry.في اليوم تسعة عد وكفاء الحفاظ على الثقافات اليوم تسعة كما وصف سابقا. في هذه الدراسة يتم قياس وظيفة وفعالية الخلايا T CAR التي يتم حصادها على فترات متفاوتة في جميع أنحاء ثقافة X-Vivo. باستخدام الطرق الموضحة في هذا الفيديو، يتم تحفيز الخلايا التائية وتوسيعها لمدة ثلاثة أو تسعة أيام.يتم تحليل ملف تعريف التمايز الخلايا كما هو مبين من قبل استراتيجية الغاتة هو موضح هنا، من خلال قياس وفرة من بروتينات الجليكوبروتين واضح أعرب عن سطح الخلية. وينظر إلى تحول تدريجي نحو التمايز effector على مر الزمن خلال ثقافة X-Vivo. ثم يتم تقييم وظيفة المفعول والقدرة التكاثرية لخلايا CAR T استجابةً للمستضد.الخلايا التي يتم توسيعها أقل وظيفيا متفوقة على تلك مثقف على نطاق واسع على مدى فترة أطول. في نموذج الماوس xenograft الإنسان من جميع قوة الخلايا T CAR حصادها في فترات زمنية مختلفة مقارنة. تظهر الخلايا التي تستغرق تسعة أيام استجابة مضادة للولوكس تعتمد على الجرعة مع استجابة كاملة تبلغ قيمتها جرعة عالية قدرها ثلاثة ملايين؛ وفقدان الفعالية للجرعة المنخفضة من 500،000.ومع ذلك، أظهرت الخلايا الثلاث اليوم استمرار السيطرة على الورم في كل من الجرعات العالية والمنخفضة. ويرتبط هذا الرد مع العدد المطلق من CAR-T 19 في الدم المحيطي من الفئران. وعموما، توفر هذه النتائج أدلة على أن خلايا CAR T التي تم حصادها في وقت سابق، تفوق تلك التي تم حصادها في وقت لاحق.بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء مقايسات إضافية وظيفة مثل مُجرّاة فرس البحر لقياس خصائصها الأيضية مثل استهلاك الأكسجين أو قدرة السبير-it-ed. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ عدة جولات من إعادة التحفيز لتوفير نظرة ثاقبة في تمايزها واستمرار الخلايا CAR T. باستخدام هذا العمل كأساس ونحن والباحثين الآخرين منخرطون في دراسات لاختصار عملية الثقافة.ويمكن أيضا أن تمتد في تصميم النهج الأساسية لمستضدات السرطان الأخرى. يجب أن تؤخذ الرعاية دائما عند العمل مع فيروس العدس. ولكن حتى عندما يتم تصميم فيروس العدس ليكون غير كفء للتكرار.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

نموذج ماوس سينجينيك اللمفاوية ب-خلية للتقييم قبل الإكلينيكية لخلايا تي سيارة CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

مقايسة قتل كروي من خلايا تي السيارة

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

إعداد اكسوسوميس ل siRNA إيصالها إلى "الخلايا السرطانية"

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

في ريتشالينجي خلية الورم المختبر للتقييم التنبؤي من مستضد تشيميريك مستقبلات خلية تي انتيتومور الدالة

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

استخدام كريسبر / Cas9 لضرب جنرال موتورز-CSF في خلايا CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث لتوليد خلايا T الأورام مستضد محدده

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

الموجات فوق الصوتية غرس العظام البنكرياس الاقنيه اللحمية

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

عزل خلايا الدم الطرفية البشرية أحادية النواة والخلايا التائية CD4+ من مرضى متلازمة سيزاري للتنميط النسخي

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

التصوير الديناميكي للخلايا التائية لمستقبلات المستضدات الكيميرية مع [18F] التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني رباعي فلوروبورات / التصوير المقطعي المحوسب

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

تقييم السمية المرتبطة بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري باستخدام نموذج فأر Xenograft المشتق من سرطان الدم الليمفاوي الحاد

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...