Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet gennem finansiering fra Novartis Pharmaceuticals gennem en forskningsalliance med University of Pennsylvania (Michael C. Milone) samt St. Baldricks Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Alle dyreforsøg er godkendt af det institutionelle dyrepleje-og anvendelses udvalg under University of Pennsylvania.
1. T-celle aktivering, transduktion og ekspansion
<ol><li>Aktiver ferske eller kryopræserverede primære humane T-celler ved at blande med anti CD3/CD28 magnetiske perler (fx dynabeads) i et forhold på 3 perler pr. T celle i 6-brønden cellekultur retter. Kultur T celler i X-VIVO 15 medium suppleret med 5% normalt humant AB serum, 2 mM L-glutamin, 20 mM HEPES, og ilet (100 ...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

Her beskriver vi metoder til at målefunktionen og effekten af de bil-T-celler, som høstes med varierende intervaller i hele ex vivo-kulturen. Vores metoder giver omfattende indsigt i assays designet til at vurdere proliferativ kapacitet samt Effector funktion in vitro. Vi beskriver, hvordan man måler bil T celle aktivitet efter stimulation gennem bilen og detalje xenograft modeller af leukæmi ved hjælp af bil T celler høstet på dag 3 vs dag 9 i deres logaritmiske ekspansion fase.
Der er...

Chimeric antigen receptorer (biler) giver en lovende tilgang til at omdirigere T-celler mod forskellige tumor antigener. Biler er syntetiske receptorer, der binder et antigen mål. Mens deres præcise sammensætning er variabel, biler indeholder generelt 3 forskellige domæner. Det ekstracellulære domæne dirigerer binding til et målantigen og består typisk af et enkelt kæde antistoffragment, der er knyttet til bilen via et ekstracellulært hængsel. Det andet domæne, almindeligvis afledt af CD3ζ kæden af T Cell receptor (TCR) kompleks, fremmer T celle aktivering efter bil engagement. En tredje costimulatory domæne er inkluderet for at forbedre T celle funktion, engraftment, metabolisme, og vedholdenhed. Succesen af bil T celleterapi i forskellige hæmatopoietiske maligniteter herunder B-celle akut lymfoblastær leukæmi (alle), kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL) og multipelt myelomatose fremhæver den terapeutiske løfte om denne tilgang1,2,3,4,5,6. De seneste godkendelser af fødevare-og lægemiddel administration (FDA) for to CD19-specifikke CAR T-celle terapier, tisagenlecleucel til pædiatriske og unge voksne alle og axicabtagene ciloleucel til diffus stor B-celle-lymfom, forstærker den translationelle fortjeneste af CAR T-celleterapi.
BIL T-baserede tilgange involverer isolering af T-celler fra perifert blod, aktivering, genetisk modifikation, og ekspansion ex vivo. Differentiering er en vigtig parameter regulerer bil T celle effektivitet. Derfor, at begrænse T Celledifferentiering under ex vivo kultur øger evnen af det inbrugte produkt til at forankret, udvide, og fortsætter, at give langsigtet immun overvågning efter adoptiv overførsel2,7,8,9. T-cellerne består af flere forskellige delsæt, herunder: naive T-celler (TN), central hukommelse (TCM), Effector-hukommelse (tem), Effector-differentieret (tte) og stamcelle hukommelse (TSCM). Effector differentierede T-celler har potent cytolytisk evne; men de er korte levede og forankret dårligt10,11,12. I modsætning, t-celler med en mindre differentieret fænotype, herunder naive T-celler og TCM udviser overlegne engraftment og proliferativ evner efter adoptiv celle overførsel13,14,15,16,17,18. Sammensætningen af de indsamlede T-celler i det præproducerede produkt kan variere på tværs af patienterne og korrelerer med det terapeutiske potentiale af bil-T-celler. Andelen af T-celler med en naiv-lignende immunophenotype i Start aferese-produktet er meget korreleret med både engraftment og klinisk respons19.
Kultur varighed er en vigtig parameter, der påvirker differentiering i bil T-celler forberedt til adoptivoverførsel. Vi har for nylig udviklet en tilgang til at generere overlegen kvalitet bil T-celler ved hjælp af en forkortet kultur paradigme20. Ved hjælp af vores tilgang, vi viste, at begrænset kultur giver anledning til bil T celler med overlegen Effector funktion og persistens efter adoptiv overførsel i xenograft modeller af leukæmi. Her præsenterer vi de tilgange til pålideligt generere CART19 celler (autologous T-celler konstrueret til at udtrykke anti-CD19 scFv knyttet til CD3ζ og 4-1BB signalering domæner) og omfatte en detaljeret beskrivelse af de analyser, der giver indsigt i bil T Bioaktivitet og effektivitet forud for adoptivoverførsel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

Adoptiv immunterapi holder løfte om behandling af kræft og smitsomme sygdomme. Vi beskriver en enkel tilgang til transduce primære humane T-celler med chimerisk antigen receptor (CAR) og udvider deres afkom ex vivo. Vi medtager assays til måling af BILEKSPRESSION samt differentiering, proliferativ kapacitet og cytolytisk aktivitet. Vi beskriver assays til måling af Effector cytokin produktion og inflammatorisk cytokinsekretion i bil T-celler. Vores tilgang giver en pålidelig og omfattende metode til kultur bil T celler for prækliniske modeller af adoptiv immunterapi.

Ved hjælp af de metoder, der er beskrevet ovenfor, stimulerede og ekspanderede vi T-celler i enten 3 eller 9 dage (figur 1A, B). Vi analyserede også deres differentierings profil, som indikeret af den gating strategi, som er skitseret i figur 1C, ved at måle den overflod af særskilte glykoproteiner udtrykt på cellens overflade. Vi udviser et progressivt skift i retning af Effector differentiering over tid under ex vivo kult...

Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Vi beskriver en tilgang til pålideligt at generere chimeriske antigen receptor (bil) T-celler og teste deres differentiering og funktion in vitro og in vivo.

Fremstilling af Chimeric antigen receptor (bil) T-celler til adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating et CAR T Cell produkt med funktionel kompetence, der indkapsrer, formere sig og har cit-el-uric aktivitet efter infusion er en vigtig komponent i en effektiv adoptivimmunterapi. For eksempel, i solide tumorer, CAR T celler, de kan trænge ind i faste tumorer, og de modtager optimal antigen stimulation;dog, deres samlede engraftment og spredning er hæmmet i mennesker. Den største fordel ved denne fremgangsmåde er, at den kan bevare kvaliteten af CAR T-cellerne eller differentieringstilstanden for CAR T-cellerne uden at generere terminalt differentierede eller udtømte T-celler, hvilket ville have mindsket spredningskapaciteten eller dårlig effektiv funktion efter infusionen.Denne teknik kan være vanskelig, fordi T-celler er meget følsomme over for deres cellekoncentration eller overfladearealet af de fartøjer, som deres dyrkede i. Samt deres metaboliske behov. Væsentlige T-celler skal holdes glade i hele processen, ellers vil de ikke vokse.For at begynde denne procedure, der er fastsat 6-godt kultur retter. Aktiver friske eller kryokonserverede primære menneskelige T-celler ved at blande dem med anti-CD3 CD28 magnetiske perler, i et forhold på tre perler pr. T-celle i brøndene i kulturretterne. Dyrkultur T-cellerne i X-Vivo 15 medium suppleret med normal human AB serum, L-glutamin, han-tisser og IL2.Aktivér T-cellerne i en koncentration på en million T-celler pr. milliliter under ekspansion. Og kultur dem på 37 grader Celsius med 20% ilt, 5% kuldioxid og 95% fugtighed. Efter natten stimulation, tilføje lentiviral supernatants til de aktiverede T-celler.Beregn mængden af supernatanter, der er nødvendige for at opnå en mangfoldighed af infektion mellem tre og fem. Fortsæt med at dyrke cellerne ved hjælp af de samme betingelser. På dag tre, indsamle en repræsentativ aliquot af cellerne i kryo-konservering.Før kryo-konservering, fjerne de magnetiske perler ved forsigtigt pipettering og magnetisk adskillelse. Forbered frysemediet, som indeholder PBS med 0,5%DMSO. Og opbevar den ved fire grader Celsius, indtil den er klar til brug.Dernæst centrifuge T-cellerne ved 300 gange G i fem minutter. Kassér supernatanten og tilsæt fem milliliter PBS. Centrifuge cellerne igen ved 300 gange G i fem minutter og kassér PBS.Vi suspenderer pellanten i en milliliter koldt kryobevaringsmedium. T-cellerne fryses i en kølet frysebeholder. Og opbevares på minus 80 grader Celsius i 48 timer.Derefter overføres de frosne celler til flydende nitrogen. Resten af T-cellerne vaskes én gang i fem milliliter PBS for at fjerne eventuelle resterende vektorer. Centrifuge ved 300 gange G i fem minutter.Derefter dekanteres PBS og re-suspendere cellen pellant i T celle kultur medium ved en koncentration på 500, 000 celler pr milliliter. Opdel T-cellerne i to kulturer designet 45 og ni. T-cellerne tælles efter flowcytometri ved hjælp af tælleperler og monoklonale antistoffer til humane CD4 og CD8.Samt en levedygtighed farvestof. Genindsaml kulturerne hver anden dag for at opretholde dem i en koncentration på 500.000 celler pr. milliliter. På dag fem, tælle og kryo-bevare dag fem kulturer som tidligere beskrevet.På dag syv, vask 500, 000 celler i PBS. Og re-suspendere dem i 100 mikroliter af fluorescens aktiveret celle sortering buffer. Derefter detektere CAR overflade protein udtryk ved immun-farvning med en fluorescerende konjugeret anti-CAR 19 idio-type ved flow cytometri.På dag ni tæller og kryo-bevare dag ni kulturer som tidligere beskrevet. I denne undersøgelse måles funktionen og effekten af CAR T-celler, der høstes med varierende intervaller i hele X-Vivo-kulturen. Ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i denne video, stimuleres T-celler og udvides til enten tre eller ni dage.Cellerne differentiering profil som angivet i gating strategi vist her, analyseres ved at måle den overflod af forskellige glycoproteiner udtrykt på celleoverfladen. Et progressivt skift i retning af effekt eller differentiering ses over tid under X-Vivo-kulturen. Car T-cellernes effektorfunktion og prolifererende kapacitet som reaktion på antigen vurderes derefter.Celler, der er udvidet mindre er funktionelt overlegen i forhold til dem, der i vid udstrækning dyrkes over en længere varighed. I en human xenograft musemodel af alle styrken af CAR T-celler, der høstes på forskellige tidspunkter, sammenlignes. De ni dages celler viser en dosisafhængig anti-lukemisk respons med en komplet respons værd en høj dosis på tre millioner;og et tab af effekt for den lave dosis på 500, 000.Men, dagen tre celler viste vedvarende tumor kontrol i både høje og lave doser. Dette respons er forbundet med det absolutte antal CAR-T 19 i det perifere blod hos mus. Samlet set viser disse resultater, at CAR T-celler, der er høstet tidligere, overgår dem, der høstes senere.Efter denne procedure, yderligere funktion assays såsom søhest assay kan udføres for at måle deres metaboliske egenskaber såsom iltforbrug eller spir-it-ed kapacitet. Flere runder af re-stimulation kan også udføres for at give indsigt i deres differentiering og persistens af CAR T-celler. Ved at bruge dette arbejde som fundament er vi og andre forskere engageret i undersøgelser for at forkorte kulturprocessen yderligere.Det kan også udvides i centrale tilgange design for andre kræftantigener. Der skal altid være forsigtighed, når du arbejder med lentivirus. Men selv når lentivirus er manipuleret til at være replikation inkompetente.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngeneic musen B-celle lymfom Model for præ-klinisk evaluering af CD19 bil T celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En klumpformet drab Assay af bil T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Forberedelse af Exosomes til siRNA levering til kræftceller

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro Tumor celle Rechallenge For intelligent evaluering af kimære Antigen Receptor T-celle Antitumor funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Brug af CRISPR/Cas9 til at udskære GM-CSF i bil-T-celler

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultralyd-guidet Ortotopisk implantation af murin Pankreatisk ductal adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolering af humane perifere blodmononukleære celler og CD4 + T-celler fra Sézary syndrom patienter til transkriptomisk profilering

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamisk billeddannelse af kimære antigenreceptor-T-celler med [18F]tetrafluorborat positronemissionstomografi/computertomografi

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Vurdering af kimær antigenreceptor T-celleassocieret toksicitet ved hjælp af en patientafledt xenograft musemodel med akut lymfoblastær leukæmi

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...