Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Dit werk werd deels gesteund door middel van financiering door Novartis Pharmaceuticals via een onderzoeksinfrastructuur met de Universiteit van Pennsylvania (Michael C. Milone) en de St. Baldricks Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Universiteit van Pennsylvania.
1. T celactivering, transductie en uitbreiding
<ol><li>Activeer verse of cryopreserved primaire menselijke T cellen door te mengen met anti CD3/CD28 magnetische kralen (bijv. dynabeads) in een verhouding van 3 kralen per T cel in 6-well celcultuurgerechten. Kweek T cellen in X-VIVO 15 medium aangevuld met 5% normaal humaan AB serum, 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES en I...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

Hier beschrijven we de benaderingen voor het meten van de functie en werkzaamheid van auto-T-cellen die met verschillende intervallen worden geoogst in de ex vivo-cultuur. Onze methoden bieden uitgebreid inzicht in assays die zijn ontworpen om proliferatieve capaciteit en Effector functie in vitro te beoordelen. We beschrijven hoe te meten auto t cel activiteit na stimulatie door de auto en detail xenotransplantaatmodellen is modellen van leukemie met behulp van auto t cellen geoogst op dag 3 vs dag 9 van hun logaritmisc...

Chimeric antigeen receptoren (Auto's) bieden een veelbelovende aanpak om te leiden T-cellen tegen verschillende tumor antigenen. Auto's zijn synthetische receptoren die een antigeen doelwit binden. Hoewel hun precieze samenstelling variabel is, bevatten Auto's over het algemeen 3 verschillende domeinen. Het extracellulaire domein leidt binding aan een doel antigeen en bestaat meestal uit een single Chain antilichaam fragment gekoppeld aan de auto via een extracellulaire scharnier. Het tweede domein, vaak afgeleid van de CD3ζ keten van het T Cell receptor (TCR) complex, bevordert de activering van de T-cel na de betrokkenheid van de auto. Een derde costimulatory domein is opgenomen ter verbetering van de functie van de T-cel, engraftment, metabolisme, en persistentie. Het succes van auto T-cel therapie in verschillende hematopoietische maligniteiten, waaronder B-cel acute lymfoblastische leukemie (alle), chronische lymfatische leukemie (CLL) en multipel myeloom wijst op de therapeutische belofte van deze aanpak1,2,3,4,5,6. De recente Food and Drug Administration (FDA) goedkeuringen voor twee CD19-specifieke CAR T Cell therapieën, tisagenlecleucel voor pediatrische en jong volwassen ALL en axicabtagene ciloleucel voor diffuus groot B-cel lymfoom, versterkt de translationele verdienste van auto T-cel therapie.
AUTO T-gebaseerde benaderingen omvatten het isoleren van T-cellen van perifeer bloed, activering, genetische modificatie en expansie ex vivo. Differentiatie is een belangrijke parameter die de werkzaamheid van de CAR T cel regelt. Daarom versterkt het beperken van de celdifferentiatie tijdens de ex vivo-cultuur het vermogen van het geïnfundeerd product om te graveren, uit te breiden en te blijven bestaan, waardoor lange termijn immunosurveillance wordt gegeven na adoptie overdracht2,7,8,9. T-cellen bestaan uit verschillende afzonderlijke subsets, waaronder: naïeve T-cellen (TN), centraal geheugen (TCM), Effector-geheugen (TEM), Effector-gedifferentieerd (TTE) en stamcel geheugen (TSCM). Effector gedifferentieerde T cellen hebben krachtige cytolytische vermogen; ze zijn echter van korte duur en graveren slecht10,11,12. T-cellen met een minder gedifferentieerd fenotype, met inbegrip van naïeve T-cellen en TCM vertonen daarentegen superieure engraftment en proliferatieve vaardigheden na adoptie van celoverdracht13,14,15,16,17,18. De samenstelling van de verzamelde T-cellen in het Voorgefabriceerde product kan variëren tussen patiënten en correleert met het therapeutische potentieel van auto T-cellen. Het aandeel van T-cellen met een naïef immunoffenol type in het startende aferese product is sterk gecorreleerd met zowel engraftment als klinische respons19.
Cultuur duur is een belangrijke parameter die de differentiatie in auto T-cellen voorbereid voor adoptie overdracht beïnvloedt. We hebben onlangs een aanpak ontwikkeld voor het genereren van superieure kwaliteit auto T-cellen met behulp van een verkorte cultuur paradigma20. Met behulp van onze aanpak, we toonden dat beperkte cultuur geeft aanleiding tot auto T cellen met superieure Effector functie en persistentie na adoptie overdracht in xenotransplantaatmodellen is modellen van leukemie. Hier presenteren we de benaderingen om betrouwbaar te genereren CART19 cellen (autologe T cellen ontworpen om uit te drukken anti-CD19 scFv gekoppeld aan CD3ζ en de 4-1BB signalering van domeinen) en bevatten een gedetailleerde beschrijving van de assays die inzicht geven in auto T bioactiviteit en werkzaamheid voorafgaand aan adoptie overdracht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

Adoptie immunotherapie is veelbelovend voor de behandeling van kanker en infectieziekten. We beschrijven een eenvoudige benadering om primaire menselijke T-cellen te leiden met een chimerische antigeen receptor (auto) en hun nageslacht ex vivo uit te breiden. We nemen assays op om auto-expressie te meten, evenals differentiatie, proliferatieve capaciteit en cytolytische activiteit. We beschrijven assays meten Effector cytokine productie en inflammatoire cytokine secretie in auto T-cellen. Onze aanpak biedt een betrouwbare en uitgebreide methode voor cultuur auto T-cellen voor preklinische modellen van adoptie immunotherapie.

Met behulp van de hierboven beschreven methoden hebben we de T-cellen voor 3 of 9 dagen gestimuleerd en uitgebreid (Figuur 1A, B). We analyseerden ook hun differentiatie profiel, zoals aangegeven door de gating-strategie in Figuur 1C, door het meten van de overvloed aan verschillende glycoproteïnen uitgedrukt op het celoppervlak. We tonen een progressieve verschuiving naar Effector differentiatie in de tijd tijdens de ex vivo c...

Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

We beschrijven een aanpak om betrouwbaar te genereren chimeer antigeen receptor (auto) T cellen en testen hun differentiatie en functie in vitro en in vivo.

Productie van Chimerische antigeen receptor (auto) T cellen voor adoptie immunotherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating een CAR T Cell product met functionele competentie die engraft, vermenigvuldigen en heeft cit-el-uric activiteit na infusie is een belangrijk onderdeel van een effectieve adoptie-immunotherapie. Bijvoorbeeld, in vaste tumoren, CAR T cellen kunnen ze doordringen vaste tumoren en ze krijgen optimale antigeen stimulatie;echter, hun algehele engraftment en proliferatie wordt belemmerd bij mensen. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat het de kwaliteit van de CAR T-cellen of de differentiatietoestand van de CAR T-cellen kan behouden zonder terminaal gedifferentieerde of uitgeputte T-cellen te genereren, wat de proliferative capaciteit of een slechte effectieve functie na infusie zou hebben verminderd.Deze techniek kan moeilijk zijn omdat T-cellen zijn zeer gevoelig voor hun celconcentratie of het oppervlak van de vaten die hun gekweekt in. Evenals hun metabolische behoeften. In wezen T-cellen moeten gelukkig worden gehouden gedurende het hele proces, anders zullen ze niet groeien.Om deze procedure te beginnen, uiteengezet 6-well cultuur gerechten. Activeer verse of cryo-bewaarde primaire menselijke T-cellen door ze te mengen met anti-CD3 CD28 magnetische kralen, met een verhouding van drie kralen per T-cel in de putten van de kweekgerechten. Kweek de T-cellen in X-Vivo 15 medium aangevuld met normaal menselijk AB serum, L-glutamine, he-pees en IL2.Activeer de T-cellen met een concentratie van een miljoen T-cellen per milliliter tijdens de expansie. En kweek ze bij 37 graden Celsius met 20%zuurstof, 5% kooldioxide en 95% vochtigheid. Voeg na s nachts stimulatie lentivirale supernatants toe aan de geactiveerde T-cellen.Bereken het volume van supernatants die nodig zijn om een veelheid van infectie tussen drie en vijf te bereiken. Doorgaan met het kweken van de cellen met dezelfde voorwaarden. Verzamel op dag drie een representatief aliquot van de cellen van cryo-bewaring.Verwijder voorafgaand aan cryo-bewaring de magnetische kralen door zachtjes pipetten en magnetische scheiding. Bereid het vriesmedium, dat PBS bevat met 0,5%DMSO. En bewaar het op vier graden Celsius tot klaar voor gebruik.Vervolgens centrifugeren de T-cellen op 300 keer G gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en voeg vijf milliliter PBS toe. Centrifugeren de cellen opnieuw op 300 keer G gedurende vijf minuten en gooi de PBS.We schorten de pellant op in een milliliter koud cryo-conserveringsmedium. Vries de T-cellen in een gekoelde vriescontainer. En bewaar op min 80 graden Celsius voor 48 uur.Breng hierna de bevroren cellen over op vloeibare stikstof. Was de rest van de T-cellen eenmaal in vijf milliliter PBS om eventuele resterende vectoren te elimineren. Centrifuge op 300 keer G gedurende vijf minuten.Decanteer de PBS en schort de cel pellant opnieuw op in T-celkweekmedium met een concentratie van 500.000 cellen per milliliter. Splits de T-cellen in twee culturen ontworpen 45 en negen. Tel de T-cellen door stroom cytometrie met behulp van het tellen van kralen en monoklonale antilichamen aan de menselijke CD4 en CD8.Evenals een levensvatbaarheid kleurstof. Voer de culturen om de andere dag om ze te handhaven op een concentratie van 500,000 cellen per milliliter. Op dag vijf, tellen en cryo-behouden de dag vijf culturen zoals eerder beschreven.Op dag zeven, was 500.000 cellen in PBS. En schors ze opnieuw in 100 microliters van fluorescentie geactiveerde celsorteerbuffer. Detecteer vervolgens de oppervlakte-eiwitexpressie van de CAR door immuno-kleuring met een fluorescerende geconjugeerde anti-CAR 19 idio-type door stroomcytometrie.Op dag negen tellen en cryo-behouden de dag negen culturen zoals eerder beschreven. In deze studie worden de functie en werkzaamheid van CAR T-cellen gemeten die met verschillende intervallen in de X-Vivo-cultuur worden geoogst. Met behulp van de methoden beschreven in deze video, T-cellen worden gestimuleerd en uitgebreid voor drie of negen dagen.Het cellendifferentiatieprofiel zoals aangegeven door de hier getoonde gatingstrategie, wordt geanalyseerd door de overvloed aan duidelijke glycoproteïnen op het celoppervlak te meten. Een geleidelijke verschuiving naar effector differentiatie wordt gezien in de tijd tijdens de X-Vivo cultuur. De effectorfunctie en proliferative capaciteit van CAR T-cellen in reactie op antigeen wordt vervolgens beoordeeld.Cellen die minder worden uitgebreid zijn functioneel superieur aan die op grote schaal gekweekt over een langere duur. In een menselijk xenograft muismodel van ALL wordt de potentie van CAR T-cellen die in verschillende perioden worden geoogst, vergeleken. De negen daagse cellen tonen een dosisafhankelijke anti-lukemische respons met een volledige respons ter waarde van een hoge dosis van drie miljoen; en een verlies van werkzaamheid voor de lage dosis van 500.000.Echter, de dag drie cellen toonde aanhoudende tumor controle in zowel hoge als lage doses. Deze respons wordt geassocieerd met de absolute telling van CAR-T 19 in het perifere bloed van muizen. Over het geheel genomen leveren deze resultaten aan dat CAR T-cellen die eerder zijn geoogst, beter presteren dan de later geoogste cellen.Na deze procedure kunnen aanvullende functietesten worden uitgevoerd, zoals zeepaardjestest om hun metabolische eigenschappen te meten, zoals zuurstofverbruik of spir-it-ed capaciteit. Verschillende rondes van re-stimulatie kunnen ook worden uitgevoerd om inzicht te geven in hun differentiatie en persistentie van CAR T-cellen. Met behulp van dit werk als basis zijn wij en andere onderzoekers bezig met studies om het cultuurproces verder af te korten.Het kan ook worden uitgebreid in de kern benaderingen ontwerp voor andere kanker antigenen. Zorg moet altijd worden genomen wanneer u werkt met lentivirus. Maar zelfs wanneer het lentivirus is ontworpen om replicatie incompetent te zijn.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Een Syngeneic B-cel lymfoom muismodel voor pre-klinische evaluatie van CD19 auto T cellen

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Een sferoïde doden Assay door auto T cellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Voorbereiding van Exosomes van siRNA levering aan kankercellen

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

CRISPR/Cas9 gebruiken om GM-CSF uit te nemen in CAR-T-cellen

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Echografie-geleide Orthotopic implantatie van Murine pancreatic Ductal adenocarcinoom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isoleren van menselijke perifere bloedmonucleaire cellen en CD4 + T-cellen van patiënten met het Sézary-syndroom voor transcriptomische profilering

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamische beeldvorming van chimere antigeenreceptor T-cellen met [18F]Tetrafluoroboraat positronemissietomografie/computertomografie

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Beoordeling van chimere antigeenreceptor T-celgeassocieerde toxiciteiten met behulp van een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmuismodel

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...