Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise durch die Finanzierung durch Novartis Pharmaceuticals durch eine Forschungsallianz mit der University of Pennsylvania (Michael C. Milone) sowie den St. Baldrick es Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi) unterstützt.

Alle Tierstudien werden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania genehmigt.
1. T-Zellaktivierung, Transduktion und Erweiterung
<ol><li>Aktivieren Sie frische oder kryokonservierte primäre menschliche T-Zellen, indem Sie mit Anti-CD3/CD28-Magnetperlen (z. B. Dynabeads) im Verhältnis 3 Perlen pro T-Zelle in 6-Well-Zellkulturschalen mischen. Kultur-T-Zellen in X-VIVO 15 Medium ergänzt mit 5% normalem humanem AB-Serum, 2 mM L-Glutamin, 20 mM HEPES und IL2...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

Hier beschreiben wir Ansätze zur Messung der Funktion und Wirksamkeit von CAR-T-Zellen, die in unterschiedlichen Intervallen in der Ex-vivo-Kultur geerntet werden. Unsere Methoden bieten umfassende Einblicke in Assays zur Beurteilung der Proliferativen Kapazität sowie der Effektorfunktion in vitro. Wir beschreiben, wie man die AKTIVITÄT von CAR T-Zellen nach Stimulation durch die CAR misst und Xenograft-Modelle von Leukämie mit CAR-T-Zellen detailliert beschreibt, die am Tag 3 gegen Tag 9 ihrer logarithmischen Expans...

Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) bieten einen vielversprechenden Ansatz, um T-Zellen gegen verschiedene Tumorantigene umzuleiten. CARs sind synthetische Rezeptoren, die ein Antigenziel binden. Obwohl ihre genaue Zusammensetzung variabel ist, enthalten CARs im Allgemeinen 3 verschiedene Domänen. Die extrazelluläre Domäne leitet die Bindung an ein Zielantigen und besteht in der Regel aus einem einkettigen Antikörperfragment, das über ein extrazelluläres Scharnier mit dem CAR verknüpft ist. Die zweite Domäne, die üblicherweise von der CD3-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes (TCR) abgeleitet wird, fördert die T-Zellaktivierung nach CAR-Eingriff. Eine dritte Costimulatorische Domäne ist enthalten, um T-Zell-Funktion zu verbessern, Transplantation, Stoffwechsel, und Persistenz. Der Erfolg der CAR-T-Zelltherapie bei verschiedenen hämatopoetischen Malignomen, einschließlich akuter lymphatischer Leukämie (ALL), chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) und multiplem Myelom, unterstreicht das therapeutische Versprechen dieses Ansatzes1,2,3,4,5,6. Die jüngsten Zulassungen der Food and Drug Administration (FDA) für zwei CD19-spezifische CAR-T-Zelltherapien, Tisagenlecleucel für pädiatrische und junge Erwachsene ALL und Axicabtagene ciloleucel für diffuses großes B-Zell-Lymphom, verstärken den translationalen Wert der CAR T-Zelltherapie.
CAR T-basierte Ansätze beinhalten die Isolierung von T-Zellen aus peripherem Blut, Aktivierung, genetische Veränderung und Expansion ex vivo. Die Differenzierung ist ein wichtiger Parameter, der die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen reguliert. Dementsprechend verbessert die Einschränkung der T-Zell-Differenzierung während der Ex-vivo-Kultur die Fähigkeit des infundierten Produkts, sich zu engrafieren, zu erweitern und fortzubestehen, was eine langfristige Immunüberwachung nach derAdoption2,7,8,9bietet. T-Zellen bestehen aus mehreren unterschiedlichen Teilmengen, darunter: naive T-Zellen (Tn), Zentralgedächtnis (Tcm), Effektorspeicher (Tem), Effektor differenziert (Tte) und Stammzellgedächtnis (Tscm). Effektor differenzierte T-Zellen haben starke zytolytische Fähigkeit; jedoch sind sie kurzlebig und veredeln schlecht10,11,12. Im Gegensatz dazu weisen T-Zellen mit einem weniger differenzierten Phänotyp, einschließlich naiver T-Zellen und Tcm, nach der Adoptivzellübertragung13,14,15,16,17,18eine überlegene Engraftmentierung und proliferative Fähigkeiten auf. Die Zusammensetzung der gesammelten T-Zellen im vorgefertigten Produkt kann von Patient zu Patient variieren und korreliert mit dem therapeutischen Potenzial von CAR-T-Zellen. Der Anteil der T-Zellen mit einem naiven Immunophenotyp im Ausgangsapherese-Produkt ist stark korreliert mit der Transplantation und dem klinischen Ansprechen19.
Die Kulturdauer ist ein wichtiger Parameter, der die Differenzierung in CAR-T-Zellen beeinflusst, die für die Adoptivübertragung vorbereitet sind. Wir haben vor kurzem einen Ansatz entwickelt, um CAR-T-Zellen von höchster Qualität mit einem abgekürzten Kulturparadigma20zu erzeugen. Mit unserem Ansatz zeigten wir, dass eine begrenzte Kultur zu CAR-T-Zellen mit überlegener Effektorfunktion und Persistenz nach Derisübertragung bei Xenograft-Modellen von Leukämie führt. Hier stellen wir die Ansätze zur zuverlässigen Generierung von CART19-Zellen vor (autologe T-Zellen, die entwickelt wurden, um Anti-CD19-SCFv auszudrücken, die an CD3- und die 4-1BB-Signal-Domains angehängt sind) und enthalten eine detaillierte Beschreibung der Assays, die Einblicke in car T Bioaktivität und Wirksamkeit vor der Adoptionsübertragung geben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

Die Adoptivimmuntherapie verspricht die Behandlung von Krebs und Infektionskrankheiten. Wir beschreiben einen einfachen Ansatz, um primäre menschliche T-Zellen mit chimärem Antigenrezeptor (CAR) zu transduzieren und ihre Nachkommen ex vivo zu erweitern. Wir umfassen Assays zur Messung des CAR-Ausdrucks sowie Differenzierung, Proliferativfähigkeit und zytolytische Aktivität. Wir beschreiben Assays zur Messung der Cytokinproduktion und der entzündlichen Zytokinsekretion in CAR-T-Zellen. Unser Ansatz bietet eine zuverlässige und umfassende Methode zur Kultur von CAR-T-Zellen für präklinische Modelle der Adoptivimmuntherapie.

Mit den oben beschriebenen Methoden stimulierten und erweiterten wir T-Zellen für 3 oder 9 Tage(Abbildung 1A,B). Wir analysierten auch ihr Differenzierungsprofil, wie in der in Abbildung 1Cbeschriebenen Gating-Strategie angegeben, indem wir die Häufigkeit von verschiedenen Glykoproteinen, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, gemessen haben. Wir zeigen eine fortschreitende Verschiebung hin zur Effektordifferenzierung ...

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Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Wir beschreiben einen Ansatz zur zuverlässigen Generierung von chimeric antigen receptor (CAR) T-Zellen und testen deren Differenzierung und Funktion in vitro und in vivo.

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Die Delib-er-ating ein CAR T Cell Produkt mit funktioneller Kompetenz, die engraft, vermehrt und hat Cit-el-uric Aktivität nach infusion ist ein Schlüsselbestandteil einer wirksamen Adoptivimmuntherapie. Zum Beispiel, in soliden Tumoren, CAR T-Zellen können sie durch feste Tumoren eindringen und sie erhalten eine optimale Antigenstimulation;jedoch wird ihre allgemeine Engraftmentierung und Proliferation bei Menschen behindert. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er die Qualität der CAR-T-Zellen oder den Differenzierungszustand der CAR-T-Zellen beibehalten kann, ohne endlos differenzierte oder erschöpfte T-Zellen zu erzeugen, was die proliferative Kapazität oder eine schlechte effektive Funktion nach der Infusion verringert hätte.Diese Technik kann schwierig sein, da T-Zellen sehr empfindlich auf ihre Zellkonzentration oder die Oberfläche der Gefäße reagieren, in denen sie kultiviert wurden. Sowie ihre Stoffwechselbedürfnisse. Im Wesentlichen müssen T-Zellen während des gesamten Prozesses glücklich gehalten werden, sonst wachsen sie nicht.Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie 6-Well-Kultur-Gerichte. Aktivieren Sie frische oder kryoerhaltene primäre menschliche T-Zellen, indem Sie sie mit Anti-CD3 CD28-Magnetperlen mischen, im Verhältnis von drei Perlen pro T-Zelle in den Brunnen der Kulturgerichte. Kultur die T-Zellen in X-Vivo 15 Medium ergänzt mit normalen menschlichen AB-Serum, L-Glutamin, he-pees und IL2.Aktivieren Sie die T-Zellen mit einer Konzentration von einer Million T-Zellen pro Milliliter während der Expansion. Und kultursie bei 37 Grad Celsius mit 20% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid und 95% Feuchtigkeit. Nach der nächtlichen Stimulation lentivirale Überstoffe zu den aktivierten T-Zellen hinzufügen.Berechnen Sie das Volumen der Überstande, die notwendig sind, um eine Vielzahl von Infektionen zwischen drei und fünf zu erreichen. Fahren Sie mit der Kultivierung der Zellen unter den gleichen Bedingungen fort. Sammeln Sie am dritten Tag ein repräsentatives Aliquot der Zellen der Kryokonservierung.Entfernen Sie vor der Kryokonservierung die magnetischen Perlen durch sanfte Pipettierung und magnetische Trennung. Bereiten Sie das Gefriermedium vor, das PBS mit 0,5%DMSO enthält. Und lagern Sie es bei vier Grad Celsius, bis es einsatzbereit ist.Als nächstes zentrifugieren Sie die T-Zellen bei 300 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter PBS hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 300 mal G für fünf Minuten und entsorgen Sie die PBS.Wir setzen das Pellant in einem Milliliter kalten Kryo-Konservierungsmedium aus. Einfrieren der T-Zellen in einem gekühlten Gefrierbehälter. Und bei minus 80 Grad Celsius für 48 Stunden lagern.Danach die gefrorenen Zellen in flüssigen Stickstoff übertragen. Waschen Sie den Rest der T-Zellen einmal in fünf Milliliter PBS, um jeden Restvektor zu eliminieren. Zentrifuge bei 300 mal G für fünf Minuten.Dekantieren Sie dann die PBS und setzen Sie das Zellpellant im T-Zellkulturmedium in einer Konzentration von 500.000 Zellen pro Milliliter wieder auf. Teilen Sie die T-Zellen in zwei Kulturen, die 45 und 9 entworfen haben. Zählen Sie die T-Zellen nach Durchflusszytometrie mit Zählperlen und monoklonalen Antikörpern gegen menschliche CD4 und CD8.Ebenso wie ein Lebensfähigkeitsfarbstoff. Füttern Sie die Kulturen jeden zweiten Tag, um sie bei einer Konzentration von 500.000 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Zählen und kryobewahren Sie am fünften Tag die fünf Kulturen, wie zuvor beschrieben.Waschen Sie am siebten Tag 500.000 Zellen in PBS. Und setzen Sie sie in 100 Mikroliter Fluoreszenz aktivierten Zellsortierpuffer wieder aus. Dann erkennen Sie die EXPRESSION von CAR-Oberflächenproteinen durch Immunfärbung mit einem fluoreszierend konjugierten Anti-CAR 19-Idio-Typ durch Durchflusszytometrie.Am neunten Tag zählen und kryobewahren sie den Tag neun Kulturen, wie zuvor beschrieben. In dieser Studie werden die Funktion und Wirksamkeit von CAR-T-Zellen gemessen, die in unterschiedlichen Intervallen in der X-Vivo-Kultur geerntet werden. Mit den in diesem Video beschriebenen Methoden werden T-Zellen für drei oder neun Tage stimuliert und erweitert.Das Zelldifferenzierungsprofil, wie es in der hier gezeigten Gating-Strategie dargestellt wird, wird analysiert, indem die Häufigkeit von verschiedenen Glykoproteinen gemessen wird, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Eine fortschreitende Verschiebung hin zur Effektordifferenzierung zeigt sich im Laufe der Zeit während der X-Vivo-Kultur. Anschließend wird die Effektorfunktion und die proliferative Kapazität von CAR-T-Zellen als Reaktion auf Antigen bewertet.Zellen, die weniger erweitert werden, sind funktional denen überlegen, die über eine längere Dauer ausgiebig kultiviert werden. In einem menschlichen Xenograft-Mausmodell von ALL wird die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen, die zu verschiedenen Zeiträumen geerntet werden, verglichen. Die neun Tage-Zellen zeigen eine dosisabhängige anti-laumische Reaktion mit einer vollständigen Reaktion im Wert von einer hohen Dosis von drei Millionen;und einen Verlust der Wirksamkeit für die niedrige Dosis von 500 000.Jedoch, der Tag drei Zellen zeigten anhaltende Tumorkontrolle in hohen und niedrigen Dosen. Diese Reaktion ist mit der absoluten Anzahl von CAR-T 19 im peripheren Blut von Mäusen verbunden. Insgesamt liefern diese Ergebnisse Beweise dafür, dass CAR-T-Zellen früher geerntet wurden und die später geernteten besser abschneiden.Nach diesem Verfahren können zusätzliche Funktionen wie Seepferdchen-Assay durchgeführt werden, um ihre metabolischen Eigenschaften wie Sauerstoffverbrauch oder Spir-it-ed-Kapazität zu messen. Mehrere Runden der Restimulation können auch durchgeführt werden, um Einen Einblick in ihre Differenzierung und Persistenz von CAR-T-Zellen zu geben. Mit dieser Arbeit als Grundlage beschäftigen wir und andere Forscher Studien, um den Kulturprozess weiter abzukürzen.Es kann auch in Kernansätzen Design für andere Krebsantigene erweitert werden. Bei der Arbeit mit dem Lentivirus ist immer Vorsicht geboten. Aber selbst wenn das Lentivirus entwickelt wird, um Replikation inkompetent zu sein.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Ein Phänomen B-Zell-Lymphom Mausmodell für präklinische Bewertung von CD19-Auto-T-Zellen

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Forschung

Krebsforschung

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Vorbereitung der Exosomen SiRNA Lieferung an Krebszellen

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Verwenden von CRISPR/Cas9 zum Knock Out von GM-CSF in CAR-T-Zellen

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultraschallgeführte orthotopische Implantation von murine Pankreas-Ductalsocarcinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolierung menschlicher mononukleärer Blutzellen und CD4+ T-Zellen von Patienten mit Sézary-Syndrom für transkriptomisches Profiling

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamische Bildgebung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen mit [18F]Tetrafluoroborat-Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...