Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת בחלקו באמצעות מימון שסופקו על ידי התרופות נוברטיס באמצעות ברית מחקר עם אוניברסיטת פנסילבניה (מייקל C. Milone), כמו גם את פרס מלומד בקרן סנט בלדריק (סאבא Ghassemi).

כל לימודי בעלי החיים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת פנסילבניה.
1. הפעלת תא T, התמרה והרחבה
<ol><li>הפעל טרי או cryopreserved מורות האדם הראשי T תאים על ידי ערבוב עם מחרוזות anti CD3/CD28 מגנטי (g., dynabeads) ביחס של 3 חרוזים לכל תא T ב 6-היטב מנות תרבות התא. תרבות T תאים ב...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

כאן אנו מתארים גישות למדוד את הפונקציה ואת היעילות של תאי T רכב שנקטפו במרווחי זמן שונים ברחבי התרבות vivo ex. השיטות שלנו מספקות תובנה מקיפה לתוך בחני שנועדה להעריך את הקיבולת ההתרבות, כמו גם את התפקוד של אפקטור בתוך מבחנה. אנו מתארים כיצד למדוד פעילות תא T המכונית בעקבות גירוי דרך המכונית ופר...

הקולטנים אנטיגן הצ (מכוניות) לספק גישה מבטיחה לנתב מחדש את תאי T נגד אנטיגנים הגידול ברורים. מכוניות הם קולטנים סינתטיים כי לאגד מטרה אנטיגן. בעוד הרכב המדויק שלהם הוא משתנה, מכוניות מכילות בדרך כלל 3 תחומים שונים. תחום החילוץ מורה כריכת אנטיגן היעד הוא מורכב בדרך כלל קטע נוגדן שרשרת אחת המקושרת למכונית באמצעות ציר מסחטות. התחום השני, הנגזר בדרך כלל משרשרת CD3ζ של קולטן תא T (TCR) מורכב, מקדמת הפעלת תא T לאחר האירוסין רכב. תחום מגירוי שלישי כלול כדי לשפר את תפקוד התא T, העפילה, חילוף החומרים והתמדה. ההצלחה של המכונית טיפול בתאי T ב ממאירות המטפאות שונים כולל B לוקמיה לימפובלסטית חריפה (כל), לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) ומיאלומה נפוצה מדגיש את ההבטחה הטיפולית של גישה זו1,2,3,4,5,6. המזון והתרופות האחרונות (FDA) אישורים עבור שתי CD19-ספציפיים מכונית T טיפולים, tisagenlecleucel עבור ילדים ובוגרים צעירים ALL ו-axicabtagene עבור לימפומה מפוזר תא B גדול, מחזקת את הכשרון הטרנסלאליות של טיפול בתאי T מכונית.
שיטות T מבוססות מכונית כרוכות בבידוד של תאי T מ דם היקפי, הפעלה, שינוי גנטי, והרחבת ex vivo. בידול הוא פרמטר חשוב הוויסות מכונית T יעילות תאים. בהתאם לכך, הגבלת בידול תא T במהלך התרבות vivo ex מגביר את היכולת של המוצר המוחדרת כדי חרט, להרחיב, ולהמשיך, מתן מעקב לטווח ארוך החיסונית בעקבות העברה המאמצת2,7,8,9. תאי t מורכבים ממספר קבוצות מערכות ברורות כולל: תאי T תמימים (Tn), זיכרון מרכזי (Tcm), זיכרון אפקטור (Tem), אפקטור הבדיל (Tte) וזיכרון תא גזע (Tscm). אפקטור הבדיל תאים T יש יכולת cytolytic חזקה; עם זאת, הם קצרים חיו והוא חרט גרוע10,11,12. לעומת זאת, תאים t עם הפנוטיפ פחות הבדיל כולל תאי T תמים ו Tcm התערוכה מעולה בתיאום ויכולות ההתרבות בעקבות העברת התא המאמצת13,14,15,16,17,18. הרכב של תאי T שנאספו במוצר שיוצרו מראש יכול להשתנות ברחבי החולים והתואם את הפוטנציאל התרפויטי של מכונית T. היחס של תאי T עם הimmunophenotype נאיבי כמו המוצר המתחיל apheresis הוא מתאם מאוד עם השני והתגובה הקלינית של התשובה19.
משך התרבות הוא פרמטר חשוב המשפיע על בידול בתאי T רכב מוכן העברה המאמצת. פיתחנו לאחרונה גישה כדי ליצור באיכות מעולה בתאי T מכונית באמצעות פרדיגמה תרבות מקוצרת20. באמצעות הגישה שלנו, הראנו כי תרבות מוגבלת מעניקה העלייה לתאי T רכב עם פונקציה מעולה אפקטור והתמדה בעקבות העברה המאמצת במודלים מבע של לוקמיה. כאן, אנו מציגים את הגישות לייצר באופן אמין CART19 תאים (בתאי T אוטוולוגיים הנדסה כדי לבטא anti-CD19 scfv מצורף CD3ζ ו 4-1bb התחומים איתות) וכוללים תיאור מפורט של בחני כי לספק תובנה לתוך מכונית ביולוגי T ויעילות לפני העברה המאמצת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

חיסוני המאמצת מחזיקה הבטחה לטיפול בסרטן ומחלות זיהומיות. אנו מתארים גישה פשוטה לשנות את התאים הראשוניים של האדם הראשי עם קולטן אנטיגן צ'יאריק (רכב) ולהרחיב את הצאצאים שלהם לשעבר vivo. אנו כוללים בחני למדוד ביטוי רכב, כמו גם בידול, קיבולת ההתרבות ופעילות cytolytic. אנו מתארים בחני למדוד את הייצור cy, ציטוקין והפרשת ציטוקין דלקתיים בתאי T רכב. הגישה שלנו מספקת שיטה אמינה ומקיפה לתאי T מכונית התרבות עבור מודלים פרה-קליניים של טיפול חיסוני המאמצת.

באמצעות השיטות המתוארות לעיל, אנו ממריצים והרחיבו תאי T עבור 3 או 9 ימים (איור 1א, ב). כמו כן ניתחנו את פרופיל הבידול שלהם, כפי שמצוין על-ידי אסטרטגיית האיתור המתוארים באיור 1C, על ידי מדידת השפע של גליקורופונים ברורים המתבטאת במשטח התא. אנו מרא...

Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

אנו מתארים גישה מהימנה ליצור הקולטן אנטיגן הצ (רכב) T תאים ולבדוק בידול שלהם ותפקוד מבחנה בvivo.

ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating מוצר CAR T Cell עם יכולת תפקודית כי תחריט, להתרבות ויש לו פעילות cit-el-uric בעקבות עירוי הוא מרכיב מרכזי של אימונותרפיה מאמצת יעילה. לדוגמה, בגידולים מוצקים, תאי CAR T הם יכולים לחדור גידולים מוצקים והם מקבלים גירוי אנטיגן אופטימלי;עם זאת, ההחרטה הכוללת שלהם ואת התפשטות הוא מכשולים באנשים. היתרון העיקרי של גישה זו היא כי זה יכול לשמור על איכות תאי CAR T או מצב ההבחנה של תאי CAR T מבלי ליצור תאי T מובחנים סופניים או מותשים, אשר היה פחת יכולת התפשטות או תפקוד יעיל ירוד בעקבות עירוי.טכניקה זו יכולה להיות קשה כי תאי T רגישים מאוד לריכוז התאים שלהם או לאזור הפנים של כלי הדם שבהם הם מתורבתים. כמו גם הצרכים המטבוליים שלהם. בעיקרו של דבר תאי T צריכים להישמר מאושרים לאורך כל התהליך, אחרת הם לא יגדלו.כדי להתחיל בהליך זה, להגדיר 6 גם מנות תרבות. הפעל תאי T אנושיים ראשוניים טריים או שמורים בהקפאה על-ידי ערבובם עם חרוזים מגנטיים נגד CD3 CD28, ביחס של שלושה חרוזים לתא T בארות של מנות התרבות. תרבות תאי T ב X-Vivo 15 בינוני בתוספת סרום AB אנושי רגיל, L-גלוטמין, he-pees ו IL2.הפעל את תאי T בריכוז של מיליון תאי T למיליליטר במהלך ההתפשטות. ולתרבת אותם ב 37 מעלות צלזיוס עם 20% חמצן, 5% פחמן דו חמצני ו 95% לחות. לאחר גירוי לילה, להוסיף lentiviral על טבעי לתאי T מופעל.לחשב את נפח supernatants הדרושים כדי להשיג ריבוי של זיהום בין שלוש לחמש. המשך culturing התאים באמצעות אותם תנאים. ביום השלישי, לאסוף aliquot נציג של התאים של שימור קריו.לפני שימור קריו, להסיר את חרוזים מגנטיים על ידי צינורות בעדינות והפרדה מגנטית. הכן את אמצעי ההקפאה, המכיל PBS עם 0.5%DMSO. ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.לאחר מכן, צנטריפוגה תאי T ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והוסף חמישה מיליליטר של PBS. צנטריפוגה התאים שוב ב 300 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את PBS.אנחנו להשעות את pellant במיליליטר אחד של מדיום קריו שימור קר. להקפיא את תאי T במיכל הקפאה מקורר. ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.לאחר מכן, להעביר את התאים הקפואים לחנקן נוזלי. לשטוף את שאר תאי T פעם בחמישה מיליליטר של PBS כדי לחסל כל וקטור שיורית. צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות.לאחר מכן, decant PBS ולהשעות מחדש את פלנט התא במדיום תרבות תא T בריכוז של 500, 000 תאים למיליליטר. לפצל את תאי T לשתי תרבויות שתוכננו 45 ותשע. לספור את תאי T על ידי ציטומטריה זרימה באמצעות חרוזים ספירה ונוגדנים חד שבטיים ל CD4 ו- CD8 אנושי.כמו גם צבע הכדאיות. הזינו מחדש את התרבויות כל יומיים כדי לשמור עליהן בריכוז של 500,000 תאים למיליליטר. ביום החמישי, לספור קריו לשמר את היום חמש תרבויות כפי שתואר קודם לכן.ביום השביעי, לשטוף 500, 000 תאים ב PBS. ולהשעות אותם מחדש ב-100 מיקרוליטרים של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות. לאחר מכן, לזהות ביטוי חלבון משטח CAR על ידי אימונו מכתים עם אנטי CAR 19 idio-סוג פלואורסצנטי על ידי ציטומטריה זרימה.ביום התשיעי ספירה והקפאה לשמר את היום תשע תרבויות כפי שתואר קודם לכן. במחקר זה נמדדים הפונקציה והיעילות של תאי CAR T שנקטפים במרווחים משתנים לאורך תרבות X-Vivo. באמצעות השיטות המתוארות בסרטון זה, תאי T מגורים ומורחבים במשך שלושה או תשעה ימים.פרופיל בידול התאים כפי שצוין על ידי אסטרטגיית gating המוצגת כאן, מנותח על ידי מדידת השפע של גליקופרוטאינים ברורים לידי ביטוי על פני התא. שינוי הדרגתי לכיוון ההתברמות של האפקטים נראה לאורך זמן במהלך תרבות X-Vivo. פונקציית המחולל ויכולת השגשוג של תאי CAR T בתגובה לאנטיגן מוערכת לאחר מכן.תאים המורחבים פחות עדיפים מבחינה תפקודית על אלה המתורגם בהרחבה לאורך זמן ארוך יותר. במודל עכבר קסנוגרפט אנושי של כל העוצמה של תאי CAR T שנקטפו בתקופות זמן שונות מושווה. תאי תשעת הימים מראים תגובה אנטי לוקמית תלוית מינון עם תגובה מלאה בשווי מינון גבוה של שלושה מיליון;ואובדן יעילות עבור המינון הנמוך של 500, 000.עם זאת, היום שלושה תאים הראו שליטה מתמדת גידול במינונים גבוהים ונמוכים. תגובה זו קשורה לספירה המוחלטת של CAR-T 19 בדם ההיקפי של עכברים. בסך הכל, תוצאות אלה מספקות ראיות כי תאי T CAR שנקטפו קודם לכן, ביצועים טובים יותר אלה שנקטפו מאוחר יותר.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות פונקציה נוספות כגון בדיקות סוסון ים כדי למדוד את המאפיינים המטבוליים שלהם כגון צריכת חמצן או קיבולת ספיר-it-ed. מספר סבבים של גירוי מחדש יכולים להתבצע גם כדי לספק תובנה על ההתמדה שלהם וההתמדה של תאי CAR T. באמצעות עבודה זו כבסיס אנו וחוקרים אחרים עוסקים במחקרים כדי לקצר את תהליך התרבות עוד יותר.זה יכול גם להיות מורחב בעיצוב גישות הליבה עבור אנטיגנים סרטן אחרים. טיפול תמיד צריך להילקח כאשר אתה עובד עם lentivirus. אבל גם כאשר lentivirus מתוכנן להיות שכפול פסול.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

עכבר Syngeneic B-Cell לימפומה מודל להערכת קליניים בתאי T המכונית CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

הכנה של Exosomes siRNA מסירה תאים סרטניים

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

שימוש CRISPR/Cas9 כדי לשדוד את GM-שדרתי ב-T מכונית תאים

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

אולטרה סאונד-הדרכה אורתודפית של הלבלב מורלין אדנוקרצינומה

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

בידוד תאים חד-גרעיניים של דם היקפי אנושי ותאי T מסוג CD4+ מחולי תסמונת סזארי לצורך פרופיל תעתיק

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

הדמיה דינמית של תאי T קולטן אנטיגן כימרי עם [18F]טטרפלואורובורט טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

הערכה של רעילות הקשורה לקולטן אנטיגן כימרי T באמצעות מודל עכבר קסנוגרפט שמקורו בלוקמיה לימפובלסטית חריפה

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...