Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto in parte attraverso il finanziamento fornito da Novartis Pharmaceuticals attraverso un'alleanza di ricerca con l'Università della Pennsylvania (Michael C. Milone) e il premio St. Baldrick's Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Tutti gli studi sugli animali sono approvati dal Comitato Istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Pennsylvania.
1. Attivazione, trasduzione ed espansione delle cellule T
<ol><li>Attivare le cellule T umane primarie fresche o crioconservate mescolando con perline magnetiche anti CD3/CD28 (ad esempio, dinaline) a un rapporto di 3 perline per cellula T in piatti di coltura cellulare a 6 pozzetti. Cellule T di coltura nel mezzo X-VIVO 15 integrate con 5% siero uman...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

Qui descriviamo gli approcci per misurare la funzione e l'efficacia delle cellule CAR T raccolte a intervalli variabili in tutta la coltura ex vivo. I nostri metodi forniscono una visione completa dei saggi progettati per valutare la capacità proliferaria e la funzione degli effetti in vitro. Descriviamo come misurare l'attività delle cellule CAR T dopo la stimolazione attraverso la CAR e i modelli di xenotrapianto dettagliati della leucemia utilizzando cellule CAR T raccolte al giorno 3 contro il giorno 9 della loro f...

I recettori degli antigeni chimerici (CAT) forniscono un approccio promettente per reindirizzare le cellule T contro antigeni tumorali distinti. I CR sono recettori sintetici che legano un bersaglio dell'antigene. Mentre la loro composizione precisa è variabile, i CAR contengono generalmente 3 domini distinti. Il dominio extracellulare dirige il legame verso un antigene bersaglio ed è in genere costituito da un frammento di anticorpo a catena singola collegato alla CAR tramite una cerniera extracellulare. Il secondo dominio, comunemente derivato dalla catena CD3 del complesso del recettore delle cellule T (TCR), promuove l'attivazione delle cellule T in seguito al coinvolgimento della CAR. Un terzo dominio costimulatory è incluso per migliorare la funzione delle cellule T, innesto, metabolismo, e la persistenza. Il successo della terapia cellulare CAR T in varie neoplasie ematopoietiche tra cui la leucemia linfoblastica acuta a cellule B (ALL), la leucemia linfocitica cronica (CLL) e il mieloma multiplo evidenziano la promessa terapeutica di questo approccio1,2,3,4,5. Le recenti approvazioni della Food and Drug Administration (FDA) per due terapie cellulari CAR T specifiche per CD19, tisagenlecleucel per bambini e giovani adulti ALL e axicabtagene ciloleucel per il linfoma diffuso a grandi cellule B, rafforza il merito traslazionale della terapia cellulare CAR T.
Gli approcci basati su CAR T prevedono l'isolamento delle cellule T dal sangue periferico, l'attivazione, la modificazione genetica e l'espansione ex vivo. La differenziazione è un parametro importante che regola l'efficacia delle cellule CAR T. Di conseguenza, limitare la differenziazione delle cellule T durante la coltura ex vivo migliora la capacità del prodotto infuso di innestare, espandere e persistere, fornendo un'immunosorveglianza a lungo termine dopo il trasferimento adottivo2,7,8,9. Le cellule T sono costituite da diversi sottoinsiemi distinti, tra cui: cellule T ingenue (Tn), memoria centrale (Tcm), memoria efsiatrice (Tem), effettore differenziato (Tte) e memoria delle cellule staminali (Tscm). Le cellule T differenziate dell'effetto hanno una potente capacità citolitica; tuttavia, sono di breve durata e ne innestano male10,11,12. Al contrario, le cellule T con un fenotipo meno differenziato, comprese le cellule T ingenue e Tcm, presentano capacità di innesto e proliferazione superiori dopo il trasferimento delle cellule adottive13,14,15,16,17,18. La composizione delle cellule T raccolte nel prodotto prefabbricato può variare tra i pazienti e correlata al potenziale terapeutico delle cellule T CAR. La proporzione di cellule T con un immunofenotipo ingenuo nel prodotto dell'aferesi iniziale è altamente correlata sia con l'innesto che con la risposta clinica19.
La durata della coltura è un parametro importante che influenza la differenziazione nelle cellule T CAR preparate per il trasferimento adottivo. Recentemente abbiamo sviluppato un approccio per generare cellule CAR T di qualità superiore utilizzando un paradigma di coltura abbreviato20. Utilizzando il nostro approccio, abbiamo dimostrato che una cultura limitata dà origine a cellule CAR T con funzione efsiatrice superiore e persistenza dopo il trasferimento adottivo in modelli di xenotrapianto di leucemia. Qui presentiamo gli approcci per generare in modo affidabile cellule CART19 (cellule T autologhe progettate per esprimere anti-CD19 scFv collegate al CD3 e ai domini di segnalazione 4-1BB) e includiamo una descrizione dettagliata dei saggi che forniscono informazioni sulla bioattività e sull'efficacia di CAR T prima del trasferimento adottivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

L'immunoterapia adottiva promette per il trattamento del cancro e delle malattie infettive. Descriviamo un semplice approccio per trasdurre le cellule T umane primarie con il recettore dell'antigene chimerico (CAR) ed espandere la loro progenie ex vivo. Includiamo saggi per misurare l'espressione CAR, nonché la differenziazione, la capacità proliferare e l'attività citolitica. Descriviamo i saggi per misurare la produzione di citochine e la secrezione infiammatoria di citochina nelle cellule CAR T. Il nostro approccio fornisce un metodo affidabile e completo per la coltura delle cellule T CAR per modelli preclinici di immunoterapia adottiva.

Utilizzando i metodi descritti sopra, abbiamo stimolato e ampliato le cellule T per 3 o 9 giorni (Figura 1A,B). Abbiamo anche analizzato il loro profilo di differenziazione, come indicato dalla strategia di gating delineata nella Figura 1C, misurando l'abbondanza di glicoproteine distinte espresse sulla superficie cellulare. Mostriamo un progressivo spostamento verso la differenziazione degli effetti nel tempo durante la cultura...

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Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Descriviamo un approccio per generare in modo affidabile le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) e testare la loro differenziazione e funzione in vitro e in vivo.

Produzione Chimeric Antigen Receptor (CAR) Cellule T per l'immunoterapia adottiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating un prodotto CAR T Cell con competenza funzionale che si innesta, prolifera e ha attività cit-el-uric dopo l'infusione è un componente chiave di un'efficace immunoterapia adottiva. Ad esempio, nei tumori solidi, le cellule CAR T possono penetrare nei tumori solidi e ricevono una stimolazione antigene ottimale;tuttavia, il loro innesto generale e la proliferazione sono ostacolati nelle persone. Il vantaggio principale di questo approccio è che può mantenere la qualità delle cellule CAR T o lo stato di differenziazione delle cellule CAR T senza generare cellule T terminalmente differenziate o esauste, il che avrebbe diminuito la capacità proliferativa o scarsa funzione efficace dopo l'infusione.Questa tecnica può essere difficile perché le cellule T sono molto sensibili alla loro concentrazione cellulare o alla superficie dei vasi in cui sono coltivate. Così come i loro bisogni metabolici. Essenzialmente le cellule T devono essere mantenute felici durante tutto il processo, altrimenti non cresceranno.Per iniziare questa procedura, impostare piatti di cultura a 6 pozzi. Attivare cellule T umane primarie fresche o crioconviate mescolandole con perline magnetiche CD28 anti-CD3, con un rapporto di tre perline per cellula T nei pozzi dei piatti di coltura. Coltura delle cellule T in mezzo X-Vivo 15 integrata con siero AB umano normale, L-glutammina, he-pees e IL2.Attivare le cellule T ad una concentrazione di un milione di cellule T per millilitro durante l'espansione. E culturarli a 37 gradi Celsius con il 20% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica e il 95% di umidità. Dopo la stimolazione notturna, aggiungere supernaganti lentivirali alle cellule T attivate.Calcola il volume di supernanti necessario per raggiungere una molteplicità di infezione tra tre e cinque. Continuare a coltivare le cellule usando le stesse condizioni. Il terzo giorno, raccogliere un'aliquota rappresentativa delle cellule di crioconservazione.Prima della crioconservazione, rimuovere le perline magnetiche tubazioni e separando magneticamente. Preparare il supporto di congelamento, che contiene PBS con 0,5%DMSO. E conservalo a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso.Quindi, centrifugare le cellule T a 300 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere cinque millilitri di PBS. Centrifugare nuovamente le cellule a 300 volte G per cinque minuti e scartare il PBS.Sospendiamo il pellante in un millilitro di mezzo freddo per la crioconservazione. Congelare le cellule T in un contenitore di congelamento refrigerato. E conservare a meno 80 gradi Celsius per 48 ore.Successivamente, trasferire le cellule congelate in azoto liquido. Lavare il resto delle cellule T una volta in cinque millilitri di PBS per eliminare qualsiasi vettore residuo. Centrifuga a 300 volte G per cinque minuti.Quindi, decantare il PBS e sospendere di nuovo il pellante cellulare nel mezzo di coltura cellulare T ad una concentrazione di 500.000 cellule per millilitro. Dividi le cellule T in due culture progettate 45 e nove. Contare le cellule T per citometria a flusso usando perline di conteggio e anticorpi monoclonali per CD4 e CD8 umani.Così come un colorante di vitalità. Rialimentare le colture a giorni nostri per mantenerle a una concentrazione di 500.000 cellule per millilitro. Il quinto giorno, conta e crio-conserva le cinque culture del giorno come descritto in precedenza.Il settimo giorno, lavare 500.000 cellule in PBS. E sospenderli di nuovo in 100 microlitri di tampone di smistamento cellulare attivato a fluorescenza. Quindi, rilevare l'espressione della proteina superficiale CAR mediante colorazione immuno-coniata fluorescentmente anti-CAR 19 di tipo idio per citometria a flusso.Il primo giorno contano e crio-conservano le nove culture del giorno come descritto in precedenza. In questo studio vengono misurate la funzione e l'efficacia delle cellule CAR T che vengono raccolte a intervalli variabili in tutta la coltura X-Vivo. Utilizzando i metodi descritti in questo video, le cellule T vengono stimolate ed espanse per tre o nove giorni.Il profilo di differenziazione cellulare come indicato dalla strategia di gating mostrata qui, viene analizzato misurando l'abbondanza di glicoproteine distinte espresse sulla superficie cellulare. Un progressivo spostamento verso la differenziazione dell'effettore si vede nel tempo durante la cultura X-Vivo. Viene quindi valutata la funzione dell'effettore e la capacità proliferativa delle cellule CAR T in risposta all'antigene.Le celle espanse meno sono funzionalmente superiori a quelle ampiamente coltivate per una durata più lunga. In un modello di topo xenografto umano di ALL viene confrontata la potenza delle cellule CAR T raccolte in diversi periodi di tempo. Le cellule di nove giorni mostrano una risposta anti-tiepida dose-dipendente con una risposta completa del valore di una dose elevata di tre milioni;e una perdita di efficacia per la bassa dose di 500.000.Tuttavia, il giorno in cui tre cellule hanno mostrato un controllo persistente del tumore sia in dosi alte che basse. Questa risposta è associata al conteggio assoluto di CAR-T 19 nel sangue periferico dei topi. Nel complesso, questi risultati forniscono la prova che le cellule CAR T raccolte in precedenza, superano quelle raccolte in seguito.Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti ulteriori test di funzione come il saggio di cavalluccio marino per misurare le loro proprietà metaboliche come il consumo di ossigeno o la capacità di spir-it-ed. Diversi cicli di ristimolazione possono anche essere eseguiti per fornire informazioni sulla loro differenziazione e persistenza delle cellule CAR T. Usando questo lavoro come base, noi e altri ricercatori siamo impegnati in studi per abbreviare ulteriormente il processo culturale.Può anche essere esteso nella progettazione di approcci di base per altri antigeni del cancro. Prestare sempre attenzione quando si lavora con il lentivirus. Ma anche quando il lentivirus è progettato per essere replicante incompetente.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Un modello di linfoma della B-cellula Syngeneic del topo per la valutazione pre-clinica delle cellule di T di CD19 auto

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Preparazione degli esosomi per siRNA consegna alle cellule tumorali

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro del tumore delle cellule Rechallenge per valutazione predittiva della funzione antitumorale chimerico antigene recettore delle cellule T

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle celle CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane per la generazione di cellule T specifiche dell'antigene tumorale

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Impianto ortotopico a ultrasuoni dell'adenocarcinoma dugalese Murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico umano e delle cellule T CD4+ da pazienti con sindrome di Sézary per la profilazione trascrittomica

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Valutazione delle tossicità associate alle cellule T del recettore dell'antigene chimerico utilizzando un modello murino di xenotrapianto derivato dal paziente per la leucemia linfoblastica acuta

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...