Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

この作品は、ペンシルベニア大学(マイケル・C・ミローン)やセント・ボールドリック財団奨学生賞(サバ・ガセミ)との研究アライアンスを通じて、ノバルティス・ファーマシューティカルズが提供する資金を通じて一部支援されました。

すべての動物研究は、ペンシルベニア大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されています.
1. T細胞の活性化、伝達、拡張
<ol><li>6ウェル細胞培養皿のT細胞あたり3ビーズの割合で抗CD3/CD28磁気ビーズ(例えば、ダイナビーズ)と混合することにより、新鮮または凍結保存された一次ヒトT細胞を活性化します。X-VIVO 15培地中の培養T細胞は、5%正常ヒトAB血清、2mM L-グ...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

ここでは、ex vivo培養を通じて様々な間隔で採取したCAR T細胞の機能と有効性を測定するアプローチについて説明します。当社の方法は、増殖能力とインビトロでのエフェクター機能を評価するように設計されたアッセイに関する包括的な洞察を提供します。3日目から9日目に採取したCAR T細胞を用いたCARおよび白血病の異種移植片モデルを介したCARおよび詳細異種移植モデルを介してCAR T細胞?...

キメラ抗原受容体(CAL)は、T細胞を異なる腫瘍抗原に対してリダイレクトする有望なアプローチを提供する。CARは抗原標的に結合する合成受容体である。正確な構成は可変ですが、CAL には通常 3 つの異なるドメインが含まれています。細胞外ドメインは、標的抗原への結合を指示し、典型的には、細胞外ヒンジを介してCARに連結された単一鎖抗体断片から構成される。第2のドメインは、一般的にT細胞受容体(TCR)複合体のCD3度鎖に由来し、CAR関与に続いてT細胞活性化を促進する。第3の共刺激ドメインは、T細胞機能、生着、代謝、および持続性を増強するために含まれる。B細胞急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)および多発性骨髄腫を含む種々の造血悪性腫瘍におけるCAR T細胞療法の成功は、このアプローチの治療上の約束を強調する1、2、3、4、5、6である。最近の食品医薬品局(FDA)の2つのCD19特異的CAR T細胞療法の承認は、小児および若年成人ALLのためのチザゲンレクリューセルおよびびまん性大細胞リンパ腫のためのアクシキャブタジーンシロロイセルであり、CAR T細胞療法の翻訳上のメリットを強化する。
CAR Tベースのアプローチは、末梢血からのT細胞の単離、活性化、遺伝子組換え、および拡張ex生体内を含む。分化はCAR T細胞の有効性を調節する重要なパラメータである。したがって、ex vivo培養中にT細胞分化を制限することは、注入された生成物が生着、拡大、および持続する能力を高め、養子移送2、7、8、9に続く長期免疫サーベイランスを提供する。T細胞は、ナイーブT細胞(Tn)、中央メモリ(Tcm)、エフェクターメモリ(Tem)、エフェクター分化(Tte)および幹細胞メモリ(Tscm)を含むいくつかの異なるサブセットで構成されています。エフェクター分化T細胞は強力な細胞溶解能を有する;しかし、彼らは短命であり、貧しい10、11、12を生み出します。対照的に、ナイーブT細胞およびTcmを含むあまり分化していない表現型を有するT細胞は、養子細胞移動13、14、15、16、18に続く優れた生着および増殖能力を示す。前製造された製品で収集されたT細胞の組成は、患者間で変化し得るし、CAR T細胞の治療可能性と相関する。開始アフェレシス産物におけるナイーブ様免疫フェノータイプを有するT細胞の割合は、生着および臨床応答19の両方と非常に相関している。
培養持続時間は、養子転法のために調製されたCAR T細胞における分化に影響を及ぼす重要なパラメータである。我々は最近、略培養パラダイム20を用いて優れた品質のCAR T細胞を生成するアプローチを開発した。我々のアプローチを用いて、限られた培養が優れたエフェクター機能を有するCAR T細胞を生じ、白血病の異種移植片モデルにおける養子移入に続く持続性を生み出すことを示した。ここでは、CART19細胞(CD3級および4-1BBシグナル伝達ドメインに付着した抗CD19 scFvを発現するように設計された自己T細胞)を確実に生成するアプローチを提示し、採用転写前のCAR Tの生理活性および有効性に関する洞察を提供するアッセイの詳細な説明を含む。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

養子免疫療法は、癌および感染症の治療のための約束を保持します。キメラ抗原受容体(CAR)で原発性ヒトT細胞を転行し、子孫ex生体内を拡張する簡単なアプローチについて説明します。CAR発現を測定するアッセイと、分化、増殖能力、細胞溶解活性を測定します。CAR T細胞におけるエフェクターサイトカイン産生および炎症性サイトカイン分泌を測定するアッセイについて説明する。当社のアプローチは、養子免疫療法の前臨床モデルのためのCAR T細胞を培養するための信頼性の高い包括的な方法を提供します。

上記の方法を用いて、3日間または9日間T細胞を刺激し、拡張した(図1A,B)。また、図1Cに概説したゲーティング戦略で示されているように、細胞表面に発現する糖タンパク質の存在量を測定して、その分化プロファイルを解析した。ex vivo 培養中の経時のエフェクター分化に向けた進歩的なシフトを示す(図1</s...

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Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を確実に生成し、その分化と機能をインビトロとインビボでテストするアプローチについて説明します。

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞の養子免疫療法用

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

輸液後に増殖し、増殖し、柑内尿活性を有する機能能力を有するCAR T細胞産物を脱-lib-er-ating効果的な養子免疫療法の重要な構成要素である。例えば、固形腫瘍では、CAR T細胞は固形腫瘍に浸透し、最適な抗原刺激を受けるが、全体的な生着および増殖は人々に妨げられる。このアプローチの主な利点は、CAR T細胞の品質を保持することができるか、または、最終的に分化または疲れ果てたT細胞を生成することなくCAR T細胞の分化状態を維持することができ、これは、拡散能力を低下させたか、注入後の有効な機能が低下するであろう。T細胞は細胞濃度や培養した血管の表面積に非常に敏感であるため、この技術は困難な場合があります。彼らの代謝ニーズと同様に。本質的にT細胞は、プロセス全体を通して幸せに保たれる必要があります, そうでなければ、彼らは成長しません.この手順を開始するには、6ウェルの文化料理を用意します。新鮮なまたは凍結保存された一次ヒトT細胞を、培養皿のウェル内のT細胞当たり3個のビーズの割合で抗CD3 CD28磁気ビーズと混合することによって活性化する。T細胞を通常のヒトAB血清、L-グルタミン、ヘピーおよびIL2を添加したX-Vivo15培地中の培養。膨張中に1ミリリットル当たり100万個のT細胞の濃度でT細胞を活性化する。そして、20%の酸素、5%の二酸化炭素と95%の湿度で摂氏37度でそれらを培養します。一晩刺激した後、活性化されたT細胞にレンチウイルス上清を加える。3と5の間の感染の多重度を達成するために必要な上清の量を計算します。同じ条件を使用して細胞を培養し続けます。3日目に、凍結保存の細胞の代表的なアリコートを収集する。凍結保存の前に、穏やかにピペットと磁気分離によって磁気ビーズを除去します。0.5%DMSOのPBSを含む凍結培地を準備します。そして、使用する準備ができるまで摂氏4度で保管してください。次に、T細胞をGの300倍で5分間遠心する。上清を捨て、PBSを5ミリリットル加えます。細胞をGの300倍に5分間再び遠心分離し、PBSを捨てる。冷たい凍結保存培地の1ミリリットルでペラントを吊るします。冷蔵凍結容器内のT細胞を凍結します。そして、48時間マイナス80度で保存します。この後、凍結した細胞を液体窒素に移します。残りのT細胞をPBSの5ミリリットルに1回洗浄して、残留ベクターを排除します。5分間Gの300倍で遠心分離機。次いで、PBSをデカントし、1ミリリットル当たり500,000個の細胞の濃度でT細胞培養培地中の細胞ペラントを再懸濁する。T細胞を45と9の2つの培養物に分割する。ヒトCD4およびCD8に対するカウントビーズおよびモノクローナル抗体を用いて、フローサイトメトリーによってT細胞をカウントする。生菌性染料と同様に。1日おきに培養液を再供給し、1ミリリットル当たり500,000個の細胞の濃度で維持する。5日目には、前に述べたように5日目の文化を数え、クライオ保存します。7日目に、PBSで500,000個の細胞を洗浄します。そして、蛍光活性化細胞選別バッファーの100マイクロリットルでそれらを再中断します。次に、フローサイトメトリーにより蛍光コンジュ化抗CAR19イディオ型で免疫染色によりCAR表面タンパク質発現を検出する。9日目には、前述のように9日目の文化をカウントしてクライオ保存します。本研究では、X-Vivo培養中に様々な間隔で収穫されるCAR T細胞の機能および有効性を測定する。このビデオで説明した方法を使用して、T細胞は刺激され、3日または9日間拡張されます。ここで示す格言戦略で示される細胞分化プロファイルは、細胞表面に発現する別個の糖タンパク質の存在量を測定することによって分析される。エフェクター分化への漸進的なシフトは、X-Vivo培養中に時間の経過とともに見られる。抗原に応答したCAR T細胞のエフェクター機能および増殖能力を評価する。より少なく拡大される細胞は、より長い期間にわたって広範囲に培養されるものよりも機能的に優れている。ヒト異種移植マウスモデルでは、異なる期間に収穫されたCAR T細胞の効力が比較される。9日間の細胞は、300万の高用量の価値がある完全な応答と500,000の低用量の有効性の喪失を有する用量依存性抗lukemic応答を示す。しかし、3日目の細胞は、高用量と低用量の両方で持続的な腫瘍対照を示した。この応答は、マウスの末梢血におけるCAR−T19の絶対数と関連している。全体として、これらの結果は、CAR T細胞が以前に収穫され、後で収穫されたものを上回る証拠を提供する。この手順に従って、タツノオトシゴアッセイなどの追加機能アッセイを行い、酸素消費量またはスピルイットの容量などの代謝特性を測定することができる。CAR T細胞の分化と持続性に関する洞察を提供するために、再刺激のいくつかのラウンドを行うこともできます。この研究を基礎として、私たちや他の研究者は、培養プロセスをさらに短縮する研究に従事しています。また、他の癌抗原のコアアプローチ設計で拡張することができます。レンチウイルスを扱うときは、常に注意が必要です。しかし、レンチウイルスが複製無能であると設計されている場合でも。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

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Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

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