Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

이 작품은 펜실베니아 대학과 연구 동맹을 통해 노바티스 제약에 의해 제공 된 자금을 통해 부분적으로 지원되었다 (마이클 C. 밀론) 뿐만 아니라 세인트 볼드릭의 재단 학자 상 (사바 가세미).

모든 동물 연구는 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인됩니다.
1. T 세포 활성화, 전이 및 확장
<ol><li>6웰 세포 배양 요리에서 T 세포당 3개의 비드의 비율로 안티 CD3/CD28 자기 비드(예를 들어, 다이나비드)와 혼합하여 신선하거나 냉동 보존된 1차 인간 T 세포를 활성화합니다. X-VIVO 15 배지에서 배양 T 세포는 5% 정상 인간 AB 혈청, 2 mM L-글루타민, 20 mM HEPE...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

여기에서 우리는 ex vivo 배양전반에 걸쳐 다양한 간격으로 수확된 CAR T 세포의 기능 및 효능을 측정하는 접근법을 기술한다. 우리의 방법은 시험관내 이펙터 기능뿐만 아니라 증식 능력을 평가하기 위해 고안된 계산에 대한 포괄적인 통찰력을 제공합니다. 우리는 CAR를 통해 자극 다음 CAR T 세포 활동을 측정하는 방법을 설명하고 그들의 로그 방출 단계의 3 대 9 일째에 수확 된 CAR T 세포를 사용하여 ...

키메라 항원 수용체 (CA)는 명백한 종양 항원에 대하여 T 세포를 리디렉션하는 유망한 접근을 제공합니다. CAR은 항원 표적을 결합하는 합성 수용체입니다. 정확한 컴포지션은 가변이지만 CA는 일반적으로 3개의 고유한 도메인을 포함합니다. 세포외 도메인은 표적 항원과 결합하는 것을 지시하며 전형적으로 세포외 힌지를 통해 CAR에 연결된 단일 사슬 항체 단편으로 구성된다. 제2 도메인은, 일반적으로 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 CD3θ 사슬로부터 유래되고, CAR 결합 후 T 세포 활성화를 촉진한다. 세 번째 costimultory 도메인 T 세포 기능을 향상 시키기 위해 포함, 생착, 물질 대사, 그리고 지 속성. B세포 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 다발성 골수종을 포함한 다양한 조혈 악성종양에서 CAR T 세포 치료의 성공은 이 접근법의 치료 적 약속을강조한다 1,2,3,4,5,6. 최근 식품의약국(FDA)은 2개의 CD19 특이적 CAR T 세포 치료제, 소아 및 젊은 성인을 위한 티사겐클레우셀 및 확산대형 B세포 림프종에 대한 액시카브타진 실롤루셀에 대한 승인을 통해 CAR T 세포 치료의 번역 장점을 강화합니다.
CAR T-기반 접근법은 말초 혈액으로부터 T 세포의 분리, 활성화, 유전자 변형, 및 확장 ex vivo를 포함한다. 분화는 CAR T 세포 효능을 조절하는 중요한 파라미터이다. 이에 따라, 생체 배양 시 T 세포 분화를 제한하면 주입된 생성물이 이식, 팽창 및 지속하는 능력을 향상시키고, 입양 전달2,7,8,9에이어 장기적인 면역감시를 제공한다. T 세포는 순진한 T 세포 (Tn), 중앙 기억 (Tcm), 이펙터 메모리 (Tem), 이펙터 분화 (Tte) 및 줄기 세포 메모리 (Tscm)를 포함하는 몇몇 명백한 부체로 이루어져 있습니다. 이펙터 분화 T 세포는 강력한 세포 용해 능력을 갖는다; 그러나, 그들은 짧은 수명과 제대로생착10,11,12. 대조적으로, 순진한 T 세포 및 Tcm을 포함하는 덜 분화된 표현형을 가진 T 세포는 입양세포 전이13,14,15,16,17, 18에이어 우수한 생착 및 증식능력을 나타낸다. 미리 제조된 제품에서 수집된 T 세포의 조성은 환자에 따라 달라질 수 있으며 CAR T 세포의 치료 전위와 상관관계가 있다. 시작 apheresis 생성물에서 순진한 유사 면역 표현형을 가진 T 세포의 비율은 생착 및 임상 반응 둘 다와 높게 상관관계가 있습니다19.
배양 기간은 입양 전달을 위해 제조된 CAR T 세포에서분화에 영향을 미치는 중요한 파라미터이다. 최근 약어 배양 패러다임20을이용하여 우수한 품질의 CAR T 세포를 생성하는 접근법을 개발하였다. 우리의 접근을 사용하여, 우리는 제한된 문화가 백혈병의 이종이식 모형에 있는 채택적인 전송 다음 우수한 이펙터 기능 및 지속성을 가진 CAR T 세포를 초래한다는 것을 보여주었습니다. 여기서, 우리는 CART19 세포(CD3θ 및 4-1BB 신호 전달 도메인에 부착된 항 CD19 scFv를 발현하도록 설계된 자가 T 세포)를 안정적으로 생성하는 접근법을 제시하고, 입양 전적 전에 CAR T 생체 활성 및 효능에 대한 통찰력을 제공하는 검소에 대한 상세한 설명을 포함한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

입양 면역 요법은 암과 전염병의 치료에 대한 약속을 보유하고 있습니다. 우리는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 가진 1 차적인 인간 T 세포를 변환하고 그들의 자손 ex vivo를 확장하는 간단한 접근을 기술합니다. 우리는 CAR 발현뿐만 아니라 분화, 증식 능력 및 세포 분석 활성을 측정하는 분석방법을 포함한다. 우리는 CAR T 세포에서 이펙터 사이토카인 생산 및 염증성 사이토카인 분비를 측정하는 방법을 설명합니다. 우리의 접근은 입양 면역 요법의 전임상 모형을 위한 CAR T 세포를 배양하기 위하여 믿을 수 있고 포괄적인 방법을 제공합니다.

전술한 방법을 사용하여, 우리는 3 일 또는 9 일 동안 T 세포를 자극하고 확장하였다(도 1A,B). 우리는 또한 세포 표면에 표현된 명백한 당단백질의 풍부를 측정하여, 그림 1C에설명된 게이팅 전략에 의해 지시된 바와 같이 그들의 분화 단면도를 분석했습니다. 우리는 생체 배양 동안 시간이 지남에 따라 이펙터 분화를 향한 점진?...

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Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

우리는 안정적으로 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 생성하고 시험관 내 및 생체 내에서 그들의 분화 및 기능을 테스트하는 접근 방식을 설명합니다.

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

주입 다음 구연액을 이식, 증식 및 구형 엘-요식 활성을 가진 기능적 역량을 갖춘 CAR T Cell 제품을 탈리브-er-ating하는 것은 효과적인 입양 면역 요법의 핵심 구성 요소입니다. 예를 들어, 고형 종양에서 CAR T 세포는 고형 종양을 관통할 수 있고 최적의 항원 자극을 받을 수 있지만, 전반적인 이식 및 증식은 사람들에서 방해를 받습니다. 이 접근법의 주요 이점은 말단 분화 또는 소진된 T 세포를 생성하지 않고 CAR T 세포의 품질 또는 분화 상태를 유지할 수 있다는 것입니다.이 기술은 T 세포가 그들의 세포 농도 또는 그들의 배양하는 혈관의 표면적에 아주 민감하기 때문에 어려울 수 있습니다. 뿐만 아니라 그들의 신진 대사 요구. 본질적으로 T 세포는 프로세스 내내 행복하게 유지되어야 하며 그렇지 않으면 성장하지 않습니다.이 절차를 시작하려면 6 웰 문화 요리를 설정합니다. 배양 접시의 우물에서 T 셀 당 3 개의 구슬의 비율로 안티 CD3 CD28 자기 구슬과 혼합하여 신선하거나 냉동 보존 된 기본 인간 T 세포를 활성화합니다. X-Vivo 15 배지에서 T 세포를 배양하여 정상적인 인간 AB 혈청, L-글루타민, he-pees 및 IL2로 보충됩니다.확장 시 밀리리터당 100만 T 세포의 농도로 T 세포를 활성화한다. 그리고 산소 20%, 이산화탄소 5%, 습도 95%로 섭씨 37도에서 배양합니다. 하룻밤 자극 후 활성화 된 T 세포에 렌티 바이러스 슈퍼 나티제를 추가합니다.3에서 5 사이의 감염의 복합성을 달성하는 데 필요한 초월제의 양을 계산합니다. 동일한 조건을 사용하여 세포를 계속 배양합니다. 셋째 날에는 극저온 보존 세포의 대표적인 알리쿼트(aliquot)를 수집한다.저온 보존 전에, 부드럽게 파이펫팅과 자기 분리에 의해 자기 구슬을 제거합니다. PBS가 포함된 동결 매체를 0.5%DMSO로 준비합니다. 그리고 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오.다음으로 T 세포를 300배 G에서 5분간 원심분리합니다. 상체를 버리고 PBS의 5 밀리리터를 추가합니다. 세포를 다시 300배 G에서 5분간 원심분리하고 PBS를 폐기합니다.우리는 차가운 냉동 보존 매체의 1 밀리리터에서 펠란트를 중단합니다. 차가운 냉동 용기에 T 세포를 동결. 그리고 48 시간 동안 영하 80도에 보관하십시오.그 후, 냉동 된 세포를 액체 질소로 옮춘다. 나머지 T 셀을 PBS의 5밀리리터에 한 번 세척하여 잔류 벡터를 제거합니다. 원심분리기는 5분간 300배 G로 합니다.이어서, PBS를 데산시키고 밀리리터당 500, 000세포의 농도로 T 세포 배양 배지에서 세포 펠란트를 다시 중단한다. T 세포를 45와 9로 설계된 두 배양으로 분할합니다. 인간 CD4 및 CD8에 구슬과 단일 클론 항체를 계산하여 혈류 세포측정에 의해 T 세포를 계산합니다.생존 성 염료뿐만 아니라. 밀리리터당 500, 000세포의 농도로 유지하도록 격일배기를 재공급한다. 5일째에는 앞서 설명한 대로 5일째에 카운트와 저온보존이 있다.7일째에는 PBS에서 500, 000셀을 세척합니다. 그리고 형광 활성화 셀 선별 버퍼의 100 마이크로 리터에서 다시 중단. 이어서, 유동 세포형에 의한 형광구 19관용어형으로 면역염색에 의한 CAR 표면 단백질 발현을 검출한다.9일째에는 앞서 설명한 9개의 문화가 있는 날과 극저온보존. 이 연구에서는 X-Vivo 배양 전반에 걸쳐 다양한 간격으로 수확되는 CAR T 세포의 기능 및 효능을 측정한다. 이 비디오에 설명된 방법을 사용하여 T 세포는 3일 또는 9일 동안 자극되고 확장됩니다.여기에 도시된 게이팅 전략에 의해 표시된 세포 분화 프로파일은 세포 표면에 발현된 뚜렷한 당단백질의 풍부를 측정하여 분석된다. X-Vivo 문화 에서 시간이 지남에 따라 이펙터 차별화를 향한 점진적인 변화가 보입니다. 항원에 반응하여 CAR T 세포의 이펙터 기능 및 증식 능력이 평가됩니다.확장되는 세포는 더 긴 기간 동안 광범위하게 배양된 세포보다 기능적으로 우수합니다. 상이한 기간에 수확한 CAR T 세포의 모든 효능의 인간 이종이식 마우스 모델에서 비교된다. 9일 세포는 300만 의 고용량의 완전한 반응으로 용량 의존성 항미주 반응을 나타내며, 500, 000의 저용량에 대한 효능의 상실.그러나, 일 3 세포는 고용량과 낮은 복용량 모두에서 지속적인 종양 제어를 보였다. 이러한 반응은 마우스의 말초 혈액에서 CAR-T 19의 절대 수와 연관된다. 전반적으로, 이 결과는 CAR T 세포가 일찌기 수확했다는 증거를 제공합니다, 나중에 수확한 그 능가.이 절차에 따라, 해마 분석과 같은 추가 기능 분석은 산소 소비 또는 스피잇-잇 용량과 같은 신진 대사 특성을 측정하기 위해 수행 될 수있다. 재자극의 몇몇 라운드는 또한 CAR T 세포의 그들의 분화 그리고 지속성에 통찰력을 제공하기 위하여 수행될 수 있습니다. 이 작품을 기초로 사용하여 우리와 다른 연구자들은 문화 과정을 더 축약하기 위한 연구에 종사하고 있습니다.그것은 또한 다른 암 항 원에 대 한 코어 접근 디자인에서 확장 될 수 있습니다. 렌티바이러스로 작업할 때는 항상 주의를 기울여야 합니다. 그러나 렌티 바이러스가 복제 무능하도록 설계된 경우에도 마찬가지입니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

연구

암 연구학

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

SiRNA 암 세포에 배달에 대 한 Exosomes의 준비

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

CRISPR/Cas9를 사용하여 CAR-T 셀에서 GM-CSF를 제거합니다.

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

뮤린 췌장 연성 선암의 초음파 유도 정형 외 이식

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

전사 프로파일링을 위해 세자리 증후군 환자로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 CD4+ T 세포 분리

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

키메라 항원 수용체 T 세포의 동적 이미징 [18F]테트라플루오로보레이트 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식식 마우스 모델을 이용한 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성 평가

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...