Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet delvis gjennom finansiering levert av Novartis Pharmaceuticals gjennom en forsknings allianse med University of Pennsylvania (Michael C. Milone) samt St. Baldrick ' s Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Alle dyrestudier er godkjent av den institusjonelle Animal Care og bruk komité ved University of Pennsylvania.
1. T Cell aktivisering, Transduction, og ekspansjon
<ol><li>Aktiver fersk eller embryo primære menneskelige T-celler ved å blande med anti CD3/CD28 magnetiske perler (f. eks, dynabeads) i forholdet 3 perler per T celle i 6-brønn cellekultur retter. Kultur T-celler i X-VIVO 15 medium supplert med 5% normal Human AB serum, 2 mM L-glutamin, 20 mM HEPES og IL2 (100 enheter/mL). Oppr...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

Her beskriver vi tilnærminger for å målefunksjonen og effekten av CAR T-celler høstes med varierende intervaller gjennom ex vivo kultur. Våre metoder gir omfattende innsikt i analyser som er utformet for å vurdere proliferativ kapasitet så vel som effektor funksjon in vitro. Vi beskriver hvordan du måler CAR T celle aktivitet etter stimulering gjennom bilen og detalj xenograft modeller av leukemi bruker CAR T celler høstet på dag 3 vs dag 9 av deres logaritmisk ekspansjons fase.
Det ...

Chimeric antigen reseptorer (CARs) gir en lovende tilnærming til å omdirigere T celler mot distinkte tumor antigener. Biler er syntetiske reseptorer som binder et antigen mål. Mens deres eksakte sammensetning er variabel, biler vanligvis inneholder 3 forskjellige domener. Ekstracellulære domenet dirigerer binding til et mål antigen og består vanligvis av ett enkelt kjede antistoff fragment knyttet til bilen via en ekstracellulære hengsel. Den andre domene, som vanligvis stammer fra CD3ζ kjeden av T celle reseptor (TCR) komplekse, fremmer T celle aktivering følgende CAR engasjement. En tredje costimulatory domene er inkludert for å forbedre T celle funksjon, engraftment, metabolisme, og utholdenhet. Suksessen til bil T Cell Therapy i ulike blodkreft ondartet inkludert B Cell akutt lymfatisk leukemi (alle), kronisk lymfatisk leukemi (CLL) og flere myelom fremhever den terapeutiske løftet om denne tilnærmingen1,2,3,4,5,6. De siste Food and Drug Administration (FDA) godkjenninger for to CD19-spesifikke CAR T celle terapier, tisagenlecleucel for pediatric og unge voksne alle og axicabtagene ciloleucel for diffuse store B-celle lymfom, forsterker translational fortjeneste av CAR T celle terapi.
BIL T-baserte tilnærminger innebære isolering av T-celler fra perifert blod, aktivering, genetisk modifisering, og ekspansjon ex vivo. Differensiering er en viktig parameter som regulerer CAR T-celle effekt. Følgelig, begrenser T celle differensiering under ex vivo kultur forbedrer evnen til tilført produktet for å engraft, utvide, og vedvarer, gir lang tids immunosurveillance etter adoptiv overføring2,7,8,9. T-celler består av flere forskjellige delsett, inkludert: naive T-celler (TN), sentral minne (TCM), effektor minne (TEM), effektor differensiert (tte) og Stamcelle minne (TSCM). Effektor differensiert T-celler har potent cytolytisk evne; men de er korte levd og engraft dårlig10,11,12. I kontrast T celler med en mindre differensiert fenotype inkludert naiv T celler og TCM utstillingen overlegen engraftment og proliferativ evner etter adoptiv celle overføring13,14,15,16,17,18. Sammensetningen av de innsamlede T-cellene i det premanufactured produktet kan variere mellom pasienter og samsvarer med det terapeutiske potensialet til CAR T-celler. Andelen T-celler med en naiv-lignende immunophenotype i Start aferese produktet er svært korrelert med både engraftment og klinisk respons19.
Kultur varighet er en viktig parameter som påvirker differensiering i CAR T-celler forberedt for adoptiv overføring. Vi har nylig utviklet en tilnærming til å generere overlegen kvalitet CAR T-celler ved hjelp av en forkortet kultur paradigme20. Ved hjelp av vår tilnærming, viste vi at begrenset kultur gir opphav til CAR T-celler med overlegen effektor funksjon og utholdenhet etter adoptiv overføring i xenograft modeller av leukemi. Her presenterer vi tilnærminger til pålitelig generere CART19 celler (autologous T-celler konstruert for å uttrykke anti-CD19 scFv knyttet til CD3ζ og 4-1BB signalering domener) og inkluderer en detaljert beskrivelse av analysene som gir innsikt i CAR T-bioactivity og effekt før adoptiv overføring.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

Adoptiv immunterapi holder løftet for behandling av kreft og smittsomme sykdommer. Vi beskriver en enkel tilnærming til overfører primære menneskelige T-celler med chimeric antigen reseptor (CAR) og utvide sin avkom ex vivo. Vi inkluderer analyser for å måle CAR-uttrykk, i tillegg til differensiering, proliferativ kapasitet og cytolytisk aktivitet. Vi beskriver analysene for å måle effektor cytokin produksjon og inflammatorisk cytokin sekresjon i CAR T-celler. Vår tilnærming gir en pålitelig og omfattende metode til kultur CAR T-celler for prekliniske modeller av adoptiv immunterapi.

Ved hjelp av metodene beskrevet ovenfor, vi stimulert og utvidet T-celler for enten 3 eller 9 dager (figur 1A, B). Vi har også analysert deres differensiering profil, som indikert av gating strategien skissert i figur 1C, ved å måle overflod av distinkte glykoproteiner uttrykt på celleoverflaten. Vi viser en progressiv forskyvning mot effektor differensiering over tid under ex vivo kultur (figur 1</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Vi beskriver en tilnærming til pålitelig generering av chimeric antigen reseptor (CAR) T-celler og teste deres differensiering og funksjon in vitro og in vivo.

Fremstilling chimeric antigen reseptor (CAR) T celler for adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating et CAR T Cell-produkt med funksjonell kompetanse som engraft, sprer seg og har cit-el-uric aktivitet etter infusjon er en viktig komponent i en effektiv adoptivimmunterapi. For eksempel, i solide svulster, CAR T celler de kan trenge inn i solide svulster og de får optimal antigen stimulering;men deres generelle engraftment og spredning er drevet hos mennesker. Den største fordelen med denne tilnærmingen er at den kan beholde kvaliteten på CAR T-cellene eller differensieringstilstanden til CAR T-cellene uten å generere terminalt differensierte eller utslitte T-celler, noe som ville ha redusert proliferativ kapasitet eller dårlig effektiv funksjon etter infusjon.Denne teknikken kan være vanskelig fordi T-celler er svært følsomme for deres cellekonsentrasjon eller overflatearealet av karene som deres dyrket i. I tillegg til deres metabolske behov. I hovedsak T-celler må holdes lykkelig gjennom hele prosessen, ellers vil de ikke vokse.For å begynne denne prosedyren, sett ut 6-brønns kulturretter. Aktiver friske eller kryo-bevarte primære humane T-celler ved å blande dem med anti-CD3 CD28 magnetiske perler, i forholdet mellom tre perler per T-celle i brønnene til kulturrettene. Kultur T-cellene i X-Vivo 15 medium supplert med normal human AB serum, L-glutamin, han-tisser og IL2.Aktiver T-cellene med en konsentrasjon på en million T-celler per milliliter under ekspansjon. Og kultur dem på 37 grader Celsius med 20% oksygen, 5% karbondioksid og 95% fuktighet. Etter over natten stimulering, legg lentiviral supernatants til de aktiverte T-cellene.Beregn volumet av supernatanter som er nødvendige for å oppnå et mangfold av infeksjon mellom tre og fem. Fortsett å kultere cellene ved hjelp av de samme forholdene. På dag tre, samle en representativ aliquot av cellene i kryo-bevaring.Før kryo-bevaring, fjern de magnetiske perlene ved forsiktig pipettering og magnetisk separasjon. Forbered frysemediet, som inneholder PBS med 0,5%DMSO. Og lagre den på fire grader Celsius til den er klar til bruk.Deretter sentrifuger T-cellene ved 300 ganger G i fem minutter. Kast det overnaturlige og tilsett fem milliliter PBS. Sentrifuger cellene igjen ved 300 ganger G i fem minutter og kast PBS.Vi suspenderer pellanten i ett milliliter kaldt kryobevaringsmedium. Frys T-cellene i en kjølt frysebeholder. Og lagre på minus 80 grader Celsius i 48 timer.Etter dette overfører du de frosne cellene til flytende nitrogen. Vask resten av T-cellene en gang i fem milliliter pbs for å eliminere eventuelle restvektorer. Sentrifuge ved 300 ganger G i fem minutter.Deretter dekanterer PBS og re-suspendere cellepellet i T cellekultur medium i en konsentrasjon på 500,000 celler per milliliter. Del T-cellene i to kulturer designet 45 og ni. Telle T-cellene ved flytcytometri ved hjelp av telleperler og monoklonale antistoffer til menneskelige CD4 og CD8.I tillegg til en levedyktighet fargestoff. Refeed kulturer annenhver dag for å opprettholde dem i en konsentrasjon på 500, 000 celler per milliliter. På dag fem, telle og kryo-bevare dagen fem kulturer som tidligere beskrevet.På dag sju vasker du 500 000 celler i PBS. Og re-suspendere dem i 100 mikroliter av fluorescens aktivert celle sortering buffer. Deretter oppdager DU CAR overflateproteinuttrykk ved immunfarging med fluorescerende konjugert anti-CAR 19 idio-type ved strømningscytometri.På dag ni teller og kryo-bevare dagen ni kulturer som tidligere beskrevet. I denne studien måles funksjonen og effekten av CAR T-celler som høstes med varierende intervaller i hele X-Vivo-kulturen. Ved hjelp av metodene som er beskrevet i denne videoen, stimuleres T-celler og utvides i enten tre eller ni dager.Cellene differensiering profil som indikert av gating strategi vist her, analyseres ved å måle overflod av distinkte glykoproteiner uttrykt på celleoverflaten. Et progressivt skifte mot effekteller differensiering ses over tid under X-Vivo-kulturen. Effektorfunksjonen og den proliferative kapasiteten til CAR T-celler som svar på antigen vurderes deretter.Celler som utvides mindre er funksjonelt bedre enn de som er mye kultivert over en lengre varighet. I en menneskelig xenograft musemodell av ALL styrken av CAR T celler høstet på ulike tidsperioder sammenlignes. De ni dagers cellene viser en doseavhengig antilukkemisk respons med en komplett respons verdt en høy dose på tre millioner;og et tap av effekt for den lave dosen på 500 000.Men dagen tre celler viste vedvarende tumorkontroll i både høye og lave doser. Denne responsen er forbundet med det absolutte antallet AVCAR-T 19 i perifert blod av mus. Samlet sett gir disse resultatene bevis for at CAR T-celler høstet tidligere, overgår de som høstes senere.Etter denne prosedyren kan ytterligere funksjonsanalyser som sjøhestanalyse utføres for å måle deres metabolske egenskaper som oksygenforbruk eller spir-it-ed kapasitet. Flere runder med restimulering kan også utføres for å gi innsikt i deres differensiering og utholdenhet av CAR T-celler. Ved hjelp av dette arbeidet som grunnlag er vi og andre forskere engasjert i studier for å forkorte kulturprosessen videre.Det kan også utvides i kjerne tilnærminger design for andre kreft antigener. Forsiktighet må alltid tas når du arbeider med lentivirus. Men selv når lentiviruset er konstruert for å være replikering inkompetent.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

En Syngeneic mus B-celle lymfom modell for pre-klinisk evaluering av CD19 bil T-celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En Spheroid drapet analysen av bilen T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Utarbeidelse av Exosomes for siRNA levering til kreftceller

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro svulst celle Rechallenge For prediktiv evaluering av Chimeric Antigen reseptor T celle Antitumor funksjon

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Bruke CRISPR/Cas9 å Knock Out GM-CSF i CAR-T celler

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultralyd-guidet Orthotopic implantation av murine bukspyttkjertelen ductal Adenokarsinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolere mononukleære celler i humant perifert blod og CD4+ T-celler fra Sézary Syndrome-pasienter for transkripsjonsomic profilering

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamisk avbildning av chimeriske antigenreseptor T-celler med [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Vurdering av kimær antigenreseptor T-celleassosiert toksisitet ved bruk av en akutt lymfoblastisk leukemi pasientavledet xenograftmusemodell

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...