Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado em parte através do financiamento fornecido pela Novartis Pharmaceuticals através de uma aliança de pesquisa com a Universidade da Pensilvânia (Michael C. Milone), bem como st. Baldrick's Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Todos os estudos em animais são aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade da Pensilvânia.
1. Ativação de células T, transdução e expansão
<ol><li>Ativar células T humanas primárias frescas ou criopreservadas misturando-se com contas magnéticas anti CD3/CD28 (por exemplo, dynabeads) a uma proporção de 3 contas por célula T em pratos de cultura celular de 6 poços. Células T culturais no X-VIVO 15 médias complementadas com 5% de soro ab humano n...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

Aqui descrevemos abordagens para medir a função e eficácia das células T CAR colhidas em intervalos variados ao longo da cultura ex vivo. Nossos métodos fornecem uma visão abrangente sobre ensaios projetados para avaliar a capacidade proliferativa, bem como a função efetiva in vitro. Descrevemos como medir a atividade das células T car após a estimulação através do CAR e detalhar os modelos de xenoenxerto de leucemia usando células T CAR colhidas no dia 3 vs dia 9 de sua fase de expansão logarítica.
<...

Os receptores de antígenos quiméricos (CARs) fornecem uma abordagem promissora para redirecionar as células T contra antígenos tumorais distintos. Cars são receptores sintéticos que ligam um alvo de antígeno. Embora sua composição precisa seja variável, os CARs geralmente contêm 3 domínios distintos. O domínio extracelular direciona a ligação a um antígeno alvo e normalmente é composto por um único fragmento de anticorpo de cadeia ligado ao CAR através de uma dobradiça extracelular. O segundo domínio, comumente derivado da cadeia CD3 do complexo do receptor de células T (TCR), promove a ativação de células T após o engajamento da RCA. Um terceiro domínio costimulatory é incluído para realçar a função da pilha de T, engraftment, metabolismo, e persistência. O sucesso da terapia com células T CAR em várias neoplasias hematopoiéticas, incluindo leucemia linfoblástica aguda (LLA) de células B, leucemia linfocítica crônica (LlCa) e mieloma múltiplo destaca a promessa terapêutica desta abordagem1,2,3,4,5,6. As recentes aprovações da Food and Drug Administration (FDA) para duas terapias específicas de células T car específicas para CD19, tisagenlecleucel para TODOS pediátricos e adultos jovens e ciloleucel axicabtagene para linfoma difuso de grandes células B, reforça o mérito translacional da terapia de células T CAR.
As abordagens baseadas em CAR envolvem o isolamento das células T do sangue periférico, ativação, modificação genética e expansão ex vivo. A diferenciação é um parâmetro importante que regula a eficácia das células T do CAR. Assim, restringir a diferenciação de células T durante a cultura ex vivo aumenta a capacidade do produto infundido de enxertar, expandir e persistir, fornecendo imunovigilância de longo prazo após transferência adotiva2,7,8,9. As células T consistem em vários subconjuntos distintos, incluindo: células T ingênuas (Tn), memória central (Tcm), memória efeora (Tem), efecionista diferenciada (Tte) e memória de células-tronco (Tscm). As células T diferenciadas effector têm potente capacidade ctolítica; no entanto, eles são de curta duração e enxerto mal10,11,12. Em contraste, as células T com um fenótipo menos diferenciado, incluindo células T ingênuas e Tcm exibem enxerto superior e habilidades proliferativas após transferência de células adotivas13,14,15,16,17, 18. A composição das células T coletadas no produto pré-fabricado pode variar entre os pacientes e se correlaciona com o potencial terapêutico das células T CAR. A proporção de células T com um imunofenótipo ingênuo no produto de áherese inicial está altamente correlacionada com o enxerto e a resposta clínica19.
A duração da cultura é um parâmetro importante que influencia a diferenciação nas células T car preparadas para transferência adotiva. Recentemente desenvolvemos uma abordagem para gerar células T CAR de qualidade superior usando um paradigma de cultura abreviado20. Usando nossa abordagem, mostramos que a cultura limitada dá origem a células T CAR com função efetiva superior e persistência após transferência adotiva em modelos de xenoenxerto de leucemia. Aqui, apresentamos as abordagens para gerar de forma confiável as células CART19 (células T autólogas projetadas para expressar scFv anti-CD19 anexadas ao CD3 e os domínios de sinalização 4-1BB) e incluímos uma descrição detalhada dos ensaios que fornecem informações sobre a bioatividade e eficácia do CAR T antes da transferência adotada.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

A imunoterapia adotiva é promissora para o tratamento do câncer e das doenças infecciosas. Descrevemos uma abordagem simples para transduzir as células T humanas primárias com receptor de antígeno quimérico (CAR) e expandir sua progênie ex vivo. Incluímos ensaios para medir a expressão do CAR, bem como diferenciação, capacidade proliferativa e atividade citolítica. Descrevemos ensaios para medir a produção de citocina efetoee e secreção inflamatória de citocina em células T CAR. Nossa abordagem fornece um método confiável e abrangente para a cultura das células T CAR para modelos pré-clínicos de imunoterapia adotiva.

Usando os métodos descritos acima, estimulamos e expandimos as células T por 3 ou 9 dias(Figura 1A,B). Também analisamos seu perfil de diferenciação, como indicado pela estratégia de gating delineada na Figura1C,medindo a abundância de glicoproteínas distintas expressas na superfície celular. Mostramos uma mudança progressiva para a diferenciação efetíbula ao longo do tempo durante a cultura ex vivo (<strong class="...

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Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Descrevemos uma abordagem para gerar de forma confiável células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e testar sua diferenciação e função in vitro e in vivo.

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating um produto CAR T Cell com competência funcional que engrafe, prolifera e tem atividade cit-el-úrica após a infusão é um componente-chave de uma imunoterapia adotiva eficaz. Por exemplo, em tumores sólidos, as células CAR T podem penetrar tumores sólidos e recebem estimulação ideal de antígeno;no entanto, seu enxerto geral e proliferação é impedido nas pessoas. O principal benefício dessa abordagem é que ela pode manter a qualidade das células CAR T ou o estado de diferenciação das células CAR T sem gerar células T terminais diferenciadas ou esgotadas, o que teria diminuído a capacidade proliferativa ou a má função efetiva após a infusão.Essa técnica pode ser difícil porque as células T são muito sensíveis à concentração celular ou à superfície dos vasos em que sua cultura se forma. Assim como suas necessidades metabólicas. Essencialmente, as células T precisam ser mantidas felizes durante todo o processo, caso contrário elas não crescerão.Para começar este procedimento, estabeleça pratos de cultura de 6 poços. Ative células T humanas primárias frescas ou crio-preservadas misturando-as com contas magnéticas anti-CD3 CD28, a uma proporção de três contas por célula T nos poços dos pratos da cultura. Cultura as células T em X-Vivo 15 médio suplementado com soro AB humano normal, L-glutamina, ele-xixi e IL2.Ative as células T a uma concentração de um milhão de células T por mililitro durante a expansão. E cultuá-los a 37 graus Celsius com 20% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Após a estimulação durante a noite, os supernacantes lentivirais às células T ativadas.Calcule o volume de supernacantes necessários para alcançar uma multiplicidade de infecção entre três e cinco. Continue a cultura das células usando as mesmas condições. No terceiro dia, recolham uma alíquota representativa das células de criopreservação.Antes da criopreservação, remova as contas magnéticas por tubulação suave e separação magnética. Prepare o meio de congelamento, que contém PBS com 0,5%DMSO. E armazená-lo a quatro graus Celsius até estar pronto para usar.Em seguida, centrifugar as células T a 300 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernatante e adicione cinco mililitros de PBS. Centrifugar as células novamente a 300 vezes G por cinco minutos e descartar o PBS.Suspendemos o pellant em um mililitro de meio criopreservador frio. Congele as células T em um recipiente de congelamento refrigerado. E armazene a menos 80 graus Celsius por 48 horas.Depois disso, transfira as células congeladas para nitrogênio líquido. Lave o resto das células T uma vez em cinco mililitros de PBS para eliminar qualquer vetor residual. Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos.Em seguida, decante o PBS e suspenda novamente o pellant celular em meio de cultura celular T a uma concentração de 500.000 células por mililitro. Divida as células T em duas culturas projetadas 45 e 9. Conte as células T por citometria de fluxo usando contas de contagem e anticorpos monoclonais para CD4 humano e CD8.Bem como um corante de viabilidade. Realirem as culturas dia sim, dia não para mantê-las em uma concentração de 500.000 células por mililitro. No quinto dia, conte e crio-preserve o dia cinco culturas como descrito anteriormente.No sétimo dia, lave 500 mil células na PBS. E suspendê-los em 100 microliters de fluorescência ativado tampão de classificação celular. Em seguida, detecte a expressão da proteína da superfície do CAR por imuno-coloração com um anti-CAR 19 conjugado fluorescente por citometria de fluxo.No nono dia, conte e crio-preserve o dia nove culturas como descrito anteriormente. Neste estudo são medidas a função e a eficácia das células CAR T que são colhidas em intervalos variados ao longo da cultura X-Vivo. Usando os métodos descritos neste vídeo, as células T são estimuladas e expandidas por três ou nove dias.O perfil de diferenciação das células, conforme indicado pela estratégia de gating aqui mostrada, é analisado medindo a abundância de glicoproteínas distintas expressas na superfície celular. Uma mudança progressiva para a diferenciação de efeitos é vista ao longo do tempo durante a cultura X-Vivo. A função efetivadora e a capacidade proliferativa das células CAR T em resposta ao antígeno são então avaliadas.As células que são expandidas menos são funcionalmente superiores às extensivamente cultivadas ao longo de uma duração mais longa. Em um modelo de rato xenógrafo humano de ALL a potência das células CAR T colhidas em diferentes períodos de tempo é comparada. As células de nove dias mostram uma resposta anti-mormica dependente de dose com uma resposta completa no valor de uma alta dose de três milhões; e uma perda de eficácia para a baixa dose de 500.000.No entanto, no dia três células apresentaram controle persistente do tumor em doses altas e baixas. Esta resposta está associada à contagem absoluta de CAR-T 19 no sangue periférico de camundongos. No geral, esses resultados fornecem evidências de que as células CAR T colhidas anteriormente, superam as colhidas posteriormente.Após este procedimento, ensaios adicionais de função, como ensaio de cavalos-marinhos, podem ser realizados para medir suas propriedades metabólicas, como consumo de oxigênio ou capacidade de espia-lo. Várias rodadas de re-estimulação também podem ser realizadas para fornecer insights sobre sua diferenciação e persistência das células CAR T. Usando esse trabalho como base, nós e outros pesquisadores estamos envolvidos em estudos para abreviar ainda mais o processo cultural.Também pode ser estendido em abordagens centrais para outros antígenos de câncer. Cuidados sempre devem ser tomados quando você trabalha com lentivírus. Mas mesmo quando o lentivírus é projetado para ser replicado incompetente.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Um modelo de linfoma de célula B Syngeneic Mouse para avaliação pré-clínica de pilhas de T de carro CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Pesquisa do câncer

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Preparação do Exosomes de siRNA entrega para as células cancerosas

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Usando CRISPR/Cas9 para knock out GM-CSF em células CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Implantação ortotópica guiada por ultrassom do Adenocarcinoma Ductal Pancreático murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolando células mononucleares de sangue periféricos humanos e células T CD4+ de pacientes com síndrome de Sézary para perfil transcriômico

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Imagem dinâmica das células T do receptor de antígeno quimérico com [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Tomografia Computadorizada

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Avaliação das Toxicidades Associadas às Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Usando um Modelo de Xenoenxerto de Camundongo Derivado de Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...