Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte a través de fondos proporcionados por Novartis Pharmaceuticals a través de una alianza de investigación con la Universidad de Pensilvania (Michael C. Milone) así como el Premio Académico de la Fundación St. Baldrick (Saba Ghassemi).

Todos los estudios en animales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania.
1. Activación, transducción y expansión de células T
<ol><li>Active células T humanas primarias frescas o crioconservadas mezclando con cuentas magnéticas anti CD3/CD28 (por ejemplo, cuentas de dinadas) a una proporción de 3 perlas por célula T en platos de cultivo celular de 6 polos. Células T de cultivo en x-VIVO 15 medio suplementado con 5% de s...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

Aquí describimos enfoques para medir la función y eficacia de las células T CAR cosechadas a intervalos variables a lo largo del cultivo ex vivo. Nuestros métodos proporcionan una visión completa de los ensayos diseñados para evaluar la capacidad proliferativa, así como la función del efector in vitro. Describimos cómo medir la actividad de los linfocitos T después de la estimulación a través de la CAR y los modelos de xenoinjerto de detalle de la leucemia utilizando células T CAR cosechadas en el día 3 fre...

Los receptores de antígeno quimérico (CAR) proporcionan un enfoque prometedor para redirigir las células T contra antígenos tumorales distintos. Los CAR son receptores sintéticos que unen un objetivo de antígeno. Aunque su composición precisa es variable, los RCA generalmente contienen 3 dominios distintos. El dominio extracelular dirige la unión a un antígeno objetivo y normalmente se compone de un fragmento de anticuerpo de cadena única vinculado a la CAR a través de una bisagra extracelular. El segundo dominio, comúnmente derivado de la cadena CD3 del complejo del receptor de células T (TCR), promueve la activación de la célula T después de la participación de la CAR. Un tercer dominio coestimulante se incluye para mejorar la función de las células T, injerto, metabolismo, y la persistencia. El éxito de la terapia con células T CAR en diversas neoplasias malignas hematopoyéticas incluyendo leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC) y mieloma múltiple pone de relieve la promesa terapéutica de este enfoque1,2,3,4,5,6. Las recientes aprobaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para dos terapias de células T CAR específicas de CD19, tisagenlecleucel para ADULTOs pediátricos y jóvenes adultos ALL y axicabtagene ciloleucel para linfoma difuso de células B grandes, refuerza el mérito traslacional de la Terapia de células T CAR.
Los enfoques basados en T DE CAR implican el aislamiento de los glóbulos T de la sangre periférica, la activación, la modificación genética y la expansión ex vivo. La diferenciación es un parámetro importante que regula la eficacia de las células T de la CAR. En consecuencia, la restricción de la diferenciación de células T durante el cultivo ex vivo mejora la capacidad del producto infundido para injertar, expandir y persistir, proporcionando inmunovigilancia a largo plazo después de la transferencia adoptiva2,7,8,9. Las células T consisten en varios subconjuntos distintos, incluyendo: células T ingenuas (Tn), memoria central (Tcm), memoria del efector (Tem), efector diferenciado (Tte) y memoria de células madre (Tscm). Los células T diferenciadas por efector tienen una potente capacidad citolítica; sin embargo, son de corta duración y injertan mal10,11,12. Por el contrario, las células T con un fenotipo menos diferenciado, incluidas las células T ingenuas y Tcm, presentan capacidades superiores de injerto y proliferación tras la transferencia celular adoptiva13,14,15,16,17,18. La composición de las células T recogidas en el producto prefabricado puede variar entre los pacientes y se correlaciona con el potencial terapéutico de las células T CAR. La proporción de células T con un inmunofenotipo de forma ingenua en el producto de aféresis inicial está altamente correlacionada con el injerto y la respuesta clínica19.
La duración del cultivo es un parámetro importante que influye en la diferenciación en las células T CAR preparadas para la transferencia adoptiva. Recientemente desarrollamos un enfoque para generar células T CAR de calidad superior utilizando un paradigma de cultivo abreviado20. Utilizando nuestro enfoque, mostramos que el cultivo limitado da lugar a células T CAR con función efectora superior y persistencia después de la transferencia adoptiva en modelos de xenoinjerto de leucemia. Aquí, presentamos los enfoques para generar confiablemente células CART19 (células T autólogas diseñadas para expresar scFv anti-CD19 conectados a CD3 y los dominios de señalización 4-1BB) e incluir una descripción detallada de los ensayos que proporcionan información sobre la bioactividad y eficacia de CAR T antes de la transferencia adoptiva.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

La inmunoterapia adoptiva es prometedora para el tratamiento del cáncer y las enfermedades infecciosas. Describimos un enfoque simple para transducir células T humanas primarias con receptor de antígeno quimérico (CAR) y expandir su progenie ex vivo. Incluimos ensayos para medir la expresión CAR, así como la diferenciación, la capacidad proliferativa y la actividad citolítica. Describimos ensayos para medir la producción de citoquinas efector y la secreción inflamatoria de citoquinas en células CAR T. Nuestro enfoque proporciona un método fiable y completo para el cultivo de células T CAR para modelos preclínicos de inmunoterapia adoptiva.

Usando los métodos descritos anteriormente, estimulamos y expandimos las células T durante 3 o 9 días(Figura 1A,B). También analizamos su perfil de diferenciación, como lo indica la estrategia de medición esbozada en la Figura 1C,midiendo la abundancia de glicoproteínas distintas expresadas en la superficie celular. Mostramos un cambio progresivo hacia la diferenciación del efector a lo largo del tiempo durante el cultiv...

Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Describimos un enfoque para generar de forma fiable células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) y probar su diferenciación y función in vitro e in vivo.

Fabricación de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para inmunoterapia adoptiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating un producto CAR T Cell con competencia funcional que ingrafota, prolifera y tiene actividad cit-el-uric después de la perfusión es un componente clave de una inmunoterapia adoptiva eficaz. Por ejemplo, en tumores sólidos, células T CAR pueden penetrar tumores sólidos y reciben una estimulación óptima del antígeno;sin embargo, su injerto general y la proliferación se ve obstaculizada en las personas. El principal beneficio de este enfoque es que puede conservar la calidad de las células T CAR o el estado de diferenciación de las células T DEL CAR sin generar células T diferenciadas o agotadas terminalmente, que habrían disminuido la capacidad proliferativa o una función efectiva deficiente después de la perfusión.Esta técnica puede ser difícil porque las células T son muy sensibles a su concentración celular o a la superficie de los vasos en los que se cultivan. Así como sus necesidades metabólicas. Esencialmente las células T necesitan ser mantenidas felices durante todo el proceso, de lo contrario no crecerán.Para comenzar este procedimiento, establecer platos de cultura de 6 pozos. Activar células T humanas primarias frescas o crio-preservadas mezclándolas con cuentas magnéticas anti-CD3 CD28, a una proporción de tres cuentas por célula T en los pozos de los platos de cultivo. Cultivo de las células T en X-Vivo 15 medio complementado con suero HUMANO normal AB, L-glutamina, he-pees e IL2.Activar las células T a una concentración de un millón de células T por mililitro durante la expansión. Y cultivarlos a 37 grados Celsius con 20%oxígeno, 5% dióxido de carbono y 95% de humedad. Después de la estimulación durante la noche, añadir sobrenadantes lentivirales a las células T activadas.Calcular el volumen de sobrenadantes necesarios para lograr una multiplicidad de infección entre tres y cinco. Continúe cultivando las células usando las mismas condiciones. En el tercer día, recoger una alícuota representativa de las células de la crio-preservación.Antes de la criopreservación, retire las perlas magnéticas pipeteando suavemente y la separación magnética. Prepare el medio de congelación, que contiene PBS con 0,5%DMSO. Y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para usar.A continuación, centrifugar las células T a 300 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue cinco mililitros de PBS. Centrifugar las células de nuevo a 300 veces G durante cinco minutos y desechar el PBS.Suspendimos el pellant en un mililitro de medio crio-preservación en frío. Congele las células T en un recipiente de congelación refrigerado. Y almacenar a menos 80 grados Celsius durante 48 horas.Después de esto, transfiera las células congeladas al nitrógeno líquido. Lavar el resto de las células T una vez en cinco mililitros de PBS para eliminar cualquier vector residual. Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos.Luego, decantar el PBS y volver a suspender el pellant celular en el medio de cultivo de células T a una concentración de 500.000 células por mililitro. Divida las células T en dos cultivos diseñados 45 y nueve. Cuente las células T por citometría de flujo utilizando cuentas y anticuerpos monoclonales para CD4 y CD8 humanos.Así como un tinte de viabilidad. Realimentar los cultivos cada dos días para mantenerlos a una concentración de 500.000 células por mililitro. En el quinto día, cuente y crio-preservar el día cinco culturas como se describió anteriormente.El día siete, lave 500.000 células en PBS. Y re-suspenderlos en 100 microlitros de fluorescencia activado buffer de clasificación de células. A continuación, detecte la expresión de la proteína superficial CAR mediante inmunomanteración con un anti-CAR 19 conjugado fluorescente por citometría de flujo.En el día nueve cuenta y crio-preservar el día nueve culturas como se describió anteriormente. En este estudio se mide la función y eficacia de las células T CAR que se cosechan a intervalos variables a lo largo del cultivo de X-Vivo. Usando los métodos descritos en este video, las células T se estimulan y expanden durante tres o nueve días.El perfil de diferenciación de células como se indica en la estrategia de gating que se muestra aquí, se analiza midiendo la abundancia de glicoproteínas distintas expresadas en la superficie celular. Un cambio progresivo hacia la diferenciación del efector se observa con el tiempo durante la cultura X-Vivo. A continuación, se evalúa la función del efector y la capacidad proliferativa de las células T CAR en respuesta al antígeno.Las celdas que se expanden menos son funcionalmente superiores a las que se cultivan ampliamente durante una duración más larga. En un modelo de ratón de xenoinjerto humano de TODO se compara la potencia de las células T CAR cosechadas en diferentes períodos de tiempo. Las células de nueve días muestran una respuesta antihím de dosis dependiente con una respuesta completa que vale una dosis alta de tres millones;y una pérdida de eficacia para la dosis baja de 500.000.Sin embargo, las tres células del día mostraron un control persistente del tumor en dosis altas y bajas. Esta respuesta se asocia con el recuento absoluto de CAR-T 19 en la sangre periférica de ratones. En general, estos resultados proporcionan evidencia de que las células T del CAR cosechadas antes, superan a las cosechadas más tarde.Después de este procedimiento, se pueden realizar ensayos de función adicionales como el ensayo de caballitos de mar para medir sus propiedades metabólicas, como el consumo de oxígeno o la capacidad de spir-it-ed. También se pueden realizar varias rondas de reestimulación para proporcionar información sobre su diferenciación y persistencia de las células T del CAR. Usando este trabajo como fundación, nosotros y otros investigadores estamos involucrados en estudios para abreviar aún más el proceso de cultivo.También se puede extender en el diseño de enfoques básicos para otros antígenos cancerosos. Siempre hay que tener cuidado cuando trabaje con lentivirus. Pero incluso cuando el lentivirus está diseñado para ser incompetente para la replicación.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Un modelo con ratones Syngeneic células B linfoma de evaluación preclínica de las células de T automóvil CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un ensayo de la matanza de esferoide por las células de T automóvil

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Preparación de exosomas siRNA entrega a las células cancerosas

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

En Vitro Tumor celular Rechallenge de evaluación predictiva de antígeno quimérico del Receptor de la célula T función antitumoral

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Uso de CRISPR/Cas9 para noquear GM-CSF en células CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Uso de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la generación de células T específicas de antígenos tumorales

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultrasonido-Guiado Implantación Ortotópica de Adenocarcinoma Ductal Pancreático Murino

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana y células T CD4 + de pacientes con síndrome de Sézary para perfiles transcriptómicos

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Imágenes dinámicas de células T receptoras de antígeno quimérico con [18F]Tomografía por emisión de positrones tetrafluoroborato/Tomografía computarizada

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Evaluación de los efectos tóxicos asociados a las células T del receptor de antígeno quimérico mediante un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de pacientes con leucemia linfoblástica aguda

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...