Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis genom finansiering från Novartis Pharmaceuticals genom en forskningsallians med University of Pennsylvania (Michael C. Milone) samt St. Baldrick ' s Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Alla Djurstudier är godkända av den institutionella djuromsorg och användning kommitté vid University of Pennsylvania.
1. T cell aktivering, transduktion och expansion
<ol><li>Aktivera färska eller kryopreserverade primära mänskliga T-celler genom att blanda med anti CD3/CD28 magnetiska pärlor (t. ex., Dynabeads) vid ett förhållande av 3 pärlor per T cell i 6-well cellkultur rätter. Kultur T-celler i X-VIVO 15 medium kompletterat med 5% normal human AB serum, 2 mM L-glutamin, 20 ...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

Här beskriver vi metoder för att mäta funktion och effekt av bil T-celler som skördats med varierande intervall i ex vivo-kulturen. Våra metoder ger omfattande inblick i analyser som utformats för att bedöma proliferativ kapacitet samt effektor funktion in vitro. Vi beskriver hur man mäter bil T cell aktivitet efter stimulering genom bilen och detalj xenograft modeller av leukemi med hjälp av bil T-celler skördas på dag 3 vs dag 9 i deras logaritmisk expansionsfas.
Det finns inneboe...

Chimeric antigen receptorer (bilar) ger en lovande metod för att omdirigera T-celler mot olika tumörantigener. Bilar är syntetiska receptorer som binder ett antigen mål. Medan deras exakta sammansättning varierar, innehåller bilar i allmänhet 3 distinkta domäner. Den extracellulära domänen leder bindningen till ett målantigen och består vanligtvis av en enda kedja antikropps fragment kopplade till bilen via ett extracellulärt gångjärn. Den andra domänen, som vanligen härleds från CD3ζ-kedjan av T-cellreceptorn (TCR)-komplexet, främjar T-cellernas aktivering efter bil engagemang. En tredje Co-domän ingår för att förbättra T-cells funktion, engrafktion, metabolism, och uthållighet. Framgången för bil T-cellterapi i olika hematopoietiska maligniteter inklusive B-cell akut lymfatisk leukemi (alla), kronisk lymfatisk leukemi (KLL) och multipel myelom belyser det terapeutiska löftet om detta tillvägagångssätt1,2,3,4,5,6. Den senaste Food and Drug Administration (FDA) godkännanden för två CD19-specifika bil T cellterapier, tisagenlecleucel för pediatriska och unga vuxna alla och axicabtagene ciloleucel för diffusa stora B-cellslymfom, förstärker den translationella förtjänst av bil T cellterapi.
BIL T-baserade metoder innebär isolering av T-celler från perifert blod, aktivering, genetisk modifiering, och expansion ex vivo. Differentiering är en viktig parameter som reglerar BILENS T-cellseffekt. Följaktligen, begränsa T celldifferentiering under ex vivo kultur ökar förmågan hos den infunderade produkten att engraft, expandera, och kvarstår, ger långsiktig immunoövervakning efter adoptiv överföring2,7,8,9. T-celler består av flera distinkta undergrupper inklusive: naiva T-celler (TN), centralminne (TCM), effektor Memory (TEM), effektor differentierad (TTE) och stamcells minne (TSCM). Effector differentierade T-celler har potent cytolytisk förmåga; men de är kortlivade och att dåligt10,11,12. Däremot, t-celler med en mindre differentierad fenotyp inklusive naiva T-celler och TCM uppvisar överlägsen engrafering och proliferativa förmågor efter adoptiv cell överföring13,14,15,16,17,18. Sammansättningen av de insamlade T-cellerna i den färdigtillverkade produkten kan variera mellan olika patienter och korrelerar med den terapeutiska potentialen hos bil T-celler. Andelen T-celler med en naiv-liknande immunophenotyp i Start aferes produkten är starkt korrelerad med både inympelse och kliniskt svar19.
Kulturens varaktighet är en viktig parameter som påverkar differentieringen i bil T-celler som förberetts för adoptiv överföring. Vi har nyligen utvecklat en strategi för att generera överlägsen kvalitet bil T-celler med hjälp av en förkortad kultur paradigm20. Med hjälp av vår strategi visade vi att begränsad kultur ger upphov till bil T-celler med överlägsen effektor funktion och uthållighet efter adoptiv överföring i xenograft modeller av leukemi. Här presenterar vi metoder för att tillförlitligt generera CART19 celler (autolog T-celler konstruerade för att uttrycka anti-CD19 scFv bifogas CD3ζ och 4-1BB signalering domäner) och innehåller en detaljerad beskrivning av de analyser som ger insikt i bil T bioaktivitet och effekt före adoptiv överföring.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

Adoptiv immunterapi håller löfte för behandling av cancer och infektionssjukdomar. Vi beskriver ett enkelt sätt att transduce primära mänskliga T-celler med chimär antigen receptor (bil) och expandera sin avkomma ex vivo. Vi inkluderar analyser för att mäta bil uttryck samt differentiering, proliferativ kapacitet och cytolytisk aktivitet. Vi beskriver analyser för att mäta effektor cytokin produktion och inflammatorisk cytokin sekretion i bil T celler. Vår metod ger en tillförlitlig och heltäckande metod för att odla bil T-celler för prekliniska modeller av adoptiv immunterapi.

Med hjälp av de metoder som beskrivs ovan, stimulerade vi och expanderade T-celler för antingen 3 eller 9 dagar (figur 1A, B). Vi analyserade också deras differentiering profil, vilket framgår av den gating strategi som beskrivs i figur 1C, genom att mäta överflödet av distinkta glykoproteiner uttrycks på cellytan. Vi visar en progressiv förskjutning mot effektordifferentiering över tiden under ex vivo-kulturen (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Vi beskriver en metod för att på ett tillförlitligt sätt generera chimär antigen receptor (Car) T-celler och testa deras differentiering och funktion in vitro och in vivo.

Tillverkning chimeric antigen receptor (bil) T celler för adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating en CAR T Cell produkt med funktionell kompetens som engraft, föröka sig och har cit-el-uric aktivitet efter infusion är en viktig del av en effektiv adoptiv immunterapi. Till exempel, i solida tumörer, CAR T-celler de kan tränga fast tumörer och de får optimal antigen stimulering;dock, deras totala engraftment och spridning hindras hos människor. Den största fördelen med detta tillvägagångssätt är att den kan behålla kvaliteten på CAR T-cellerna eller differentieringstillståndet hos CAR T-cellerna utan att generera terminalt differentierade eller uttömda T-celler, vilket skulle ha minskat proliferativ kapacitet eller dålig effektiv funktion efter infusion.Denna teknik kan vara svårt eftersom T-celler är mycket känsliga för sin cellkoncentration eller ytan av kärlen som deras odlade i. Liksom deras metaboliska behov. I huvudsak T-celler måste hållas lycklig under hela processen, annars kommer de inte att växa.För att börja detta förfarande, anges 6-väl kultur rätter. Aktivera färska eller kryobevarande primära mänskliga T-celler genom att blanda dem med anti-CD3 CD28 magnetiska pärlor, vid ett förhållande av tre pärlor per T-cell i brunnarna i odlingsrätterna. Odla T-cellerna i X-Vivo 15 medium kompletterat med normalt humant AB-serum, L-glutamin, he-pees och IL2.Aktivera T-cellerna vid en koncentration av en miljon T-celler per milliliter under expansionen. Och odla dem på 37 grader Celsius med 20% syre, 5% koldioxid och 95% luftfuktighet. Efter natten stimulering, lägg lentiviral supernatanter till de aktiverade T-celler.Beräkna volymen av supernatanter som är nödvändiga för att uppnå en multiplicitet av infektion mellan tre och fem. Fortsätt att kultföra cellerna med samma förhållanden. På dag tre, samla en representativ alikvot av cellerna i cryo-bevarande.Innan kryobevarande, avlägsna de magnetiska pärlorna genom att försiktigt pipettera och magnetisk separation. Förbered frysmediet, som innehåller PBS med 0,5%DMSO. Och förvara den på fyra grader Celsius tills den är klar att använda.Därefter centrifugera T-cellerna vid 300 gånger G i fem minuter. Kassera supernatanten och tillsätt fem milliliter PBS. Centrifugera cellerna igen vid 300 gånger G i fem minuter och kassera PBS.Vi suspender pellanten i en milliliter kallt kryobevarande medium. Frys T-cellerna i en kyld frysbehållare. Och förvara på minus 80 grader Celsius i 48 timmar.Efter detta överför de frysta cellerna till flytande kväve. Tvätta resten av T-cellerna en gång i fem milliliter PBS för att eliminera eventuell kvarvarande vektor. Centrifugera vid 300 gånger G i fem minuter.Sedan, dekantera PBS och åter avbryta cell pellant i T cell odling medium vid en koncentration av 500, 000 celler per milliliter. Dela upp T-cellerna i två kulturer utformade 45 och nio. Räkna T-cellerna efter flödescytometri med hjälp av räknepärlor och monoklonala antikroppar mot human CD4 och CD8.Samt en livskraft färgämne. Refeed kulturerna varannan dag för att behålla dem vid en koncentration av 500, 000 celler per milliliter. På dag fem, räkna och cryo-bevara dagen fem kulturer som tidigare beskrivits.På dag sju, tvätta 500, 000 celler i PBS. Och åter avbryta dem i 100 mikroliter fluorescens aktiverad cell sortering buffert. Sedan, upptäcka CAR yta proteinuttryck genom immun-färgning med en fluorescently konjugerat anti-CAR 19 idio-typ av flöde cytometri.På dag nio räkna och cryo-bevara dagen nio kulturer som tidigare beskrivits. I denna studie mäts funktionen och effekten hos CAR T-celler som skördas med varierande intervall under hela X-Vivo-odling. Med hjälp av de metoder som beskrivs i denna video stimuleras T-celler och utökas i antingen tre eller nio dagar.Cellerna differentiering profil som anges av gating strategi som visas här, analyseras genom att mäta överflödet av distinkta glykoproteiner uttryckt på cellytan. En progressiv förskjutning mot effektordifferentiering ses över tiden under X-Vivo-kulturen. Effektorfunktionen och proliferativ kapacitet av CAR T-celler som svar på antigen bedöms sedan.Celler som expanderas mindre är funktionellt överlägsna de som i stor utsträckning odlas under en längre varaktighet. I en människa xenograft mus modellerar av ALL styrkan av CAR T-celler som skördas på olika tidsperioder, jämförs. De nio dagars cellerna visar ett dosberoende anti- lukemic svar med ett komplett svar värt en hög dos av tre miljoner;och en förlust av effekt för den låga dosen av 500, 000.Men visade dag tre celler långlivade tumör kontroll i både höga och låga doser. Detta svar är associerat med den absoluta räkningen av CAR-T 19 i det perifera blodet hos möss. Sammantaget ger dessa resultat bevis för att CAR T-celler skördas tidigare, överträffa de skördade senare.Efter detta förfarande, ytterligare funktionsanalyser såsom sjöhäst assay kan utföras för att mäta deras metaboliska egenskaper såsom syreförbrukning eller spir-it-ed kapacitet. Flera omgångar av re-stimulering kan också utföras för att ge insikt i deras differentiering och persistens av CAR T-celler. Med hjälp av detta arbete som grund är vi och andra forskare engagerade i studier för att förkorta kulturprocessen ytterligare.Det kan också förlängas i core metoder design för andra cancer antigener. Försiktighet måste alltid tas när du arbetar med lentivirus. Men även när lentiviruset är konstruerat för att vara replikering inkompetent.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngena mus B-cells lymfom modell för preklinisk utvärdering av CD19 CAR T-celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En sfäroid dödande analys av CAR T-celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Beredning av Exosomes för siRNA leverans till cancerceller

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro tumör Cell återinsättning för förutsägande utvärdering av chimära Antigen receptorn T Cell antitumöreffekt funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Använda CRISPR/Cas9 för att slå ut GM-CSF i CAR-T-celler

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller för generering av tumör antigen-specifika T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultraljud-guidad ortotopisk implantation av murin Pancreatic ductal adenocarcinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolering av humana mononukleära celler i perifert blod och CD4+ T-celler från patienter med Sézarys syndrom för transkriptomisk profilering

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamisk avbildning av chimeriska antigenreceptor T-celler med [18F]Tetrafluorborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Bedömning av chimär antigenreceptor T-cellassocierad toxicitet med hjälp av en akut lymfoblastisk leukemi patient-härledd xenograftmusmodell

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...