Name: manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Novartis Pharmaceuticals tarafından Pennsylvania Üniversitesi (Michael C. Milone) ve St. Baldrick Vakfı Bursu (Saba Ghassemi) ile bir araştırma ittifakı aracılığıyla sağlanan finansman la desteklenmiştir.

Tüm hayvan çalışmaları Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. T Hücre Aktivasyonu, Transdüksiyon ve Genleşme
<ol><li>6-iyi hücre kültürü yemeklerinde T hücresi başına 3 boncuk oranında anti CD3/CD28 manyetik boncuklar (örneğin, dinamitler) ile karıştırarak taze veya kriyokorunmuş birincil insan T hücrelerini etkinleştirin. X-VIVO 15 orta kültür T hücreleri% 5 normal insan AB serum, 2 mM L-glutamin, 2...

<ol>
	<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia.">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).</li><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels.">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li><li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease.">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy.">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+(CTLs).">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+effector+CD8++T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates.">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties.">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8++T+cells+in+immunodeficient+mice.">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8++effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer.">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).</li><li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo.">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity.">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15.">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li><li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies.">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).</li></ol>

Burada ex vivo kültürü boyunca çeşitli aralıklarla hasat edilen CAR T hücrelerinin işlevini ve etkinliğini ölçmek için yaklaşımları açıklıyoruz. Yöntemlerimiz, proliferatif kapasitenin yanı sıra efektör fonksiyonunu in vitro olarak değerlendirmek üzere tasarlanmış tahliller hakkında kapsamlı bir içgörü sağlar. Car ile stimülasyonu takiben CAR T hücre aktivitesinin nasıl ölçültüldüğü ve logaritmik genleşme fazının 3.
Ex vivo genleşme sırasında far...

Şimerik antijen reseptörleri (CAR) farklı tümör antijenlerine karşı T hücrelerini yönlendirmek için umut verici bir yaklaşım sağlar. CAR bir antijen hedef bağlamak sentetik reseptörleri vardır. Kesin kompozisyonları değişken olmakla birlikte, CAR'lar genellikle 3 farklı etki alanı içerir. Hücre dışı etki alanı bir hedef antijene bağlanır ve genellikle ekstrasellüler menteşe ile CAR'a bağlı tek bir zincirantikor parçasından oluşur. T hücre reseptörü (TCR) kompleksinin CD30 zincirinden elde edilen ikinci etki alanı, CAR etkileşiminden sonra T hücre aktivasyonunu teşvik eder. Üçüncü bir kostimulatör etki T hücre fonksiyonu geliştirmek için dahildir, engraftment, metabolizma, ve kalıcılık. B hücreli akut lenfoblastik lösemi (ALL), kronik lenfositik lösemi (KLL) ve multipl miyelom dahil olmak üzere çeşitli hematopoetik malignitelerde CAR T hücre tedavisinin başarısı bu yaklaşımın terapötik sözünü vurgular1,2,3,4,5,6. Son Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) iki CD19-spesifik CAR T hücre tedavileri için onaylar, pediatrik ve genç erişkin ALL ve diffüz büyük B hücreli lenfoma için aksicabtagene ciloleucel için tisagenlecleucel, CAR T hücre tedavisinin çevirili liyakatini güçlendirir.
CAR T tabanlı yaklaşımlar periferik kan, aktivasyon, genetik modifikasyon ve genişleme ex vivo T hücrelerinin izolasyon içerir. Farklılaşma CAR T hücre etkinliğini düzenleyen önemli bir parametredir. Buna göre, ex vivo kültür sırasında T hücre farklılaşmasını kısıtlayan engraft için aşılanmış ürünün yeteneğini artırır, genişletmek, ve devam, evlat edinme transferi aşağıdaki uzun vadeli immüngözetim sağlayan2,7,8,9. T hücreleri şunlardır: naif T hücreleri (Tn), merkezi bellek (Tcm), efektör bellek (Tem), efektör diferansiye (Tte) ve kök hücre belleği (Tscm). Efektör diferansiye T hücreleri güçlü sitolitik yeteneğe sahiptir; ancak, kısa ömürlü ve engraft kötü10,11,12. Buna karşılık, naif T hücreleri ve Tcm dahil olmak üzere daha az diferansiye fenotip ile T hücreleri üstün engraftment ve proliferatif yetenekleri adoptive hücre transferi aşağıdaki sergiler13,14,15,16,17,18. Önceden üretilen üründe toplanan T hücrelerinin bileşimi hastalar arasında değişebilir ve CAR T hücrelerinin terapötik potansiyeli ile ilişkilidir. Başlangıç aferez ürününde naif benzeri immünhefenotip olan T hücrelerinin oranı hem engreftment hem de klinik yanıt ile son derece ilişkilidir19.
Kültür süresi, evlat edinme transferi için hazırlanan CAR T hücrelerinde farklılaşmayı etkileyen önemli bir parametredir. Biz son zamanlarda kısaltılmış bir kültür paradigması20kullanarak üstün kaliteli CAR T hücreleri oluşturmak için bir yaklaşım geliştirdi. Yaklaşımımızı kullanarak, sınırlı kültürün löseminin ksenogreft modellerinde evlat edinici transferi sonrasında üstün efektör işlevi ve kalıcılığı olan CAR T hücrelerine yol açtığını gösterdik. Burada, CART19 hücrelerini (CD3ţ ve 4-1BB sinyal etki alanlarındaki anti-CD19 scFv'yi ifade etmek üzere tasarlanmış otolog T hücreleri) güvenilir bir şekilde üretmek için yaklaşımları savuruyoruz ve evlat edinmeden önce CAR T biyoaktivite ve etkinliği hakkında bilgi sağlayan tahlillerin ayrıntılı bir açıklamasını da ekleyebiliyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555369</td>
			<td>RRID:AB_398595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560179</td>
			<td>RRID:AB_1645481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317444</td>
			<td>RRID:AB_2561866</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>RRID:AB_2561911</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Life Technolohgies</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads,</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561271</td>
			<td>RRID:AB_10561679</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555346</td>
			<td>RRID:AB_395751</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS, premium grade</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>28030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multisizer Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na251CrO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ030S001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325616</td>
			<td>RRID:AB_830689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45RO Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555493</td>
			<td>RRID:AB_395884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305610</td>
			<td>RRID:AB_493652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A54823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10373-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via-Probe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacturing chimeric antigen receptor (car) t cells for adoptive immunotherapy

Benimseyen immünoterapi kanser ve bulaşıcı hastalıkların tedavisi için umut vaat ediyor. Biz şimerik antijen reseptörü ile birincil insan T hücreleri transduce basit bir yaklaşım tarif (CAR) ve onların singen ynuzlu ex vivo genişletmek. Car ekspresyonunun yanı sıra farklılaşma, proliferatif kapasite ve sitoklitik aktiviteyi ölçmek için tahliller de dahilyiz. CAR T hücrelerinde efektör sitokin üretimini ve inflamatuar sitokin salgısını ölçmek için tahlilleri tanımlıyoruz. Yaklaşımımız, evlat edinen immünoterapinin preklinik modelleri için CAR T hücrelerine güvenilir ve kapsamlı bir yöntem sunmaktadır.

Yukarıda açıklanan yöntemleri kullanarak, T hücrelerini 3 veya 9 gün boyunca uyardık ve genişlettik(Şekil 1A,B). Ayrıca, şekil 1C'deözetlenen gating stratejisinde belirtildiği gibi, hücre yüzeyinde ifade edilen farklı glikoproteinlerin bolluğunu ölçerek farklılaşma profillerini de analiz ettik. Ex vivo kültür sırasında zaman içinde efektör farklılaşmaya doğru ilerleyici bir kayma gösteririz (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy at JoVE.com

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Biz güvenilir şemerik antijen reseptörü oluşturmak için bir yaklaşım tarif (CAR) T hücreleri ve in vitro ve in vivo onların farklılaşma ve fonksiyon test.

İmal İmmünoterapi için İmkanerik Antijen Reseptör (CAR) T Hücreleri

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-engraft fonksiyonel yetkinlik ile bir CAR T Hücre ürün ating, çoğalır ve infüzyon sonrası sit-el-ürik aktiviteye sahip etkili bir benimseyen immünoterapi önemli bir bileşenidir. Örneğin, katı tümörlerde, CAR T hücreleri katı tümörlere nüfuz edebilir ve optimal antijen stimülasyonları alırlar;ancak, genel engraftment ve proliferasyon insanlarda engellenir. Bu yaklaşımın en önemli yararı, car T hücrelerinin kalitesini veya CAR T hücrelerinin farklılaşma durumunu ölümcül olarak farklılaşmış veya tükenmiş T hücreleri üretmeden koruyabilmesidir, bu da infüzyon sonrasında proliferatif kapasiteyi veya zayıf etkili işlevi azaltmış olacaktır.T hücreleri hücre konsantrasyonuna veya kültürlendikleri damarların yüzey alanına çok duyarlı olduğu için bu teknik zor olabilir. Metabolik ihtiyaçları kadar. Esasen T hücreleri süreç boyunca mutlu tutulması gerekir, aksi takdirde büyümek olmaz.Bu prosedüre başlamak için, 6-iyi kültür yemekleri yola. Kültür yemeklerinin kuyularında T hücresi başına üç boncuk oranında, anti-CD3 CD28 manyetik boncuklar ile karıştırarak taze veya kriyo korunmuş birincil insan T hücreleri etkinleştirin. Kültür X-Vivo 15 orta normal insan AB serum, L-glutamin, he-pees ve IL2 ile birlikte T hücreleri.Genişleme sırasında mililitre başına bir milyon T hücre konsantrasyonu t hücreleri etkinleştirin. Ve onları %20 oksijen, %5 karbondioksit ve %95 nem oranıyla 37 derecede kültürleyin. Gece stimülasyon sonra, aktif T hücrelerine lentiviral supernatants ekleyin.Üç ile beş arasında çok sayıda enfeksiyon elde etmek için gerekli supernatants hacmini hesaplayın. Aynı koşulları kullanarak hücreleri culturing devam edin. Üçüncü gün, kriyo-koruma hücrelerinin temsili bir aliquot toplamak.Kriyo-koruma dan önce, manyetik boncukları yavaşça pipetleme ve manyetik ayırma ile çıkarın. %0,5 DMSO ile PBS içeren dondurma ortamını hazırlayın. Ve kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın.Daha sonra, T hücrelerini 5 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin. Supernatant atın ve PBS beş mililitre ekleyin. Hücreleri tekrar 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve PBS'yi atın.Pellantı bir mililitre soğuk kriyo koruma aracıyla askıya alıyoruz. Soğutulmuş bir dondurucu kapta T hücrelerini dondurun. Ve eksi 80 derecede 48 saat saklayın.Bundan sonra, sıvı nitrojen dondurulmuş hücreleri aktarın. Kalan vektörü ortadan kaldırmak için t hücrelerinin geri kalanını beş mililitre PBS'de bir kez yıkayın. 5 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj.Daha sonra, PBS decant ve mililitre başına 500, 000 hücre konsantrasyonu t hücre kültürü orta hücre pellant yeniden askıya. T hücrelerini 45 ve 9'da tasarlanmış iki kültüre ayırın. İnsan CD4 ve CD8 sayma boncukları ve monoklonal antikorları kullanarak t hücrelerini akış sitometrisi ile sayın.Canlılık boyası gibi. Kültürleri her gün besleyin ve mililitrede 500,000 hücrenin konsantrasyonunda koruyun. Beşinci günde, daha önce açıklandığı gibi beş kültürün gününü sayve kısık bir şekilde koru.Yedinci günde, PBS'de 500.000 hücreyı yıkayın. Ve onları 100 mikrolitre floresan aktif hücre sıralama tamponuyla tekrar askıya alıyor. Daha sonra, akış sitometrisi tarafından floresan caiz anti-CAR 19 idio tipi ile immüno boyama ile CAR yüzey protein ekspresyonunu saplayın.Dokuzuncu günde, daha önce açıklandığı gibi dokuzuncu günü saymak ve kriyo-korumak. Bu çalışmada X-Vivo kültürü boyunca çeşitli aralıklarla hasat edilen CAR T hücrelerinin işlevi ve etkinliği ölçüldü. Bu videoda açıklanan yöntemler kullanılarak, T hücreleri uyarılır ve üç veya dokuz gün boyunca genişletilir.Burada gösterilen gating stratejisinde belirtildiği gibi hücre farklılaşma profili, hücre yüzeyinde ifade edilen farklı glikoproteinlerin bolluğu ölçülerek analiz edilir. X-Vivo kültürü sırasında zaman içinde efektör farklılaşmaya doğru ilerleyici bir kayma görülür. Daha sonra antijene yanıt olarak CAR T hücrelerinin efektör fonksiyonu ve proliferatif kapasitesi değerlendirilir.Daha az genişlemiş hücreler işlevsel olarak daha uzun bir süre boyunca yaygın olarak kültürlenmiş hücrelerden daha üstündür. Farklı zaman dilimlerinde hasat edilen CAR T hücrelerinin tüm gücü bir insan ksenogreft fare modelinde karşılaştırılır. Dokuz günlük hücreler, doza bağımlı anti-lukemik yanıtı, üç milyon luk yüksek dozdeğerinde tam bir yanıt ve 500,000'lik düşük doziçin etkinlik kaybı gösterir.Ancak, gün üç hücre hem yüksek hem de düşük dozlarda kalıcı tümör kontrolü gösterdi. Bu yanıt farelerin periferik kan CAR-T 19 mutlak sayısı ile ilişkilidir. Genel olarak, bu sonuçlar CAR T hücrelerinin daha önce hasat, daha sonra hasat daha iyi performans kanıt sağlar.Bu prosedürü takiben, oksijen tüketimi veya spir-it-ed kapasitesi gibi metabolik özelliklerini ölçmek için denizatı tahlil gibi ek fonksiyon denemeleri yapılabilir. CAR T hücrelerinin farklılaşması ve kalıcılığı hakkında bilgi sağlamak için birkaç tur yeniden stimülasyon da yapılabilir. Bu çalışmayı bir temel olarak kullanarak biz ve diğer araştırmacılar kültür sürecini daha da kısaltmak için çalışmalar yapıyoruz.Aynı zamanda diğer kanser antijenleri için çekirdek yaklaşımlar tasarım uzatılabilir. Eğer lentivirus ile çalışırken bakım her zaman alınması gerekir. Ama lentivirus çoğaltma yetersiz olacak şekilde tasarlanmış olsa bile.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngeneic fare B hücreli lenfoma manken CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik değerlendirme için

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

CAR-T hücrelerinde GM-CSF ' ı Knock Out için CRISPR/Cas9 kullanma

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Murine Pankreatik Duktal Adenokarsinomun Ultrason Eşliğinde Ortotopik İmplantasyonu

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Transkriptomik Profilleme için İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin ve CD4 + T hücrelerinin Sézary Sendromu Hastalarından İzole Edilmesi

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Akut Lenfoblastik Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modeli Kullanılarak Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi İlişkili Toksisitelerin Değerlendirilmesi

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...