Name: the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice at JoVE.com

وقد تم دعم XL جزئيا من قبل البرنامج الوطني لالبحث والتطوير مفتاح الصين (2017YFE0196600)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 31771395، 31571518). تم دعم Q.S. من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFC1001703) وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي لمقاطعة تشجيانغ (2017C03009). تم دعم W.X. من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (LY18H020002) وقسم التكنولوجيا العلمية في مقاطعة تشجيانغ (2017C37057).

وقد وافقت لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة تشجيانغ على جميع الإجراءات الحيوانية.
1. ثقافة الخلايا الجذعية العصبية الكبار والخلايا العصبية
<ol><li>عزل الخلايا الجذعية العصبية الكبار من الدماغ الأمامي للبالغين (8-10 أسبوع من العمر) C57/BL6 الماوس الذكور كما هو موضح سابقا31</sup...

<ol>
	<li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease.">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li><li>Yao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurogenesis.">Epigenetic mechanisms in neurogenesis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).</li><li>Day, J. J., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+memory+formation.">DNA methylation and memory formation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).</li><li>Wu, X. J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET-mediated+active+DNA+demethylation:+mechanism,+function+and+beyond.">TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).</li><li>Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine-Mediated+DNA+Demethylation+in+Stem+Cells+and+Development.">5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development.</a> Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).</li><li>Li, S., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+regulatory+landscape+of+RNA+modifications.">The pivotal regulatory landscape of RNA modifications.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).</li><li>Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+field+of+epigenetics+in+neurodegeneration+and+neuroprotection.">The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-Methylcytosine+to+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mammalian+DNA+by+MLL+Partner+TET1.">Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+modifies+the+DNA+methylation+landscape+in+the+adult+brain.">Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt1+and+Dnmt3a+maintain+DNA+methylation+and+regulate+synaptic+function+in+adult+forebrain+neurons.">Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Geneticset. , 245-254 (2003).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Shu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+alteration+of+5-hydroxymenthylcytosine+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> BMC Genomics. 17, (2016).</li><li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs.">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li><li>Bernstein, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylation-associated+epigenetic+modifiers+of+Alzheimer's+disease+modulate+Tau-induced+neurotoxicity.">5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).</li><li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease.">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair.">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li><li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+DNA+methylation:+mechanisms,+genomics,+and+biological+functions.">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905 (2013).</li><li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos.">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194 (2011).</li><li>Pastor, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+hydroxymethylation+changes+are+associated+with+neurodevelopmental+genes+in+the+developing+human+cerebellum.">Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum.</a> Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency.">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, 15903 (2017).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation.">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).</li><li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem/progenitor+cells.">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

تلعب التعديلات الجينيّة أدوارًا أساسية أثناء نمو الدماغ والنضج والوظيفة. كعلامة مستقرة لتعديل الحمض النووي, دينامية 5-hmC يستجيب للتكيف السلوكي, النشاط العصبي, ويرتبط بشكل إيجابي مع التعبير الجيني; وبالتالي، فإنه يشارك في الوظيفة الطبيعية للدماغ والاضطراب العصبي4. لاستكشاف وظ...

وقد ثبت التعديلات الجيني، بما في ذلك تعديل الحمض النووي، وتعديل الهيستون وتعديل الحمض النووي الريبي، للعب وظائف أساسية في العمليات البيولوجية المتنوعة والأمراض1،2،3، 4 , 5 , 6 , 7- ولفترة طويلة، اعتُبر مثيلة الحمض النووي (أي 5-ميثيلسيتوسين (5-م.م)) علامة جينية مستقرة للغاية ولا يمكن تعديلها مرة أخرى في الجينوم. في الآونة الأخيرة، تم العثور على أن 5-mC يمكن أكسدة إلى 5-هيدروكسي ميثيلسيتوسين (5-hmC) من قبل TET (10-11 translocations) البروتينات العائلية بما في ذلك TET1، TET2، وTET38،9. وتظهر دراسات أخرى أن 5-hmC يمكن أن تكون بمثابة علامة مستقرة ولعب الأدوار البيولوجية من خلال تنظيم التعبير الجيني4،10،11،12.
وتشير الأدلة الحالية إلى أن 5-hmC هو المخصب للغاية في الأنسجة العصبية / الخلايا بالنسبة لأنواع أخرى من الأنسجة في الثدييات، ويعرض الميزات الديناميكية خلال تطوير الخلايا العصبية13،14. في الجهاز العصبي، 5-hmC بوساطة التعديلات الجينية تلعب دورا هاما في تنظيم الخلايا الجذعية العصبية، والنشاط العصبي، والتعلم والذاكرة، وتشارك في اضطرابات عصبية متعددة بما في ذلك متلازمة ريت، التوحد، الزهايمر المرض، مرض هنتنغتون، الخ2،13،15،16،17،18،19،20.
هناك العديد من النهج للكشف عن 5-hmC في الخلايا والأنسجة14،21،22،23،24. هنا، ونحن نصف طريقتين للكشف عن وجود 5-hmC وكمية المستوى العالمي من 5-hmC: تلطيخ الفلورة المناعية والحمض النووي نقطة وصمة عار. هذه الطريقتين مريحة وحساسة، وقد استخدمت بنجاح في الدراسات السابقة25،26،27،28،29،30. الخطوات الرئيسية لهذين الأسلوبين هي إزالة الحمض النووي. لتلطيخ مناعة 5-hmC، مطلوب المعالجة المسبقة للعينات مع 1 M حمض الهيدروكلوريك. ل5-hmC نقطة وصمة عار، يتم تنفيذ denaturation الحمض النووي مع حل هيدروكسيد الصوديوم. هذه الطريقتين جنبا إلى جنب مع تسلسل الجيل القادم هي أدوات مفيدة جداً للتحقيق في وظيفة 5-hmC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop software</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-5-hydroxymethylcytosine</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12580-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>OmegaScientific</td>
			<td>DM25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Z0325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon membrane (Hybond&#8482;-N+ )</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>RPN303B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020108926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0899-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>VVR</td>
			<td>39450-01-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8210</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice

وقد تم تحديد تعديلات الحمض النووي متعددة في الجينوم الثدييات. ومن هذا السبب، تمت دراسة الآليات الجينية بوساطة 5-ميثيل سيتوسين و5-هيدروكسي ميثيل السيتوسين بوساطة مكثفة. 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين يعرض السمات الديناميكية أثناء النمو الجنيني وبعد الولادة في الدماغ، ويلعب وظيفة تنظيمية في التعبير الجيني، ويشارك في اضطرابات عصبية متعددة. هنا، ونحن نصف الطرق التفصيلية بما في ذلك تلطيخ الفلورة المناعية والحمض النووي نقطة وصمة عار للكشف عن 5-هيدروكسي ميثيلسيتوسين في الخلايا المستزرعة وأنسجة الدماغ من الماوس.

للكشف عن توزيع 5-hmC في الحصين من الفئران البالغة، قمنا بإجراء الفلورة المناعية مع الأجسام المضادة ضد الخلايا العصبية (NeuN) و 5-hmC. في الحصين، 5-hmC شارك في ترجمة جيدا مع علامة الخلايا العصبية NeuN(الشكل 1A-H)،مما يشير إلى إثراء 5-hmC في الخلايا العصبية.
لتحديد دي...

Watch this Scientific Journal Video about The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice at JoVE.com

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا وأنسجة الدماغ، وذلك باستخدام تلطيخ الفلورة المناعية وطرق الحمض النووي نقطة لطخة.

الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن 5-هيدروكسي ميثيسيلتوسين في الخلايا وأنسجة الدماغ باستخدام immunofluorescence، والطريقة الجديدة، ولطخة نقطة الحمض النووي. 5-hydroxymethylcytosin، أي 5hmC، تعديل اللاجينية المخفف، يلعب وظيفة هامة في تنظيم التعبير الجيني والمشاركة في اضطرابات عصبية متعددة.في الواقع، يمكن استخدام أساليبنا للكشف عن 5hmC في خلايا متعددة والأنسجة. انها مريحة ويمكن تنفيذها مع المعدات المشتركة في المختبر. تبدأ عن طريق وضع وجه الماوس حتى على لوحة من البلاستيك وتحديد كل طرف مع شريط لزجة.استخدم مقص جراحيًا لقطع الجلد والعضلات، وفتح تجويف الصدر. كشف القلب وقطع جزء صغير من الأذين الأيمن مع مقص الجراحية غرامة. باستخدام 10 ملليلتر المتاح، معقمة حقنة، ضخ الماوس من البطين الأيسر مع برنامج تلفزيوني الباردة.ثم، perfuse الماوس مع 4٪ PFA حتى أنها قاسية. ثم افتح الجمجمة بملباب العظام وأزل الدماغ. ضع الدماغ في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر مملوء بخمسة ملليلترات من 4٪ PFA واخزنه عند أربع درجات مئوية.بعد 24 ساعة، نقل الدماغ إلى محلول السكروز 30٪، وتركها في أربع درجات مئوية للجفاف الكامل. قبل القطاعات، تم تجميع الدماغ في مجمع درجة حرارة القطع الأمثل وبارد إلى ناقص 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. عينات الدماغ المقطع بسمك 20 إلى 40 ميكرومتر باستخدام ميكروتوماتية cryostat.جمع أقسام في برنامج تلفزيوني وتخزينها في أربع درجات مئوية. التقاط أقسام الدماغ من الفائدة ووضعها في لوحة 24-جيدا مع برنامج تلفزيوني. غسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني على شاكر لمدة 10 دقائق.إزالة برنامج تلفزيوني وعلاج مع مسخن حمض الهيدروكلوريك واحد المولر في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حمض الهيدروكلوريك هو تآكل ويرجى إعداده في عقد الكيميائية. ثم، غسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق ومنعها مع برنامج تلفزيوني يحتوي على مصل الماعز العادي 3٪و 0.1٪ تريتون X-100.اترك العينات على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. إضافة أجسام مضادة أولية محددة إلى الأقسام واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية على شاكر. في اليوم التالي، أخذ العينات وتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.غسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة الأجسام المضادة الثانوية. غطي الطبق بالألمنيوم واتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة أثناء الاهتزاز. بعد الحضانة، وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وجبل لهم على الشرائح.إضافة 100 إلى 150 ميكرولتر من مضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة، وتغطية مع غطاء قسط الزجاج، وختم مع طلاء الأظافر. صور أقسام الدماغ مع مجهر منتظم أو confocal. لعزل الحمض النووي الجينومي، ابدأ بتشريح قرن آمون والقشرة وأنسجة المخيخ على طبق مبرد بالجليد.إضافة ملليلتر واحد من الحمض النووي العازلة وطحن الأنسجة. نقل العينة إلى أنبوبrifuge صغيرة نظيفة وإضافة 250 ميكروغرام من البروتينات-K لكل 600 ميكرولترات من عازلة تحلل. ثم، إضافة حوالي 50 ميكروغرام من RNase A لكل عينة واحتضان لمدة 12 ساعة على الأقل في 37 درجة مئوية.بعد الحضانة، إضافة حجم متساو من الكحول ايساميل الكلوروفورم الفينول وخلطها جيدا. الطرد المركزي الخليط وفقا لاتجاهات المخطوطات ونقل نابيرنت إلى أنبوب جديد. أضف 600 ميكرولترات من الكلوروفورم إلى المُسَتَلَد، ويُخلط جيداً، والطرد المركزي وفقاً لاتجاهات المخطوطات.نقل سوبرناتانت إلى أنبوب جديد وإضافة 500 ميكرولترات من ايزوبروبانول. اخلطي جيداً وطاردة مركزية مرة أخرى للتعجيل بالحمض النووي. بعد الطرد المركزي، والتخلص من اهب، وغسل بيليه الحمض النووي مع 70٪ الإيثانول وفقا لاتجاهات المخطوطات.الهواء الجافة بيليه الحمض النووي تماما وبعد ذلك، حل في المخزن المؤقت تريس-HCl. قبل البدء، قم بإعداد الحلول المطلوبة وعينة الخليط وفقاً لتوجيهات المخطوطات. اِنسخ عينة الحمض النووي عن طريق تسخينها إلى 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم ضعها على الجليدقطع الحجم المناسب من غشاء النايلون وشطفه مع 6X SSC. ضع الغشاء على جهاز نقطة لطخة وربط مضخة فراغ. بقعة ست نقاط ميكروليتر على الغشاء وتهجين لمدة 30 دقيقة في 80 درجة مئوية.ثم، كتلة عينة الغشاء مع الحليب الخالي من الدهون والملوحة تريس المخزنة، أو TBS، لمدة ساعة واحدة. إضافة الأجسام المضادة الأرانب البولي كلينال المضادة 5-هيدروكسي ميثيليسيتوسين إلى الغشاء واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، ترك غشاء العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، ثم غسل الغشاء ثلاث مرات مع TBS.احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة المضادة للأرانب مضادة 30 دقيقة ومن ثم، وغسل ثلاث مرات مع TBS. تصور إشارات chemiluminescence وقياسا شدتها. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتصور 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين، أو 5hmc، في قرن آمون من الفئران الكبار.المناعي مع الأجسام المضادة ضد الخلايا العصبية, 5hmC يكشف أن هناك إثراء 5hmC في الخلايا العصبية. يمكن تحديد ديناميات 5hmC خلال التنمية العصبية مع اختبار نقطة لطخة من عينات الحمض النووي معزولة عن الخلايا الجذعية العصبية الكبار المتكاثرة والمتمايزة. مستويات عالمية من 5hmC زيادة كبيرة خلال التمايز ومستوى 5hmC في الخلايا العصبية أعلى مما كانت عليه في الخلايا الجذعية العصبية.الخطوة الرئيسية لهذه الطريقة هي التأكد من أن التككر الكامل لعينات الحمض النووي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

الحساسية العالية 5 - hydroxymethylcytosine كشفها في أنسجة المخ BALB / C

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

الجراحية زرع الخلايا الجذعية العصبية الماوس في النخاع الشوكي لفئران مصابة موجه للعصب الماوس فيروس التهاب الكبد

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

ماوس واحدة، واثنين من الثقافات: العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية العصبية من المناطق العصبية اثنان من الفئران الفردية

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

النمذجة الخلايا النجمية إمراض<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

تعداد الخلايا الجذعية العصبية باستخدام نسيلي فحوصات

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...