Name: the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice at JoVE.com

XL היה נתמך בחלק על ידי תוכנית הלאומית R & D של סין (2017YFE0196600), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט Nos. 31771395, 31571518). Q.S. היה נתמך על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (2017YFC1001703) ואת תוכנית מחקר ופיתוח מפתח של פרובינצית ג'ה-ג'יאנג (2017C03009). W.X. היה נתמך על ידי הקרן המדע הטבעי של מחוז ג'ה-ג'יאנג (LY18H020002) ואת טכנולוגיית המדע של מחוז ג'ה-ג'יאנג (2017C37057).

כל ההליכים בעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג.
1. התרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים ונוירונים
<ol><li>בידוד בתאי גזע עצביים מבוגרים מן המוח הקדמי של מבוגר (8-10 בן שבוע) C57/BL6 עכבר זכר כמתואר בעבר31,32.</li>
	<li>תרבות ת...

<ol>
	<li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease.">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li><li>Yao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurogenesis.">Epigenetic mechanisms in neurogenesis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).</li><li>Day, J. J., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+memory+formation.">DNA methylation and memory formation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).</li><li>Wu, X. J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET-mediated+active+DNA+demethylation:+mechanism,+function+and+beyond.">TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).</li><li>Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine-Mediated+DNA+Demethylation+in+Stem+Cells+and+Development.">5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development.</a> Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).</li><li>Li, S., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+regulatory+landscape+of+RNA+modifications.">The pivotal regulatory landscape of RNA modifications.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).</li><li>Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+field+of+epigenetics+in+neurodegeneration+and+neuroprotection.">The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-Methylcytosine+to+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mammalian+DNA+by+MLL+Partner+TET1.">Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+modifies+the+DNA+methylation+landscape+in+the+adult+brain.">Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt1+and+Dnmt3a+maintain+DNA+methylation+and+regulate+synaptic+function+in+adult+forebrain+neurons.">Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Geneticset. , 245-254 (2003).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Shu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+alteration+of+5-hydroxymenthylcytosine+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> BMC Genomics. 17, (2016).</li><li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs.">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li><li>Bernstein, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylation-associated+epigenetic+modifiers+of+Alzheimer's+disease+modulate+Tau-induced+neurotoxicity.">5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).</li><li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease.">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair.">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li><li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+DNA+methylation:+mechanisms,+genomics,+and+biological+functions.">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905 (2013).</li><li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos.">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194 (2011).</li><li>Pastor, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+hydroxymethylation+changes+are+associated+with+neurodevelopmental+genes+in+the+developing+human+cerebellum.">Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum.</a> Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency.">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, 15903 (2017).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation.">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).</li><li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem/progenitor+cells.">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

שינויים אפיגנטיים לשחק תפקידים חיוניים במהלך התפתחות המוח, התבגרות, ותפקוד. כסמן יציב עבור שינוי DNA, דינמי 5-hmC מגיב לעיבוד התנהגותי, פעילות עצבית, והוא מתואם באופן חיובי עם ביטוי גנים; לכן, הוא מעורב בתפקוד תקין של המוח והפרעה נוירולוגית4. כדי לחקור את תפקידה בתאים ורקמות, יש צור...

שינויים אפיגנטיים, כולל שינוי ה-DNA, שינוי היסטון ו-RNA שינוי, הוכחו לשחק פונקציות חיוניות בתהליכים ביולוגיים שונים ומחלות1,2,3, ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. במשך זמן רב, מתילציה DNA (כלומר, 5-מתיל ציטוסין (5-mC)) הוצג כסמן מאוד יציב אפיגנטי ולא ניתן לשנות עוד בגנום. לאחרונה, זה נמצא כי 5-mC יכול להיות תחמוצת ל 5-הידרוxyמתילציטוסין (5-hmc) על ידי ט (10-11 טרנסמקומות) משפחה חלבונים כולל TET1, TET2, ו TET38,9. מחקרים נוספים מראים כי 5-hmc יכול לשמש סמן יציב ולשחק תפקידים ביולוגיים באמצעות ויסות גן ביטוי4,10,11,12.
הראיות הקיימות מצביעות על כך 5-hmc הוא מועשר מאוד ברקמות הנוירואליות/תאים ביחס לסוגים אחרים של רקמות יונקים, ומציג תכונות דינמיות במהלך פיתוח עצבי13,14. במערכת עצביים, 5-hmC בתיווך אפיגנטי שינויים לשחק תפקיד חשוב בוויסות תאי גזע עצביים, פעילות עצבית, למידה וזיכרון, והוא מעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות כולל תסמונת רט, אוטיזם, אלצהיימר מחלה, מחלת הנטינגטון, וכו '2,13,15,16,17,18,19,20.
ישנן מספר גישות לגילוי 5-hmc בתאים ורקמות14,21,22,23,24. כאן, אנו מתארים שתי שיטות כדי לזהות את קיומו של 5-hmC ולכמת את הרמה הגלובלית של 5-hmC: מכתים החיסונית של כתמים ו-DNA נקודה-כתם. שתי שיטות אלה הן נוחות ורגישות, ובשימוש בהצלחה במחקרים קודמים25,26,27,28,29,30. השלבים העיקריים של שתי שיטות אלה הם denaturation DNA. עבור מכתים החיסונית של 5-hmC, טרום טיפול של דגימות עם HCl 1 M נדרש. עבור 5-hmC נקודה-כתם, דנ א הדנטורציה מבוצעת עם פתרון NaOH. שתי שיטות אלה יחד עם רצף הדור הבא הם כלים שימושיים מאוד לחקירת הפונקציה של 5-hmC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop software</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-5-hydroxymethylcytosine</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12580-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>OmegaScientific</td>
			<td>DM25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Z0325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon membrane (Hybond&#8482;-N+ )</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>RPN303B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020108926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0899-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>VVR</td>
			<td>39450-01-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8210</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice

שינויי דנ א מרובים זוהו בגנום היונקים. מתוך זה, 5-מתילציטוסין ו-5-הידרוגרד מתילציטוסין-בתיווך מנגנונים גנטיים נחקרו באופן אינטנסיבי. 5-hydroxyמתילציטוסינוס מציג תכונות דינמיות במהלך פיתוח המוח העובריים והפוסט-לידתיים, משחק תפקיד רגולטורי בביטוי הגנים, והוא מעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות. כאן, אנו מתארים את השיטות המפורטות כולל כתמים immunofluorescence ו-DNA נקודה-כתם כדי לזהות 5-hydroxyמתילציטוסין בתאים מתורבתים ורקמות המוח של העכבר.

כדי לחשוף את ההתפלגות של 5-hmC בהיפוקמפוס של עכברים למבוגרים, ביצעו immunofluorescence עם נוגדנים נגד תאים עצביים (NeuN) ו 5-hmC. בהיפוקמפוס, 5-hmC שיתוף מקומי היטב עם סמן תא עצבי NeuN (איור 1A-H), המציעה העשרה של 5-hmc ב נוירונים.
כדי לקבוע את הדינמיקה של 5-hmC במהלך התפתחות עצב?...

Watch this Scientific Journal Video about The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice at JoVE.com

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות 5-hydroxyמתילציטוסין בתאים ורקמות המוח, ניצול immunofluorescence כתמים ושיטות כתמי נקודה DNA.

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגילוי 5-hydroxymethylcytosin בתאים ורקמות המוח באמצעות immunofluorescence, השיטה החדשה, ואת כתם נקודה DNA. 5-hydroxymethylcytosin, כלומר 5hmC, שינוי אפיגנטי מקל, ממלא תפקיד חשוב בוויסות ביטוי גנים ומעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות.למעשה, השיטות שלנו ניתן להשתמש כדי לזהות 5hmC בתאים מרובים ואת הרקמות. זה נוח ו ניתן לבצע עם ציוד משותף במעבדה. התחל על ידי מיקום העכבר עם הפנים כלפי מעלה על לוח פלסטיק ותיקון כל איבר עם סרט דביק.השתמש מספריים כירורגיים לחתוך דרך העור והשרירים, ולפתוח את חלל בית החזה. לחשוף את הלב ולנתק חלק קטן של אטריום הנכון עם מספריים כירורגיים עדין. באמצעות מזרק חד פעמי 10 מיליליטר, מעוקר, לבלבל את העכבר מן החדר השמאלי עם PBS קר.לאחר מכן, לבלבל את העכבר עם 4%PFA עד שהוא נוקשה. לאחר מכן, לפתוח את הגולגולת עם מאלץ עצם ולהסיר את המוח. מניחים את המוח לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר מלא חמישה מיליליטר של 4% PFA ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס.לאחר 24 שעות, מעבירים את המוח לתסיסה של 30% סוכרוז ומשאירים אותו בארבע מעלות צלזיוס להתייבשות מוחלטת. לפני החיתוך, דפק את המוח בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית וקירור למינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. דגימות מוח חתוכות בעובי של 20 עד 40 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום קריוסטט.לאסוף קטעים לתוך PBS ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס. להרים את חלקי המוח של עניין ולשים אותם לתוך צלחת 24 גם עם PBS. לשטוף חלקים עם PBS על שייקר במשך 10 דקות.מוציאים את ה-PBS ומטפלים בחומצה הידרוכלורית חד-טוחנית שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. חומצה הידרוכלורית היא קורוזיבית ובבקשה להכין אותו בהמתנה כימית. לאחר מכן, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות ולחסום אותם עם PBS המכיל 3% סרום עזים נורמלי ו 0.1% טריטון X-100.השאירו את הדגימות על שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה. מוסיפים נוגדנים ראשוניים ספציפיים למקטעים ו דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר. למחרת, להוציא את הדגימות ולהשאיר אותם בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף נוגדנים משניים. מכסים את הצלחת עם אלומיניום ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת תוך כדי רעידות. לאחר הדגירה, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS ולהרים אותם על שקופיות.הוסיפו 100 עד 150 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד עמעום, מכסים בזכוכית כיסוי פרימיום וחותמים עם לק. תדמיין את חלקי המוח במיקרוסקופ רגיל או קונפוקל. כדי לבודד דנ"א גנומי, התחל על ידי ניתוח רקמות ההיפוקמפוס, קליפת המוח והקטנה על צלחת מקורר קרח.מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ תות DNA וטוחנים את הרקמות. מעבירים את הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי ומוסיפים 250 מיקרוגרם חלבון-K לכל 600 מיקרוליטר של מאגר תמוגה. לאחר מכן, מוסיפים כ-50 מיקרוגרם של RNase A לדגימה ודגירה למשך 12 שעות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, מוסיפים נפח שווה של פנול כלורופורם isoamyl אלכוהול ומערבבים ביסודיות. צנטריפוגה את התערובת על פי הוראות כתב יד ולהעביר את supernatant לצינור חדש. מוסיפים 600 מיקרוליטרים של כלורופורם לעל-טבעי, מערבבים ביסודיות וצנטריפוגה לפי הוראות כתב היד.מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש ומוסיפים 500 מיקרוליטרים של isopropanol. מערבבים ביסודיות וצנטריפוגה שוב כדי לזרז את ה-DNA. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את העל-טבעי, ושטפו את גלולת הדנ"א ב-70% אתנול בהתאם לכיווני כתב היד.אוויר לייבש את גלולת ה-DNA לחלוטין ולאחר מכן, להמיס אותו במאגר טריס-HCl. לפני ההתחלה, הכינו את הפתרונות הנדרשים ודגמו תערובת לפי הוראות כתב היד. Denature דגימת ה-DNA על ידי חימום זה 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן, למקם אותו על קרח.חותכים את הגודל המתאים של קרום ניילון ולשטוף אותו עם 6X SSC. מניחים את הממברנה על מנגנון כתם נקודה ולחבר את משאבת ואקום. ספוט שש נקודות microliter על הממברנה ולהכליל במשך 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, לחסום את הממברנה מדגם עם חלב ללא שומן מלוחים טריס-buffered, או TBS, במשך שעה אחת. מוסיפים את נוגדן הארנב הפולקלונאלי נגד 5-הידרוקסימטילציטוסין לממברנה ומצטיידים במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להשאיר את הממברנה מדגם בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, ולאחר מכן לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBS.דגירה הממברנה עם נוגדן משני נגד ארנב במשך 30 דקות ולאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים עם TBS. לדמיין את אותות chemiluminescence לכמת את עוצמתם. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לדמיין 5-hydroxymethylcytosin, או 5hmC, בהיפוקמפוס של עכברים בוגרים.Immunofluorescence עם נוגדנים נגד תאים עצביים, 5hmC מגלה כי יש העשרה של 5hmC בנוירונים. דינמיקה של 5hmC במהלך התפתחות עצבית ניתן לקבוע עם מבחנה נקודה כתם של דגימות DNA מבודדים מתרבים ומובחנים תאי גזע עצביים למבוגרים. רמות גלובליות של 5hmC להגדיל באופן משמעותי במהלך ההידול ואת הרמה של 5hmC בנוירונים גבוה יותר מאשר בתאי גזע עצביים.השלב העיקרי בשיטה זו הוא לוודא כי denaturation מלא של דגימות DNA.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

רגישות גבוהה 5-hydroxymethylcytosine איתור ברקמה Balb / C המוח

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

כירורגי של השתלת תאים עכבר גזע עצביים לתוך מיתרי השדרה של עכברים נגועים בנגיף הפטיטיס עכבר Neurotropic

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

ספירת בתאי גזע עצביים באמצעות מבחני המשובטים

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...