Name: the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00
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XLは、中国国家主要研究開発プログラム(2017YFE0196600)と中国国家自然科学財団(助成第31771395号、31571518)によって一部支援されました。Q.S.は、中国国家主要研究開発プログラム(2017YFC1001703)と浙江省の主要研究開発プログラム(2017C03009)の支援を受けました。W.X.は浙江省自然科学財団(LY18H020002)と浙江省科学技術部(2017C37057)の支援を受けた。

すべての動物の手順は浙江大学の動物倫理委員会によって承認されています。
1. 成人神経幹細胞とニューロンの培養
<ol><li>成人の前脳から成体神経幹細胞を分離する(8〜10週齢)C57/BL6雄マウスは、前述の31,32である。</li>
	<li>20 ng/mL FGF-2を含むDMEM/F-12培地中の成人神経幹細胞、20ng/mL EGF、2%B27サプリメント、1%抗生物質抗マイコテ?...

<ol>
	<li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease.">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li><li>Yao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurogenesis.">Epigenetic mechanisms in neurogenesis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).</li><li>Day, J. J., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+memory+formation.">DNA methylation and memory formation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).</li><li>Wu, X. J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET-mediated+active+DNA+demethylation:+mechanism,+function+and+beyond.">TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).</li><li>Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine-Mediated+DNA+Demethylation+in+Stem+Cells+and+Development.">5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development.</a> Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).</li><li>Li, S., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+regulatory+landscape+of+RNA+modifications.">The pivotal regulatory landscape of RNA modifications.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).</li><li>Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+field+of+epigenetics+in+neurodegeneration+and+neuroprotection.">The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-Methylcytosine+to+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mammalian+DNA+by+MLL+Partner+TET1.">Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+modifies+the+DNA+methylation+landscape+in+the+adult+brain.">Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt1+and+Dnmt3a+maintain+DNA+methylation+and+regulate+synaptic+function+in+adult+forebrain+neurons.">Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Geneticset. , 245-254 (2003).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Shu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+alteration+of+5-hydroxymenthylcytosine+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> BMC Genomics. 17, (2016).</li><li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs.">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li><li>Bernstein, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylation-associated+epigenetic+modifiers+of+Alzheimer's+disease+modulate+Tau-induced+neurotoxicity.">5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).</li><li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease.">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair.">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li><li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+DNA+methylation:+mechanisms,+genomics,+and+biological+functions.">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905 (2013).</li><li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos.">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194 (2011).</li><li>Pastor, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+hydroxymethylation+changes+are+associated+with+neurodevelopmental+genes+in+the+developing+human+cerebellum.">Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum.</a> Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency.">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, 15903 (2017).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation.">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).</li><li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem/progenitor+cells.">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

エピジェネティック修飾は、脳の発達、成熟、および機能の間に重要な役割を果たします。DNA修飾の安定したマーカーとして、動的5-hmCは行動適応、神経活性に応答し、遺伝子発現と正の相関関係がある。したがって、脳および神経障害4の正常な機能に関与している。細胞や組織におけるその機能を探索するには、5-hmCの存在を検出し、治療前と治療後のレベルを比較する?...

DNA修飾、ヒストン修飾およびRNA修飾を含むエピジェネティック修飾は、多様な生物学的プロセスおよび疾患1、2、3において重要な機能を果たすることが示されている。4,5,6,7.長い間、DNAメチル化(すなわち、5-メチルサイトシン(5-mC))は、非常に安定なエピジェネティックマーカーと見なされており、ゲノム内で更に改変することはできません。最近では、TET1、TET2、TET38、9を含むTET(11-11転座)ファミリータンパク質により、5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hmC)に5-mCを酸化することができることが分かっています。さらなる研究は、5-hmCが安定したマーカーとして機能し、遺伝子発現4、10、11、12を調節することにより生物学的役割を果たすことができることを示しています。
本示の証拠は、5-hmCが哺乳動物の他のタイプの組織に対して神経組織/細胞において非常に濃縮され、神経発達13、14の間に動的特徴を示すことを示している。神経系では、5hmC媒介エピジェネティック修飾は、神経幹細胞、神経活動、学習および記憶を調節する上で重要な役割を果たし、レット症候群、自閉症、アルツハイマー病を含む複数の神経疾患に関与している。病気、ハンチントン病等 2,13,15,16,17,18,19,20.
細胞および組織の5-hmCを検出するためのいくつかのアプローチがあります14,21,22,23,24.ここでは、5hmCの存在を検出し、5-hmCのグローバルレベルを定量化する2つの方法について述べています:免疫蛍光染色とDNAドットブロット。これらの2つの方法は便利で敏感であり、以前の研究25、26、27、28、29、30で正常に使用されている。これら2つの方法の重要なステップは、DNAの脱彩化です。5-hmCの免疫蛍光染色のためには、1M HClを有する試料の前処理が必要である。5hmCドットブロットの場合、DNAの退化はNaOH溶液で行われます。これらの2つの方法と次世代シーケンシングは、5-hmCの機能を調るための非常に有用なツールです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop software</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-5-hydroxymethylcytosine</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12580-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>OmegaScientific</td>
			<td>DM25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Z0325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon membrane (Hybond&#8482;-N+ )</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>RPN303B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020108926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0899-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>VVR</td>
			<td>39450-01-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8210</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice

哺乳類ゲノムでは複数のDNA修飾が同定されている。そのうち、5-メチルサイトシンおよび5-ヒドロキシメチルシトシン媒介エピジェネティックメカニズムが集中的に研究されている。5-ヒドロキシメチルシトシンは、脳の胚および出生後の発達中に動的特徴を示し、遺伝子発現の調節機能を果たし、複数の神経障害に関与している。ここでは、マウスの培養細胞および脳組織における5-ヒドロキシメチルシトシンを検出する免疫蛍光染色およびDNAドットブロットを含む詳細な方法について説明する。

成体マウスの海馬における5hmCの分布を明らかにするために、神経細胞(NeuN)および5-hmCに対する抗体を用いて免疫蛍光を行った。海馬では、5-hmCがニューロン細胞マーカーNeuN(図1A-H)とうまく共局在し、ニューロン中の5-hmCの濃縮を示唆した。
神経発達中の5hmCのダイナミクスを決定するために、ドットブロットは、増殖および分化した成人...

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The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

ここでは、細胞および脳組織中の5-ヒドロキシメチルシトシンを検出するプロトコルを提示し、免疫蛍光染色およびDNAドットブロット法を利用する。

マウスの神経幹細胞と脳における5-ヒドロキシメチルシトシンの検出

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

ここでは、免疫蛍光、新しい方法、およびDNAドットブロットを用いて、細胞および脳組織における5-ヒドロキシメチルシトシンを検出するプロトコルを提示する。5-ヒドロキシメチルシトシン、すなわち5hmCは、エピジェネティック修飾を軽減し、遺伝子発現を調節する上で重要な機能を果たし、複数の神経疾患に関与する。実際、我々の方法は、複数の細胞および組織の5hmCを検出するために使用することができる。これは便利で、ラボで一般的な機器で実行することができます。まず、プラスチック製のボード上にマウスの顔を上に置き、各手足を粘着テープで固定します。手術用はさみを使って皮膚や筋肉を切り抜き、胸腔を開きます。心臓を露出させ、細かい外科用はさみで右心房の小さな部分を切り落とす。10ミリリットルの使い捨て、殺菌されたシリンジを使用して、冷たいPBSで左心室からマウスを浸透する。次に、マウスに 4%PFA を付けて、硬くなるまで浸透させます。その後、骨の鉗子で頭蓋骨を開き、脳を取り除きます。4%PFAの5ミリリットルで満たされた15ミリリットルの遠心管に脳を入れ、摂氏4度で保存します。24時間後、脳を30%スクロース溶液に移し、完全な脱水のために摂氏4度にしておきます。切断する前に、脳を最適な切断温度化合物に浸透させ、少なくとも1時間はマイナス20度まで冷却した。クライオスタットミクロトームを使用して、20〜40マイクロメートルの厚さで脳サンプルを切り離します。PBSにセクションを収集し、摂氏4度で保存します。興味のある脳のセクションをピックアップし、PBSと24ウェルプレートにそれらを入れます.シェーカーでPBSで10分間洗浄します。PBSを取り出し、37°Cで予熱した1モル塩酸を30分間処理します。塩酸は腐食性であり、化学ホールドで準備してください。その後、サンプルをPBSで5分間3回洗浄し、3%正常なヤギ血清と0.1%トリトンX-100を含むPBSでそれらをブロックします。サンプルは、室温でシェーカーに1時間放置します。特定の一次抗体をセクションに加え、シェーカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、サンプルを取り出し、室温で1時間放置します。PBSでサンプルを3回洗浄し、二次抗体を添加します。プレートにアルミニウムを覆い、揺れながら室温で1時間放置します。インキュベーション後、サンプルをPBSで3回洗浄し、スライドに取り付けます。アンチフェードマウント媒体を100~150マイクロリットル加え、プレミアムカバーガラスで覆い、マニキュアでシールします。通常の顕微鏡または共焦点顕微鏡で脳の切片を画像化します。ゲノムDNAを分離するには、海馬、皮質、小脳組織を氷冷皿で解剖することから始めます。1ミリリットルのDNAライシスバッファーを加え、組織を粉砕します。サンプルをきれいなマイクロ遠心分離チューブに移し、600マイクロリットルのリシスバッファーごとに250マイクログラムのプロテイナーゼKを加えます。その後、サンプルあたり約50マイクログラムのRNase Aを加え、摂氏37度で少なくとも12時間インキュベートします。インキュベーション後、等量のフェノールクロロホルムイソアミルアルコールを加え、十分に混ぜます。原稿の方向に従って混合物を遠心分離し、上清を新しい管に移します。上清に600マイクロリットルのクロロホルムを加え、原稿の指示に従って十分に混ぜ合わせ、遠心分離機を加えます。上清を新しいチューブに移し、500マイクロリットルのイソプロパノールを加えます。DNAを沈殿させるために、完全に混合し、再び遠心分離機を再び混合します。遠心分離後、上清を捨て、原稿の指示に従って70%エタノールでDNAペレットを洗浄する。空気はDNAペレットを完全に乾燥し、次にTris-HClバッファーに溶解する。開始する前に、原稿の指示に従って必要な溶液とサンプル混合物を準備してください。DNAサンプルを摂氏100度に10分間加熱して変性し、氷の上に置きます。ナイロン膜の適切なサイズをカットし、6X SSCでそれをすすいでください。膜をドットブロット装置に設置し、真空ポンプを接続します。6マイクロリットルのドットを膜に見つけ、摂氏80度で30分間ハイブリダイズします。その後、無脂肪ミルクとトリス緩衝生理食物(TBS)でサンプル膜を1時間ブロックします。ポリクローナルウサギ抗5-ヒドロキシメチルシトシン抗体を膜に加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、試料膜を室温に1時間放置し、その後、膜をTBSで3回洗浄します。膜を抗ウサギ二次抗体で30分間インキュベートし、TBSで3回洗浄します。このプロトコルは、成体マウスの海馬における5-ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)を可視化するために使用することができる。神経細胞に対する抗体を用いた免疫蛍光は、5hmCはニューロンに5hmCの濃縮があることを明らかにする。ニューロンの発達中の5hmCのダイナミクスは、増殖および分化された成体神経幹細胞から分離されたDNAサンプルのドットブロットアッセイで決定することができる。5hmCのグローバルレベルは分化中に有意に増加し、ニューロンの5hmCのレベルは神経幹細胞よりも高い。この方法の重要なステップは、DNAサンプルの完全な変性を確認することです。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

のBalb / Cの脳組織の高感度5 hydroxymethylcytosine検出

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

神経向性マウス肝炎ウイルスに感染したマウスの脊髄にマウス神経幹細胞の外科的移植

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

モデル星細胞腫発症機序<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

クローンのアッセイを用いて神経幹細胞の列挙

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...