Name: the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice at JoVE.com

XL은 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFE0196600)과 중국 국립자연과학재단(Grant Nos. 31771395, 31571518)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. Q.S.는 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2017YFC1001703)과 절강성의 주요 연구 개발 프로그램(2017C03009)의 지원을 받았습니다. W.X.는 절강성 자연과학 재단(LY18H020002)과 절강성 과학기술부(2017C37057)의 지원을 받았습니다.

모든 동물 절차는 절강 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 성인 신경 줄기 세포와 뉴런의 문화
<ol><li>성인의 전뇌로부터 성체 신경줄기세포를 분리(8-10주령) C57/BL6 수컷 마우스는 앞서31,32.</li>
	<li>배양 성인 신경 줄기 세포DMEM/F-12 배지에서 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 보충제, 1% 항생제 항마이코제, 및 37°C에서 5%<su...

<ol>
	<li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease.">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li><li>Yao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurogenesis.">Epigenetic mechanisms in neurogenesis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).</li><li>Day, J. J., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+memory+formation.">DNA methylation and memory formation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).</li><li>Wu, X. J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET-mediated+active+DNA+demethylation:+mechanism,+function+and+beyond.">TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).</li><li>Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine-Mediated+DNA+Demethylation+in+Stem+Cells+and+Development.">5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development.</a> Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).</li><li>Li, S., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+regulatory+landscape+of+RNA+modifications.">The pivotal regulatory landscape of RNA modifications.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).</li><li>Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+field+of+epigenetics+in+neurodegeneration+and+neuroprotection.">The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-Methylcytosine+to+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mammalian+DNA+by+MLL+Partner+TET1.">Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+modifies+the+DNA+methylation+landscape+in+the+adult+brain.">Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt1+and+Dnmt3a+maintain+DNA+methylation+and+regulate+synaptic+function+in+adult+forebrain+neurons.">Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Geneticset. , 245-254 (2003).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Shu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+alteration+of+5-hydroxymenthylcytosine+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> BMC Genomics. 17, (2016).</li><li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs.">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li><li>Bernstein, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylation-associated+epigenetic+modifiers+of+Alzheimer's+disease+modulate+Tau-induced+neurotoxicity.">5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).</li><li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease.">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair.">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li><li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+DNA+methylation:+mechanisms,+genomics,+and+biological+functions.">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905 (2013).</li><li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos.">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194 (2011).</li><li>Pastor, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+hydroxymethylation+changes+are+associated+with+neurodevelopmental+genes+in+the+developing+human+cerebellum.">Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum.</a> Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency.">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, 15903 (2017).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation.">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).</li><li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem/progenitor+cells.">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

후성 유전학 수정은 뇌 발달, 성숙 및 기능 중에 필수적인 역할을합니다. DNA 변형을 위한 안정한 마커로서, 동적 5-hmC는 행동 적응, 신경 활성에 반응하고, 유전자 발현과 긍정적으로 상관관계가 있다; 따라서, 뇌 및 신경 장애의 정상적인 기능에 관여4. 세포와 조직에서 의 기능을 탐구하려면 5-hmC의 존재를 감지하고 치료 전후의 수준을 비교해야합니다. 여기에서, 우리는 실험실?...

DNA 변형, 히스톤 변형 및 RNA 변형을 포함한 후생 유전학적 변형은 다양한 생물학적 과정과 질병1,2,3에서필수적인 기능을 하는 것으로 나타났습니다. 4개 , 5개 , 6개 , 7.오랜 시간 동안, DNA 메틸화(즉, 5-메틸시토신(5-mC))는 매우 안정적인 후성유전학 적 마커로서 간주되어 왔으며 게놈에서 더 이상 변형될 수 없다. 최근, 5-mC는 TET1, TET2 및 TET38,9를포함하는 TET(11-11전좌) 패밀리 단백질에 의해 5-하이드록시메틸시토신(5-hmC)으로 산화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 추가 연구는 5-hmC가 안정한 마커로 작용할 수 있고 유전자 발현조절을통해 생물학적 역할을 할 수 있음을 보여준다4,10,11,12.
본 증거는 5-hmC가 포유동물의 다른 유형의 조직에 비해 신경 조직/세포에서 고도로 농축되고, 신경 발달13,14동안 동적 특징을 나타낸다는 것을 나타낸다. 신경 시스템에서, 5-hmC 중재 후생 유전학 수정 신경 줄기 세포를 조절에 중요 한 역할을, 신경 활동, 학습 및 메모리, Rett 증후군을 포함 하 여 여러 신경 질환에 관여, 자폐증, 알 츠 하이 머 병 질병, 헌팅턴병 등2,13,15,16,17,18,19,20.
세포 및 조직14,21,22,23,24에서5-hmC를 검출하기위한 몇 가지 접근법이 있습니다. 여기에서, 우리는 5-hmC의 존재를 검출하고 5-hmC의 글로벌 수준을 정량화하는 2개의 방법을 기술합니다: 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩. 이 두 가지 방법은 편리하고 민감하며 이전 연구25,26,27,28,29,30에서성공적으로 사용되었습니다. 이 두 방법의 주요 단계는 DNA 변성입니다. 5-hmC의 면역 형광 염색을 위해 1 M HCl로 시료를 전처리해야합니다. 5-hmC 도트 블롯의 경우 NAOH 용액으로 DNA 변이가 수행됩니다. 이 두 가지 방법은 차세대 시퀀싱과 함께 5-hmC의 기능을 조사하는 데 매우 유용한 도구입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop software</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-5-hydroxymethylcytosine</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12580-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>OmegaScientific</td>
			<td>DM25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Z0325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon membrane (Hybond&#8482;-N+ )</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>RPN303B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020108926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0899-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>VVR</td>
			<td>39450-01-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8210</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice

포유류 게놈에서 여러 DNA 변형이 확인되었다. 그 중, 5-메틸시토신 및 5-하이드록시메틸시토신 매개 후생유전학 적 메커니즘이 집중적으로 연구되었습니다. 5-하이드록시메틸시토신은 뇌의 배아 및 산후 발달 시 동적 특징을 표시하고 유전자 발현에서 조절 기능을 하며 여러 신경 장애에 관여합니다. 여기서, 우리는 마우스의 배양 된 세포 및 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸 사이토신을 검출하기 위해 면역 형광 염색 및 DNA 도트 블롯을 포함한 상세한 방법을 설명합니다.

성인 마우스의 해마에서 5-hmC의 분포를 밝히기 위해, 우리는 신경 세포 (NeuN) 및 5-hmC에 대한 항체로 면역 형광을 수행했습니다. 해마에서, 5-hmC는 뉴런 세포 마커 NeuN(그림1A-H)과잘 국소화되어 뉴런에서 5-hmC의 농축을 시사한다.
신경 발달 도중 5-hmC의 역학을 결정하기 위하여는, 점 얼룩은 증식하고 분화한 성인 신경 줄기 세포 (NSC)에서 분리된 ...

Watch this Scientific Journal Video about The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice at JoVE.com

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

여기에서, 우리는 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩 방법을 활용하여 세포와 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다.

신경 줄기 세포와 쥐의 뇌에서 5-하이드록시메틸시토신의 검출

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

여기서, 우리는 면역 형광, 새로운 방법 및 DNA 점 얼룩을 사용하여 세포및 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 5-하이드록시메틸시토신, 즉 5hmC, 완화된 후성유전학적 변형, 유전자 발현 조절에 중요한 기능을 담당하고 여러 신경 장애에 관여하는 것으로 보인다.실제로, 우리의 방법은 다중 세포및 조직에서 5hmC를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그것은 편리하고 실험실에서 일반적인 장비와 함께 수행 할 수 있습니다. 먼저 마우스를 플라스틱 보드에 올려 놓고 각 팔다리를 끈적거리는 테이프로 고정하는 것으로 시작합니다.외과 가위를 사용하여 피부와 근육을 잘라 내고 흉부 구멍을 엽니다. 심장을 노출하고 미세 수술 가위로 오른쪽 아트리움의 작은 부분을 잘라. 10 밀리리터 일회용 살균 주사기를 사용하여 왼쪽 심실에서 마우스를 차가운 PBS로 견딜 수 있습니다.그런 다음 마우스가 뻣뻣해질 때까지 4 %의 PFA로 마우스를 견딜 수 있습니다. 그런 다음 뼈 집게로 두개골을 열고 뇌를 제거합니다. 뇌를 4%PFA의 5밀리리터로 채워진 15밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고 섭씨 4도에 보관하십시오.24 시간 후에, 30% 자당 용액으로 두뇌를 전송하고 완전한 탈수에 대한 섭씨 4도에서 둡니다. 절개하기 전에 최적의 절삭 온도 화합물에 뇌를 침지하고 적어도 한 시간 동안 영하 20도까지 식힙니다. 저온 저온 마이크로토메를 사용하여 20~40마이크로미터두께의 뇌 샘플을 절개한다.PBS로 섹션을 수집하고 섭씨 4도에 보관하십시오. 관심의 뇌 섹션을 선택하고 PBS와 24 잘 접시에 넣어. PBS로 섹션을 셰이커에 10분간 세척합니다.PBS를 제거하고 예열된 1-어금다 염산으로 30분 동안 섭씨 37도에서 치료하십시오. 염산은 부식성이며 화학 적 보류로 준비하십시오. 그런 다음 PBS로 샘플을 5분 동안 세 번 세척하고 3%의 일반 염소 세럼과 0.1%트리톤 X-100을 함유한 PBS로 차단합니다.샘플을 실온에서 1시간 동안 셰이커에 두십시오. 섹션에 특정 1 차 적인 항체를 추가 하 고 셰이커에 섭씨 4도에서 하룻밤 배양. 다음 날, 샘플을 꺼내 1 시간 동안 실온에서 둡니다.PBS로 샘플을 세 번 세척하고 이차 항체를 추가합니다. 알루미늄으로 접시를 덮고 흔들면서 실온에서 1 시간 동안 둡니다. 인큐베이션 후 PBS로 샘플을 세 번 세척하고 슬라이드에 장착합니다.페이드 방지 마운팅 매체100~150마이크로리터를 추가하고 프리미엄 커버 글래스로 커버하고 매니큐어로 밀봉합니다. 규칙적 또는 공초점 현미경으로 뇌 섹션을 이미지합니다. 게놈 DNA를 격리하려면 해마, 피질 및 소뇌 조직을 얼음 냉각 접시에 해부하는 것으로 시작합니다.DNA 리시스 버퍼 1밀리리터를 추가하고 조직을 갈아. 샘플을 깨끗한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 리스 버퍼의 600 마이크로 리터당 250 마이크로 그램의 단백질아제-K를 추가합니다. 그런 다음 샘플 당 약 50 마이크로 그램의 RNase A를 추가하고 섭씨 37도에서 적어도 12 시간 동안 배양하십시오.인큐베이션 후 페놀 클로로폼 이소아밀 알코올의 동일한 볼륨을 추가하고 철저하게 혼합합니다. 원고 방향에 따라 혼합물을 원심 분리하고 상체를 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 600 마이크로리터의 클로로폼을 상체에 넣고, 원고 의 지시에 따라 철저히 섞고 원심분리기를 섞습니다.상체를 새로운 튜브로 옮기고 500 마이크로리터의 이소프로판올을 추가합니다. DNA를 침전시키기 위해 철저하게 혼합하고 원심분리기를 다시 섞습니다. 원심분리 후, 상체를 버리고, 원고 의 방향에 따라 DNA 펠릿을 70%에탄올로 씻는다.공기는 DNA 펠릿을 완전히 건조한 다음 Tris-HCl 버퍼에 녹입니다. 시작하기 전에 원고 방향에 따라 필요한 솔루션 및 샘플 혼합물을 준비하십시오. DNA 샘플을 섭씨 100도까지 10분 간 가열한 다음 얼음 위에 놓습니다.나일론 멤브레인의 적절한 크기를 잘라 6X SSC로 헹신다. 멤브레인을 도트 블롯 장치에 놓고 진공 펌프를 연결합니다. 멤브레인에 6 마이크로 리터 점을 발견하고 섭씨 80도에서 30 분 동안 혼성화하십시오.그런 다음 무지방 우유와 트리스 완충식식염수 또는 TBS로 샘플 멤브레인을 1시간 동안 차단합니다. 다클론 토끼 항-5-하이드록시메틸시토신 항체를 막에 넣고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양한다. 다음 날, 1 시간 동안 실온에서 샘플 멤브레인을 두고 다음 TBS로 멤브레인을 세 번 세척하십시오.항토끼 이차 항체로 멤브레인을 30분 동안 배양한 다음 TBS로 세 번 세척합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스의 해마에서 5-하이드록시메틸시토신 또는 5hmC를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.신경 세포에 대한 항체를 가진 면역 형광, 5hmC는 뉴런에 있는 5hmC의 농축이 있다는 것을 밝힙니다. 신경 발달 도중 5hmC의 역학은 증식및 분화한 성인 신경 줄기 세포에서 격리된 DNA 견본의 점 얼룩 분석으로 결정될 수 있습니다. 5hmC의 글로벌 수준은 분화 도중 현저하게 증가하고 뉴런에 있는 5hmC의 수준은 신경 줄기 세포에서 보다는 더 높습니다.이 방법의 핵심 단계는 DNA 샘플의 완전한 거부를 확인하는 것입니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

연구

신경과학

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Neurotropic 마우스 간염 바이러스에 감염된 마우스의 척수 코드에 마우스 신경 줄기 세포의 이식 외과

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

모델링 성상 세포종 병인<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

신경 줄기 세포의 열거 클론 세이를 이용하여

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...