Name: the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice at JoVE.com

XL ble støttet delvis av den nasjonale nøkkel R & D-programmet i Kina (2017YFE0196600), og National Natural Science Foundation i Kina (Grant NOS. 31771395, 31571518). QS var understøttet av det nasjonal nøkkel forskning og utviklingen program av porselen (2017YFC1001703) og nøkkelen forskning og utviklingen program av Zhejiang område (2017C03009). W.X. ble støttet av Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (LY18H020002) og Science Technology Department of Zhejiang-provinsen (2017C37057).

Alle dyr prosedyrene er godkjent av Animal etikk Committee of Zhejiang University.
1. kulturen i voksen nevrale stamceller og neurons
<ol><li>Isolere voksen nevrale stamceller fra forebrain av en voksen (8-10 uke gammel) C57/BL6 mannlig mus som beskrevet tidligere31,32.</li>
	<li>Kultur voksen nevrale stamceller i DMEM/F-12 medium som inneholder 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 supplement, 1% antibiotika-antimykotisk, og 2 mM L-g...

<ol>
	<li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease.">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li><li>Yao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurogenesis.">Epigenetic mechanisms in neurogenesis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).</li><li>Day, J. J., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+memory+formation.">DNA methylation and memory formation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).</li><li>Wu, X. J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET-mediated+active+DNA+demethylation:+mechanism,+function+and+beyond.">TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).</li><li>Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine-Mediated+DNA+Demethylation+in+Stem+Cells+and+Development.">5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development.</a> Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).</li><li>Li, S., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+regulatory+landscape+of+RNA+modifications.">The pivotal regulatory landscape of RNA modifications.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).</li><li>Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+field+of+epigenetics+in+neurodegeneration+and+neuroprotection.">The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-Methylcytosine+to+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mammalian+DNA+by+MLL+Partner+TET1.">Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+modifies+the+DNA+methylation+landscape+in+the+adult+brain.">Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt1+and+Dnmt3a+maintain+DNA+methylation+and+regulate+synaptic+function+in+adult+forebrain+neurons.">Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Geneticset. , 245-254 (2003).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Shu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+alteration+of+5-hydroxymenthylcytosine+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> BMC Genomics. 17, (2016).</li><li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs.">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li><li>Bernstein, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylation-associated+epigenetic+modifiers+of+Alzheimer's+disease+modulate+Tau-induced+neurotoxicity.">5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).</li><li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease.">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair.">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li><li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+DNA+methylation:+mechanisms,+genomics,+and+biological+functions.">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905 (2013).</li><li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos.">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194 (2011).</li><li>Pastor, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+hydroxymethylation+changes+are+associated+with+neurodevelopmental+genes+in+the+developing+human+cerebellum.">Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum.</a> Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency.">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, 15903 (2017).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation.">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).</li><li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem/progenitor+cells.">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

Epigenetic modifikasjoner spiller viktige roller under hjernens utvikling, modning og funksjon. Som en stabil markør for DNA modifisering, dynamisk 5-hmC reagerer på atferdsmessige tilpasning, neuronal aktivitet, og er positivt korrelert med genuttrykk; Dermed er det involvert i normal funksjon av hjernen og nevrologisk lidelse4. For å utforske sin funksjon i celler og vev, er det nødvendig å oppdage eksistensen av 5-hmC og sammenligne nivået før og etter behandling. Her demonstrerte vi to ...

Epigenetic modifikasjoner, inkludert DNA modifikasjon, histone modifisering og RNA modifisering, har vist å spille viktige funksjoner i ulike biologiske prosesser og sykdommer1,2,3, 4 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7. i lang tid, DNA metylering (dvs. 5-methylcytosine (5-mC)) har blitt sett på som en svært stabil epigenetic markør og kan ikke bli ytterligere endret i Genova. Nylig har det blitt funnet at 5-mC kan være oksidert til 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) av tet (Ten-eleven translokasjoner) familie proteiner inkludert TET1, TET2, og TET38,9. Videre studier viser at 5-hmC kan tjene som en stabil markør og spille biologiske roller gjennom å regulere genuttrykk4,10,11,12.
Den nåværende bevisene tyder på at 5-hmC er svært beriket i neuronal vev/celler i forhold til andre typer vev i pattedyr, og utstillinger dynamiske funksjoner under neuronal utvikling13,14. I neuronal systemet, 5-hmC mediert epigenetic modifikasjoner spiller en viktig rolle i å regulere nevrale stamceller, neuronal aktivitet, læring og hukommelse, og er involvert i flere nevrologiske lidelser, inkludert rett syndrom, autisme, Alzheimers sykdom, Huntington sykdom, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Det er flere tilnærminger for å oppdage 5-hmC i celler og vev14,21,22,23,24. Her beskriver vi to metoder for å oppdage eksistensen av 5-hmC og Kvantifisere det globale nivået av 5-hmC: immunofluorescence farging og DNA dot-blot. Disse to metodene er praktiske og følsomme, og har blitt brukt i tidligere studier25,26,27,28,29,30. De viktigste trinnene i disse to metodene er DNA-denaturering. For immunofluorescence farging av 5-hmC er forhåndsbehandling av prøver med 1 M HCl nødvendig. For 5-hmC dot-blot utføres DNA-denaturering med NaOH-løsning. Disse to metodene sammen med neste generasjons sekvensering er svært nyttig verktøy for å undersøke funksjonen til 5-hmC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop software</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-5-hydroxymethylcytosine</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12580-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>OmegaScientific</td>
			<td>DM25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Z0325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon membrane (Hybond&#8482;-N+ )</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>RPN303B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020108926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0899-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>VVR</td>
			<td>39450-01-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8210</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice

Flere DNA modifikasjoner har blitt identifisert i pattedyr Genova. Av det, 5-methylcytosine og 5-hydroxymethylcytosine-mediert epigenetic mekanismer har vært intensivt studert. 5-hydroxymethylcytosine viser dynamiske funksjoner under embryonale og postnatal utviklingen av hjernen, spiller en regulerende funksjon i genuttrykk, og er involvert i flere nevrologiske lidelser. Her beskriver vi detaljerte metoder inkludert immunofluorescence farging og DNA dot-blot å oppdage 5-hydroxymethylcytosine i kulturperler celler og hjernen vev av mus.

For å avdekke fordelingen av 5-hmC i hippocampus hos voksne mus, utførte vi immunofluorescence med antistoffer mot neuronal celler (NeuN) og 5-hmC. I hippocampus, 5-hmC co-lokaliserte godt med neuronal celle markør NeuN (figur 1a-H), antyder en berikelse av 5-hmC i neurons.
For å bestemme dynamikken i 5-hmC under neuronal utvikling, en dot-blot ble først utført med DNA-prøver isolert fra voksende og differensiert voksen nevrale stamceller (...

Watch this Scientific Journal Video about The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice at JoVE.com

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Her presenterer vi en protokoll for å oppdage 5-hydroxymethylcytosine i celler og hjernen vev, utnytte immunofluorescence farging og DNA dot-blot metoder.

Påvisning av 5-Hydroxymethylcytosine i nevrale stamceller og hjerner av mus

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Her presenterer vi en protokoll for å oppdage 5-hydroksymetylcytosin i celler og hjernevev ved hjelp av immunofluorescence, den nye metoden og DNA dot-blot. 5-hydroksymetylcytosin, det vil si 5hmC, redusert epigenetisk modifikasjon, spiller viktig funksjon i å regulere genuttrykk og involvert i flere nevrologiske lidelser.Faktisk kan våre metoder brukes til å oppdage 5hmC i flere celler og vev. Det er praktisk og kan utføres med felles utstyr i laboratoriet. Begynn med å plassere musen med forsiden opp på et plastbrett og fest hvert lem med klebrig tape.Bruk kirurgisk saks for å skjære gjennom huden og muskelen, og åpne thoraxhulen. Eksponer hjertet og kutt av en liten del av det rette atriumet med fin kirurgisk saks. Bruk en 10-milliliter disponibel, sterilisert sprøyte, perfuse musen fra venstre ventrikkel med kald PBS.Deretter perfuse musen med 4%PFA til den er stiv. Deretter åpner du skallen med bein tang og fjerner hjernen. Plasser hjernen i et 15-milliliter sentrifugerør fylt med fem milliliter på 4% PFA og lagre den på fire grader Celsius.Etter 24 timer, overfør hjernen til en 30% sukroseløsning og la den stå på fire grader Celsius for fullstendig dehydrering. Før snitting, imbed hjernen i optimal kutte temperatur sammensatte og kjølig til minus 20 grader Celsius i minst en time. Seksjon hjerneprøver med en tykkelse på 20 til 40 mikrometer ved hjelp av en kryostatmikrotom.Samle seksjoner i PBS og lagre på fire grader Celsius. Plukk opp hjernedelene av interesse og legg dem inn i en 24-brønns plate med PBS. Vask seksjoner med PBS på en shaker i 10 minutter.Fjern PBS og behandle med forvarmet en-molar saltsyre ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Saltsyre er etsende og klargjør det i kjemisk hold. Deretter vasker du prøvene tre ganger med PBS i fem minutter og blokkerer dem med PBS som inneholder 3% normalt geiteserum og 0,1% Triton X-100.La prøvene være på en shaker ved romtemperatur i en time. Legg til spesifikke primære antistoffer til seksjonene og inkuber over natten ved fire grader Celsius på en shaker. Neste dag, ta prøvene ut og la dem ved romtemperatur i en time.Vask prøvene tre ganger med PBS og tilsett sekundære antistoffer. Dekk platen med aluminium og la den stå ved romtemperatur i en time mens du rister. Etter inkubasjonen vask prøvene tre ganger med PBS og monter dem på lysbilder.Tilsett 100 til 150 mikroliter anti-fade monteringsmedium, dekk med et premium dekkglass og forsegle med neglelakk. Bilde hjerneseksjonene med et vanlig eller konfokalt mikroskop. For å isolere genomisk DNA, start med å dissekere hippocampus, cortex og cerebellum vev på en iskjølt tallerken.Tilsett en milliliter DNA lysis buffer og slip vevet. Overfør prøven til et rent mikrocentrifugerør og tilsett 250 mikrogram proteinase-K for hver 600 mikroliter lysisbuffer. Deretter legger du til ca 50 mikrogram RNase A per prøve og inkuberer i minst 12 timer ved 37 grader Celsius.Etter inkubasjonen, tilsett et likt volum fenolklorform isoamylalkohol og bland godt. Sentrifuger blandingen i henhold til manuskriptretninger og overfør det overnaturante til et nytt rør. Tilsett 600 mikroliter kloroform til det overnaturlige, bland grundig og sentrifuge i henhold til manuskriptretninger.Overfør det overnaturlige til et nytt rør og tilsett 500 mikroliter isopropanol. Bland grundig og sentrifuge igjen for å utløse DNA. Etter sentrifugeringen, kast supernatanten, og vask DNA-pelleten med 70% etanol i henhold til manuskriptretninger.Luft tørke DNA pellet helt og deretter oppløse den i Tris-HCl buffer. Før du starter, forberede de nødvendige løsninger og prøveblanding i henhold til manuskript retninger. Denature DNA-prøven ved å varme den opp til 100 grader Celsius i 10 minutter, og legg den deretter på is.Skjær riktig størrelse på en nylonmembran og skyll den med 6X SSC. Plasser membranen på et dot-blot apparat og koble vakuumpumpen. Spot seks mikroliter prikker på membranen og hybridiser i 30 minutter ved 80 grader Celsius.Deretter blokkerer du prøvemembranen med fettfri melk og Tris-bufret saltvann, eller TBS, i en time. Tilsett polyklonal kanin anti-5-hydroksymetylcytosin antistoff til membranen og inkuber over natten ved fire grader Celsius. Neste dag, la prøvemembranen ved romtemperatur i en time, og vask deretter membranen tre ganger med TBS.Inkuber membranen med anti-kanin sekundært antistoff i 30 minutter og deretter vaske tre ganger med TBS. Visualiser chemiluminescence signaler og kvantifisere intensiteten. Denne protokollen kan brukes til å visualisere 5-hydroksymetylcytosin, eller 5hmC, i hippocampus av voksne mus.Immunofluorescence med antistoffer mot nevronale celler, avslører 5hmC at det er en berikelse av 5hmC i nevroner. Dynamikken i 5hmC under nevronal utvikling kan bestemmes med en dot-blot analyse av DNA-prøver isolert fra spredning og differensierte voksne nevrale stamceller. Globale nivåer av 5hmC øker betydelig under differensiering, og nivået på 5hmC i nevroner er høyere enn i nevrale stamceller.Hovedtrinnet i denne metoden er å sørge for at fullstendig denaturation av DNA-prøver.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Påvisning av Microregional Hypoksi i Mus Cerebral Cortex av to-foton Imaging av endogen NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og kultur neural crest Celler fra Embryonic murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: Isolation and Culture of Adult nevrale stamceller fra de to nevrogene Soner Individuell Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-free Utledning av Neural Crest stamceller fra menneskelige pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modellering astrocytom Patogenese<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; In Vivo</em&gt; Bruke kortikal astrocytter eller nevrale stamceller fra Betinget, Genetisk konstruert Mus

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Opplisting av Neural stamceller Bruke Klonale Analyser

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolasjon og Culture of Adult Neural stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...