Name: the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice at JoVE.com

XL была частично поддержана Национальной программой исследований и разбивки ключей Китая (2017YFE0196600) и Национальным фондом естественных наук Китая (Grant No s. 31771395, 31571518). З.С. была поддержана Национальной программой исследований и развития ключевых стран Китая (2017YFC1001703) и Ключевой программой исследований и разработок провинции Чжэцзян (2017C03009). W.X. была поддержана Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (LY18H020002) и Отделом науки провинции Чжэцзян (2017C37057).

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по этике животных Университета Чжэцзян.
1. Культура взрослых нейронных стволовых клеток и нейронов
<ol><li>Изолировать взрослых нейронных стволовых клеток из передний мозг взрослого (8-10 недель) C57/BL6 мужской мыши, как описа...

<ol>
	<li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease.">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li><li>Yao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurogenesis.">Epigenetic mechanisms in neurogenesis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).</li><li>Day, J. J., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+memory+formation.">DNA methylation and memory formation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).</li><li>Wu, X. J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET-mediated+active+DNA+demethylation:+mechanism,+function+and+beyond.">TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).</li><li>Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine-Mediated+DNA+Demethylation+in+Stem+Cells+and+Development.">5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development.</a> Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).</li><li>Li, S., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+regulatory+landscape+of+RNA+modifications.">The pivotal regulatory landscape of RNA modifications.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).</li><li>Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+field+of+epigenetics+in+neurodegeneration+and+neuroprotection.">The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-Methylcytosine+to+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mammalian+DNA+by+MLL+Partner+TET1.">Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+modifies+the+DNA+methylation+landscape+in+the+adult+brain.">Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt1+and+Dnmt3a+maintain+DNA+methylation+and+regulate+synaptic+function+in+adult+forebrain+neurons.">Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Geneticset. , 245-254 (2003).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Shu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+alteration+of+5-hydroxymenthylcytosine+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> BMC Genomics. 17, (2016).</li><li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs.">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li><li>Bernstein, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylation-associated+epigenetic+modifiers+of+Alzheimer's+disease+modulate+Tau-induced+neurotoxicity.">5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).</li><li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease.">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair.">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li><li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+DNA+methylation:+mechanisms,+genomics,+and+biological+functions.">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905 (2013).</li><li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos.">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194 (2011).</li><li>Pastor, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+hydroxymethylation+changes+are+associated+with+neurodevelopmental+genes+in+the+developing+human+cerebellum.">Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum.</a> Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency.">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, 15903 (2017).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation.">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).</li><li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem/progenitor+cells.">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

Эпигенетические модификации играют важную роль при развитии мозга, созревании и функции. Как стабильный маркер для модификации ДНК, динамический 5-hmC реагирует на поведенческую адаптацию, нейронную активность, и положительно коррелирует с экспрессией генов; Таким образом, он участвует...

Эпигенетические модификации, включая модификацию ДНК, модификацию гистона и модификацию РНК, как было показано, играют важную роль в различных биологических процессах и заболеваниях1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. Долгое время метилирование ДНК (т.е. 5-метилцитозина (5-мС)) рассматривалось как высокостабильный эпигенетический маркер и не может быть дополнительно изменено в геноме. Недавно было установлено, что 5-mC может быть окислен до 5-гидроксиметилцитозина (5-хмС) TET (Десять-одиннадцать транслокаций) семейных белков, включая TET1, TET2, и TET38,9. Дальнейшие исследования показывают, что 5-hmC может служить стабильным маркером и играть биологические роли путем регулирования экспрессии генов4,10,11,12.
Настоящие данные свидетельствуют о том, что 5-хмС высоко обогащен нейронными тканями/клетками по сравнению с другими типами тканей у млекопитающих, и обладает динамическими особенностями во время развития нейронов13,14. В нейрональной системе, 5-hmC опосредованные эпигенетические модификации играют важную роль в регулировании нервных стволовых клеток, нейронной активности, обучения и памяти, и участвует в нескольких неврологических расстройств, включая синдром Ретт, аутизм, болезнь Альцгеймера болезни, болезнь Гентингтона и др.2,13,15,16,17,18,19,20.
Существует несколько подходов к обнаружению 5-хмВ в клетках и тканях14,21,22,23,24. Здесь мы описываем два метода обнаружения существования 5-хмИ и количественной оценки глобального уровня 5-хмС: иммунофлуоресцентное окрашивание и точечная поместья ДНК. Эти два метода удобны и чувствительны, и были успешно использованы в предыдущих исследованиях25,26,27,28,29,30. Ключевыми шагами этих двух методов являются денатурация ДНК. Для окрашивания иммунофлюоресценции 5-хмС требуется предварительная обработка образцов с 1 М ЛК. Для 5-хмC точечной блохины, денатурация ДНК выполняется с раствором NaOH. Эти два метода вместе с секвенированием следующего поколения являются очень полезными инструментами для исследования функции 5-hmC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop software</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-5-hydroxymethylcytosine</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12580-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>OmegaScientific</td>
			<td>DM25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Z0325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon membrane (Hybond&#8482;-N+ )</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>RPN303B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020108926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0899-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>VVR</td>
			<td>39450-01-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8210</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice

В геноме млекопитающих были выявлены множественные модификации ДНК. Из них интенсивно изучены 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин-опосредованные эпигенетические механизмы. 5-гидроксиметилцитозин отображает динамические особенности во время эмбрионального и послеродового развития мозга, играет регулятивную функцию в экспрессии генов и участвует в множественных неврологических расстройствах. Здесь мы описываем подробные методы, включая иммунофлуоресцентное окрашивание и днк-пятна для обнаружения 5-гидроксиметилцитозина в культивированных клетках и тканях мозга мыши.

Чтобы выявить распределение 5-хмВ в гиппокампе взрослых мышей, мы выполнили иммунофлуоресценцию с антителами против нейрональных клеток (NeuN) и 5-hmC. В гиппокампе, 5-hmC совместно локализованы хорошо с нейрональной клеточной маркерной нейН(Рисунок 1A-H), предлагая об?...

Watch this Scientific Journal Video about The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice at JoVE.com

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Здесь мы представляем протокол для обнаружения 5-гидроксиметилцитозина в клетках и тканях мозга, используя иммунофлуоресцентное окрашивание и методы точечной пятна ДНК.

Обнаружение 5-гидроксиметилцитозин в нейронных стволовых клетках и мозгах мышей

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Здесь мы представляем протокол для обнаружения 5-гидроксиметилцитозина в клетках и тканях мозга с использованием иммунофторесценции, нового метода и точечной помарки ДНК. 5-гидроксиметилцитозин, т.е. 5hmC, смягченная эпигенетическая модификация, играет важную функцию в регулировании экспрессии генов и участвует в многочисленных неврологических расстройствах.На самом деле, наши методы могут быть использованы для обнаружения 5hmC в нескольких клетках и тканях. Это удобно и может быть выполнено с общим оборудованием в лаборатории. Начните с позиционирования мыши лицом вверх на пластиковой доске и фиксации каждой конечности с липкой лентой.Используйте хирургические ножницы, чтобы прорезать кожу и мышцы, и открыть грудную полость. Выставить сердце и отрезать небольшую часть правого атриума с мелкими хирургическими ножницами. Используя 10-миллилитровый одноразовый, стерилизованный шприц, пронизывает мышь из левого желудочка холодным PBS.Затем, perfuse мыши с 4%PFA, пока она не жесткая. Затем откройте череп костными мипсами и удалите мозг. Поместите мозг в 15-миллилитровую центрифугу, наполненную пятью миллилитровами 4%PFA, и храните ее при четырех градусах Цельсия.Через 24 часа перенесите мозг в 30%-ный раствор сахарозы и оставьте его при четырех градусах Цельсия для полного обезвоживания. Перед секцией, imbed мозга в оптимальной резки температурного соединения и остыть до минус 20 градусов по Цельсию, по крайней мере один час. Образцы мозга секции толщиной от 20 до 40 микрометров с использованием микротома криостата.Соберите разделы в PBS и хранить при четырех градусах по Цельсию. Возьмите секции мозга интерес и положить их в 24-хорошо пластины с PBS. Вымойте секции с PBS на шейкере в течение 10 минут.Удалить PBS и лечить с разогретой однояролярной соляной кислотой при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Гидрохлорная кислота коррозионная и, пожалуйста, подготовить его в химическом холде. Затем, мыть образцы три раза с PBS в течение пяти минут и блокировать их с PBS, содержащий 3%нормальной сыворотки козы и 0,1%Triton X-100.Оставьте образцы на шейкере при комнатной температуре на один час. Добавить конкретные первичные антитела к разделам и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию на шейкере. На следующий день, взять образцы и оставить их при комнатной температуре в течение одного часа.Вымойте образцы три раза с PBS и добавить вторичные антитела. Обложка пластины с алюминием и оставить его при комнатной температуре в течение одного часа во время встряхивания. После инкубации, мыть образцы три раза с PBS и смонтировать их на слайды.Добавьте от 100 до 150 микролитров антиутухающей монтажной среды, накройте стеклом премиум-крышки и запечатайте лаком для ногтей. Изображение секций мозга с помощью обычного или конфокального микроскопа. Чтобы изолировать геномную ДНК, начните с вскрытия тканей гиппокампа, коры головного мозга и мозжечка на охлаждено льдом.Добавьте один миллилитр буфера лиза ДНК и измельчите ткани. Перенесите образец в чистую микроцентрифугную трубку и добавьте 250 микрограммов протеиназы-K на каждые 600 микролитров буфера лиза. Затем добавьте около 50 микрограммов RNase A на образец и инкубировать в течение по крайней мере 12 часов при 37 градусах по Цельсию.После инкубации добавьте равное количество фенола хлороформного изомильного спирта и тщательно перемешайте. Центрифугать смесь в соответствии с рукописными указаниями и перенести супернатант в новую трубку. Добавьте 600 микролитров хлороформа в супернатант, тщательно перемешайте и центрифугу в соответствии с рукописными указаниями.Перенесите супернатант в новую трубку и добавьте 500 микролитров изопропанола. Смешайте тщательно и центрифуги снова осаждать ДНК. После центрифугации отбросьте супернатант и вымойте гранулы ДНК 70%этанолом в соответствии с рукописными указаниями.Воздух полностью высушит гранулы ДНК, а затем растворит их в буфере Tris-HCl. Перед началом подготовь необходимые растворы и образец смеси в соответствии с рукописными указаниями. Денатуратурный образец ДНК, нагревая его до 100 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем, поместите его на лед.Вырезать соответствующий размер нейлоновой мембраны и промыть его 6X SSC. Поместите мембрану на точечный аппарат и соедините вакуумный насос. Найди шесть микролитровых точек на мембрану и гибридизуйте в течение 30 минут при 80 градусах Цельсия.Затем на один час заблокините мембрану образца обезжиреваемым молоком и солевым раствором Tris-buffered, или TBS. Добавить поликлонального кролика анти-5-гидроксимилцитозин антитела к мембране и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующий день оставьте пробную мембрану при комнатной температуре на один час, затем трижды промыте мембрану TBS.Инкубировать мембрану с анти-кролика вторичного антитела в течение 30 минут, а затем, мыть три раза с TBS. Визуализация сигналов хемилюминесценции и количественно их интенсивности. Этот протокол может быть использован для визуализации 5-гидроксиметилцитозин, или 5hmC, в гиппокампе взрослых мышей.Иммунофторесценция с антителами против нейронных клеток, 5hmC показывает, что есть обогащение 5hmC в нейронах. Динамика 5hmC во время развития нейронов может быть определена с точкой пятно анализ образцов ДНК изолированы от распространения и дифференцированных взрослых нервных стволовых клеток. Глобальные уровни 5hmC значительно увеличиваются во время дифференциации и уровень 5hmC в нейронах выше, чем в нервных стволовых клетках.Ключевым шагом этого метода является убедиться, что полная денатурация образцов ДНК.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Выделение и расширение взрослой мыши нервные стволовые клетки Использование Neurosphere Пробирной

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

Высокая чувствительность 5-hydroxymethylcytosine Обнаружение в Balb / C ткани мозга

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Хирургическое трансплантации Мышь нейронных стволовых клеток в спинной мозг мышей, инфицированных Нейротропные вируса гепатита мышь

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Обнаружение микрорегиональном Гипоксия в мышь коры головного мозга на два фотона изображений эндогенной флуоресценции NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Один мышь, двух культур: Выделение и культивирование взрослых нервных стволовых клеток из двух Нейрогенные зон отдельных мышей

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Моделирование Астроцитома Патогенез<em&gt; In Vitro</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; Использование кортикальной астроциты или нервные стволовые клетки из условного, генной инженерии мышей

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Перечень нервных стволовых клеток, с помощью клоновых Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Выделение и культуры взрослых нервные стволовые клетки от мыши зоны расположенный под мозолистым телом

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...