Name: the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice at JoVE.com

XL stöddes delvis av den nationella nyckeln R & D program i Kina (2017YFE0196600), och National Natural Science Foundation i Kina (Grant nos. 31771395, 31571518). Q.S. stöddes av Kinas nationella centrala forsknings-och utvecklingsprogram (2017YFC1001703) och det centrala forsknings-och utvecklingsprogrammet i Zhejiang-provinsen (2017C03009). W.X. stöddes av Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (LY18H020002) och Science Technology-avdelningen i Zhejiang-provinsen (2017C37057).

Alla djurförsök har godkänts av den Djuretiska kommittén vid Zhejiang-universitetet.
1. kulturen hos vuxna neurala stamceller och nervceller
<ol><li>Isolera vuxna neurala stamceller från framhjärnan hos en vuxen (8-10 vecka gammal) C57/BL6 manlig mus som beskrivs tidigare31,32.</li>
	<li>Kultur vuxna neurala stamceller i DMEM/F-12 medium innehållande 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 tillägg, 1% antibiotika-antimykotisk, o...

<ol>
	<li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease.">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li><li>Yao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurogenesis.">Epigenetic mechanisms in neurogenesis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).</li><li>Day, J. J., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+memory+formation.">DNA methylation and memory formation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).</li><li>Wu, X. J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET-mediated+active+DNA+demethylation:+mechanism,+function+and+beyond.">TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).</li><li>Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine-Mediated+DNA+Demethylation+in+Stem+Cells+and+Development.">5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development.</a> Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).</li><li>Li, S., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+regulatory+landscape+of+RNA+modifications.">The pivotal regulatory landscape of RNA modifications.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).</li><li>Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+field+of+epigenetics+in+neurodegeneration+and+neuroprotection.">The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-Methylcytosine+to+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mammalian+DNA+by+MLL+Partner+TET1.">Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+modifies+the+DNA+methylation+landscape+in+the+adult+brain.">Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt1+and+Dnmt3a+maintain+DNA+methylation+and+regulate+synaptic+function+in+adult+forebrain+neurons.">Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Geneticset. , 245-254 (2003).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Shu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+alteration+of+5-hydroxymenthylcytosine+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> BMC Genomics. 17, (2016).</li><li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs.">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li><li>Bernstein, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylation-associated+epigenetic+modifiers+of+Alzheimer's+disease+modulate+Tau-induced+neurotoxicity.">5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).</li><li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease.">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair.">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li><li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+DNA+methylation:+mechanisms,+genomics,+and+biological+functions.">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905 (2013).</li><li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos.">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194 (2011).</li><li>Pastor, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+hydroxymethylation+changes+are+associated+with+neurodevelopmental+genes+in+the+developing+human+cerebellum.">Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum.</a> Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).</li><li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency.">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, 15903 (2017).</li><li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation.">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).</li><li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis.">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem/progenitor+cells.">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

Epigenetiska modifikationer spelar viktiga roller under hjärnans utveckling, mognad och funktion. Som en stabil markör för DNA-modifiering, dynamisk 5-hmC svarar på beteendemässig anpassning, neuronala aktivitet, och är positivt korrelerad med genuttryck; Sålunda, det är involverat i hjärnans normala funktion och neurologiska störning4. För att utforska dess funktion i celler och vävnader, är det nödvändigt att upptäcka förekomsten av 5-hmC och jämföra nivån före och efter beh...

Epigenetiska modifikationer, inklusive DNA-modifiering, histonmodifiering och RNA-modifiering, har visat sig spela viktiga funktioner i olika biologiska processer och sjukdomar1,2,3, 4 , ,5 , 6 , 7. under lång tid har DNA-metylering (dvs. 5-metylcytosin (5-MC)) visats som en mycket stabil epigenetisk markör och kan inte modifieras ytterligare i genomet. Nyligen, det har visat sig att 5-MC kan oxideras till 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) av tet (tio-eleven translokationer) familj proteiner inklusive TET1, TET2, och TET38,9. Ytterligare studier visar att 5-HMC kan fungera som en stabil markör och spela biologiska roller genom att reglera genuttryck4,10,11,12.
De nuvarande bevisen tyder på att 5-HMC är mycket berikat i neuronala vävnader/celler i förhållande till andra typer av vävnader hos däggdjur, och uppvisar dynamiska egenskaper under neuronala utveckling13,14. I neuronala systemet, 5-hmC medierade epigenetiska modifieringar spelar en viktig roll i regleringen av neurala stamceller, neuronala aktivitet, inlärning och minne, och är involverad i flera neurologiska sjukdomar inklusive Rett syndrom, autism, Alzheimers sjukdom, Huntingtons sjukdom, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Det finns flera metoder för att upptäcka 5-HMC i celler och vävnader14,21,22,23,24. Här beskriver vi två metoder för att upptäcka förekomsten av 5-hmC och kvantifiera den globala nivån av 5-hmC: färgning av immunofluorescensteknik och DNA dot-blot. Dessa två metoder är bekväma och känsliga, och har framgångsrikt använts i tidigare studier25,26,27,28,29,30. De viktigaste stegen i dessa två metoder är DNA-denaturering. För immunofluorescenfärgning av 5-hmC krävs förbehandling av prover med 1 M HCl. För 5-hmC dot-blot utförs DNA-denaturering med NaOH-lösning. Dessa två metoder tillsammans med nästa generations sekvensering är mycket användbara verktyg för att undersöka funktionen av 5-hmC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop software</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-5-hydroxymethylcytosine</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12580-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>OmegaScientific</td>
			<td>DM25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Z0325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon membrane (Hybond&#8482;-N+ )</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>RPN303B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14020108926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0899-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>VVR</td>
			<td>39450-01-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8210</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the detection of 5-hydroxymethylcytosine in neural stem cells and brains of mice

Flera DNA-modifieringar har identifierats i däggdjurs arvsmassan. Av detta har 5-metylcytosin och 5-hydroximetylcytosinmedierade epigenetiska mekanismer studerats intensivt. 5-hydroximetylcytosin visar dynamiska egenskaper under embryonal och postnatal utveckling av hjärnan, spelar en reglerande funktion i genuttryck, och är involverad i flera neurologiska sjukdomar. Här beskriver vi de detaljerade metoder inklusive immunofluorescensteknik färgning och DNA dot-blot att upptäcka 5-hydroxymetylcytosin i odlade celler och hjärnan vävnader av mus.

För att avslöja distributionen av 5-hmC i hippocampus vuxna möss, utförde vi immunofluorescens med antikroppar mot neuronala celler (NeuN) och 5-hmC. I hippocampus, 5-hmC Co-lokaliserade väl med neuronala cell markör NeuN (figur 1a-H), tyder på en anrikning av 5-HMC i nervceller.
För att bestämma dynamiken i 5-hmC under neuronala utveckling, en dot-blot utfördes först med DNA-prover isolerade från prolifererande och differentierade vux...

Watch this Scientific Journal Video about The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice at JoVE.com

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Här presenterar vi ett protokoll för att detektera 5-hydroximetylcytosin i celler och hjärnvävnader, utnyttjar immunofluorescensfärgning och DNA-punktblot-metoder.

Detektion av 5-Hydroximetylcytosin i neurala stamceller och hjärnor av möss

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka 5-hydroxymetylcytosin i celler och hjärnan vävnader med hjälp av immunofluorescens, den nya metoden och DNA dot-blot. 5-hydroxymethylcytosin, dvs 5hmC, mildras epigenetiska modifiering, spelar viktig funktion i regleringen genuttryck och involverade i flera neurologiska sjukdomar.Egentligen kan våra metoder användas för att upptäcka 5hmC i flera celler och vävnaderna. Det är bekvämt och kan utföras med vanliga utrustningar i labbet. Börja med att placera musen uppåt på en plastbräda och fixering av varje lem med tejp.Använd kirurgisk sax för att skära igenom huden och muskeln, och öppna brösthålan. Exponera hjärtat och skär av en liten del av höger förmak med fin kirurgisk sax. Med hjälp av en 10-milliliter disponibel, steriliserad spruta, genomsyra musen från vänster kammare med kalla PBS.Sedan, granska musen med 4%PFA tills den är stel. Öppna sedan skallen med bentens och ta bort hjärnan. Placera hjärnan i en 15-milliliter centrifugering röret fyllt med fem milliliter av 4%PFA och förvara den på fyra grader Celsius.Efter 24 timmar, överföra hjärnan till en 30%sackaros lösning och lämna den på fyra grader Celsius för fullständig uttorkning. Före snittning, imbed hjärnan i optimal skärtemperatur förening och svalna till minus 20 grader Celsius i minst en timme. Sektion hjärnprover vid en tjocklek av 20 till 40 mikrometer med hjälp av en kryostat mikrotom.Samla sektioner i PBS och förvara vid fyra grader Celsius. Plocka upp hjärnan delar av intresse och sätta dem i en 24-brunns platta med PBS. Tvätta sektioner med PBS på en skakre i 10 minuter.Ta bort PBS och behandla med förvärmd en-molar saltsyra vid 37 grader Celsius i 30 minuter. Saltsyra är frätande och ber vi dig att förbereda den i kemikaliens stadga. Sedan, tvätta proverna tre gånger med PBS i fem minuter och blockera dem med PBS som innehåller 3%normal get serum och 0,1%Triton X-100.Låt proverna vara kvar på en skakre i rumstemperatur i en timme. Lägg till specifika primära antikroppar till sektionerna och inkubera över natten vid fyra grader Celsius på en shaker. Nästa dag, ta ut proverna och lämna dem i rumstemperatur i en timme.Tvätta proverna tre gånger med PBS och tillsätt sekundära antikroppar. Täck plattan med aluminium och låt den vara i rumstemperatur i en timme medan du skakar. Efter inkubationen, tvätta proverna tre gånger med PBS och montera dem på glid.Tillsätt 100 till 150 mikroliter av anti-fade monteringsmedium, täck med ett premiumöverdrag glas, och täta med nagellack. Avbilda hjärnsektionerna med ett regelbundet eller konfokalmikroskop. För att isolera genomisk DNA, börja med att dissekera hippocampus, cortex och lillhjärnan vävnader på en iskyld maträtt.Tillsätt en milliliter DNA-lysbuffert och slipa vävnaderna. Överför provet till ett rent mikrocentrifugrör och tillsätt 250 mikrogram proteinas-K för varje 600 mikroliter av lysbuffert. Tillsätt sedan ca 50 mikrogram RNase A per prov och inkubera i minst 12 timmar vid 37 grader Celsius.Efter inkubationen, tillsätt en lika stor volym av fenol kloroform isoamylalkohol och blanda noggrant. Centrifugera blandningen enligt manuskriptriktningar och överför supernatanten till ett nytt rör. Tillsätt 600 mikroliter av kloroform till supernatanten, blanda noggrant, och centrifug enligt manuskriptriktningar.Överför supernatanten till ett nytt rör och tillsätt 500 mikroliter isopropanol. Blanda noggrant och centrifug igen för att fälla ut DNA: t. Efter centrifugeringen kasserar du supernatanten, och tvättar DNA-pelleten med 70%etanol enligt manuskriptriktningar.Lufttorka DNA-pelleten helt och sedan, lös upp den i Tris-HCl buffert. Före start, förbereda de erforderliga lösningarna och provblandningen enligt manuskriptriktningar. Denature DNA-provet genom att värma upp det till 100 grader Celsius i 10 minuter och sedan, placera den på is.Skär lämplig storlek på ett nylonmembran och skölj det med 6X SSC. Placera membranet på en punkt-blot-apparat och anslut vakuumpumpen. Spot sex-microliter prickar på membranet och hybridisera i 30 minuter vid 80 grader Celsius.Sedan, blockera provet membranet med fettfri mjölk och Tris-buffrad saltlösning, eller TBS, i en timme. Tillsätt polyklonala kanin anti-5-hydroxymetylcytosin antikropp till membranet och inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Nästa dag, lämna provmembranet i rumstemperatur i en timme, tvätta sedan membranet tre gånger med TBS.Inkubera membranet med den sekundära antikroppen antiinbar i 30 minuter och sedan, tvätta tre gånger med TBS. Visualisera signalerna om chemiluminescens och kvantifiera deras intensitet. Detta protokoll kan användas för att visualisera 5-hydroxymetylcytosin, eller 5hmC, i hippocampus av vuxna möss.Immunofluorescens med antikroppar mot neuronala celler, 5hmC avslöjar att det finns en anrikning av 5hmC i nervceller. Dynamiken i 5hmC under neuronal utveckling kan bestämmas med en dot-blot analys av DNA-prover isolerade från proliferering och differentierade vuxna neurala stamceller. Globala nivåer av 5hmC ökar signifikant under differentiering och nivån på 5hmC i nervceller är högre än i neurala stamceller.Det viktigaste steget i denna metod är att se till att fullständig denaturering av DNA-prover.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering och utvidgning av den vuxna Mouse neurala stamceller Använda Neurosphere analys

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

Hög känslighet 5-hydroxymethylcytosine Påvisande i BALB / C hjärnvävnad

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Kirurgisk Transplantation av Mouse neurala stamceller i ryggmärgen av Möss som infekterats med neurotrop mus hepatitvirus

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Detektion av Microregional hypoxi i mus Cerebral Cortex med två-foton Imaging av endogen NADH fluorescens

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, två kulturer: isolering och odling av vuxna neurala stamceller från de två neurogen zoner Individuell möss

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder fria Härledning av neurallisten progenitorceller från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modellering Astrocytoma Pathogenesis<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Använda Kortikal Astrocyter eller neurala stamceller från Villkorlig, Genmanipulerade möss

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Räkning av neurala stamceller Använda Klon Analyser

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering och kultur av vuxna neurala stamceller från mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...