Name: core/shell printing scaffolds for tissue engineering of tubular structures
Uploaded: 2019-09-27T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende den finansielle støtte til dette projekt modtaget fra det slovenske forskningsagentur (tilskuds numre: P3-0036 og I0-0029) og ministeriet for videnskab, uddannelse og sport (tilskudsnummer: 5442-1/2018/59).

1. fremstilling af silicagelrogeler og Cross-Linking løsninger
<ol><li>Kortvarigt, ved kraftigt at blande, opløse ALG og CMC pulvere i ultra-rent vand for at opnå en total 3 WT% ALG og 3 WT% CMC løsning. Bemærk: i dette arbejde anvendes 5 mL sprøjter til trykning; således justeres den endelige mængde materiale til denne mængde. For andre ekstruderingpatroner og trykte prøvestørrelser bør mængden af tilberedt materiale dog skaleres i overensstemmelse hermed.</li>
	<li>Tilsæt 1,5 WT% cellulose nanofibre til ALG-CMC blandingen for yderligere mekanisk forstærkning for at nå den ønskede viskositet, egnet til udskrivning.</li>
	<li>Brug en overliggende mixer til at omryste hydrogel suspensionen indtil den er homogen. Bemærk: der bør ikke være nogen fibre eller bobler i hydrogel.</li>
	<li>Der fremstilles 10 mL 100 mM calciumchlorid (CaCl2) opløsning i ultra-rent vand, som anvendes som den primære Cross-Linking løsning til trykning.</li>
	<li>Der forberedes 10 mL 5 vægt% CaCl2 opløsning i ultra-rent vand, som anvendes som en sekundær tværgående løsning i efter behandling af stilladser. Bemærk: generelt, alle hydrogel formuleringer, som er egnede til umiddelbar kemisk tværbinding, giver mulighed for et-trins fabrikation af hule rør og kan bruges med denne type kerne/Shell set-up. De print og Cross-Linking mekanismer skal optimeres i overensstemmelse hermed. Viskositeten af hydrogel vil variere afhængigt af den ønskede sammensætning; Det kan dog justeres med polymer koncentrationer og tilsætning af fortykningsmidler (f. eks. nanofibre). Den ideelle viskositet til 3D-trykning af stabile strukturer er høj nok til, at den ekstruderede glødetråd bevarer sin form og til, at stilladset holder sin egen vægt før tværbinding.</li>
</ol>2. kerne/Shell trykning af perfbrugelige stilladser
<ol><li>Inden udskrivningen steriliseres bioprinteren ved at sprøjte 70% ethanol grundigt og udsætte det for UV-lys i 1 time.</li>
	<li>Tænd bioprinter og køre den kontrollerende software, som kommer i et bundt med 3D-printer.</li>
	<li>Udfør homing-proceduren ved at trykke på ikonet hjem .</li>
	<li>Brug af værktøjslinjens kommandofil | Importer g-kode, Importer den genererede stillads g-kode.</li>
	<li>Hydrogel overføres til en steril 5 mL sprøjte og placeres i en af 3D-printerens ekstrudering. Via luer Lock-Lock og en kort slange, Tilslut den til side luer Lock input af kernen/Shell dysen.</li>
	<li>Cross-Linking-opløsningen (100 mM CaCl2) overføres til en anden steril 5 ml sprøjte med en påsat G27 Blunt-end-nål, og den indsættes i den øverste kanyle holder på kerne-/Shell dysen. Den indvendige nål skal være lidt rager (~ 1 mm) fra den ydre kerne/Shell dyse. Juster justeringen manuelt. Indsæt den anden sprøjte i ekstruderingholderen.</li>
	<li>For at indsætte sprøjterne korrekt i holderne (set-up vist i figur 2), skal du manuelt styre begge ekstruderingmounts ved at klikke på a og B og op og ned pilene.</li>
	<li>Før udskrivningen påbegyndes, ekstruderet hydrogel og Cross-Linking-opløsningen separat for at rydde alle overskydende luftbobler i kerne/Shell dysen og sikre en kontinuerlig hydrogel strøm.</li>
	<li>Ved hjælp af tasterne Z og up og pil ned kan du manuelt justere afstanden mellem dysen og tryk substratet. Det anbefales at bruge en flad, glas-print substrat, som har god vedhæftning. Ekstruderingdysen bør ikke være i kontakt med substratet for at give mulighed for uafbrudt strøm af hydrogel. Den optimale afstand mellem dysen og substrat (laghøjde) er typisk den samme som bredden af den ydre dyse diameter, men den justeres til det anvendte materiale og de individuelle udskrivningsparametre. Juster start udskrivnings højden efter individuelle behov.</li>
	<li>Tryk på afspilnings knappen for at starte udskrivningsprocessen. Bemærk: det anbefales at inkludere trykning af et nederdel (figur 3) omkring stilladset for at sikre, at der er en homogen, hult glødetråd, inden det faktiske stilladset udskrives. For at opnå optimal hydro gel flow med det formål at udskrive optimale stilladser, variere formulerings sammensætning, Cross-Linking opløsning sammensætning og udskrivning parametre (dvs. udskrivningshastighed, ekstrudering tryk, trykning temperatur, afstand mellem substrat og ekstruderingdyse osv.).</li>
	<li>Efter udskrivningen skal du forsigtigt fjerne substratet med det trykte stilladset og hælde den sekundære tværbindende opløsning (5 WT .% CaCl2) over hele stilladset for at sikre kryds koblingen over hele stilladset. Inkuber i 1 min ved stuetemperatur (RT). Bemærk: Sørg for, at hele stilladset er nedsænket i Cross-Linking-løsningen. Dette trin er afgørende for at opnå den ønskede styrke egenskaber af stilladset, men vil variere afhængigt af materiale og Cross-Linking metode anvendes.</li>
	<li>Ved hjælp af en skalpel klippe det overskydende nederdel materiale manuelt.</li>
	<li>Steriliser stilladser under et UV-lys i 30 min. vend forsigtigt stilladset og Gentag steriliseringsprocessen.</li>
	<li>Fjern forsigtigt stilladset fra substratet ved forsigtigt at trække det sidelæns. Hvis stilladset klædes stærkt til underlaget, skal det adskilles ved at indsætte en skarp kant mellem dem.</li>
	<li>Stil stilladset overføres til et farveløs cellekultur medie (DMEM suppleret med 5 WT .% FBS, 100 U/mL penicillin og 1 mg/mL streptomycin), og Inkubér dem ved 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5 WT .% CO2 i mindst 24 timer.</li>
</ol>3. klargøring af endotelceller og levende/døde analyse opløsning
<ol><li>For celledyrkning, forberede den avancerede DMEM cellekulturmedium med tilsat phenol rød og supplere det med 5 WT .% FBS og 2 mM L-glutamin. Tilsæt 100 U/mL penicillin og 1 mg/mL streptomycin.</li>
	<li>Initier den humane navle formede vene endotel celle (HUVEC) og passage dem i overensstemmelse med HUVEC dyrkning protokoller som beskrevet47. Bemærk: det anbefales at kulturen cellerne i cellekultur medier med tilsat phenol rød for simpel visualisering under injektion af cellerne i hvide gennemsigtige stilladser som beskrevet nedenfor.</li>
	<li>Ved celletælling afpipetteres 100 μL af cellerne i cellekultur mediet, og de plettes med 900 μL 0,1 WT .% trypan og et blå opløsning.</li>
	<li>Brug en automatiseret celle tæller eller manuel hemocytometer til at tælle og opnå det anslåede antal celler i suspension.</li>
	<li>For den levende/døde analyse skal der fremstilles en opløsning på 4 mm calcein-am og 2 mm propidium kaliumiodid i steril PBS. Bemærk: den levende/døde opløsning skal tilberedes direkte før udførelse af analysen.</li>
</ol>4. overførsel af celler til stilladser
<ol><li>Fjern stilladser fra cellekultur medier og overfør dem til en tilstrækkeligt stor glaspetri skål.</li>
	<li>Umiddelbart inden injektion af cellerne i stilladser adskilles Huvecerne fra kolberne ved hjælp af behandling med 0,25 WT .% trypsin.<ol>
<li>Kortvarigt, kassér cellekultur medier og Inkuber cellerne med 0,25 WT .% trypsin (~ 2 mL) i 5 min ved 37 °C.</li>
		<li>Efter inkubation tilsættes ~ 3 mL cellekultur medier til de trypsiniserede celler og overfører alle løsrevne celler til et centrifugeglas.</li>
		<li>Cellerne centrifugeres ved 200 x g i 5 min., og supernatanten bortskaffes.</li>
		<li>Resuspendere cellerne i frisk cellekultur medier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tæl cellerne som beskrevet tidligere. Juster den totale celle koncentration efter individuelle behov. I dette arbejde anvendes en startkoncentration på 340.000 celler/mL.</li>
	<li>Resuspension cellerne i en steril sprøjte med en påsat Blunt G27 nål.</li>
	<li>Find et indgangspunkt og begynd forsigtigt at injicere celler ind i stilladser. Cellesuspensionen flyder gennem en gennemsigtig stilladset skal være synlig. Sørg for, at hele stilladset fyldes op med cellesuspension.</li>
	<li>Nedsænk stilladser i cellekultur medier og Inkuber dem ved 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5 WT .% CO2 i op til 10 dage.</li>
	<li>Genfyld cellekultur medierne efter eksperimentelle behov.</li>
</ol>5. levende/dødt assay og celle afbildning
<ol><li>Efter inkubation skylles stilladser med PBS.</li>
	<li>Med en stump nål skal du forsigtigt injicere den tidligere fremstillede levende/døde opløsning (4 mm calcein-am og 2 mm propidium kaliumiodid i PBS) ind i stilladser og inkubere dem i PBS i 30 min ved 37 °c. Sørg for, at opløsningen løber gennem hele stilladset.</li>
	<li>Skyl stilladser med PBS.</li>
	<li>Overfør forsigtigt stilladser til et glas skred.</li>
	<li>Overhold de farvede celler direkte i stilladser under et fluorescens mikroskop. Bemærk: levedygtige celler producerer grøn fluorescens og døde celler udsender rødt fluorescens lys.</li>
</ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

Dyse design Ved hjælp af den udviklede kerne/Shell dyse, integreret i en to-ekstruderet Vitaprint system, hule, tubulære stilladser blev fabrikeret i en enkelt-trins proces. For at opnå en jævn tykkelse af rørvæggen gennem de fleste af de forberedte stilladser skal nålen placeres centralt på aksen af den ydre ekstruderingringring. Standard måler nåle udviser ofte en lille, men signifikant excentricitetoff af aksen. Således var dysen kroppen designet til at holde nålen to steder, en gang i toppen (fastgørelse af navet) og en gang før den endelige kerne/Shell kammer (fastsættelse af kanyle selv), korrigere sin aksiale justering. Præcisionen af den aksiale justering øges med afstanden mellem fikserings punktet. Der er dog en afvejning mellem nåle længde og tilgængelige dyse kammervolumen. For at forbedre funktionaliteten af set-up yderligere kan visse ændringer af dysen implementeres: A) en dyse montering med forbedret stabilitet, B) yderligere dyser til en bredere vifte af nåle kompatibilitet, C) en præcis justeringsmekanisme for nål til dyse positionering, og D) at integrere yderligere indgange og mikrofluidisk enheder til på flue materiale forberedelse.
Hydro gel optimering For at bestemme den optimale ALG: CMC ratio, blev flere materiale iterationer evalueret. Generelt blev kerne/Shell-udskrivning med koncentrationer over 3 WT .% af begge komponenter umuliggjort, fordi det ikke tillod en kontinuerlig hydrogel-strøm eller resulterede i tilstopning af dysen. Specifikt øgede ALG-koncentrationen over 3 WT .% viskositeten for meget og resulterede i tilstopning af dyser, mens lavere ALG-koncentrationer og højere CMC-koncentrationer (> 3 WT .%) aftog tværgående tider og dermed undlod at give tilstrækkelige strukturel støtte til stilladset. Core/Shell udskrivning var muligt med mindre viskøse formuleringer; ekstruderet gel viskositet skal dog være tilstrækkeligt til at opretholde langsigtet form troskab. I sidste ende, en 1:1 ALG: CMC ratio blev vist sig at være den mest egnede valg, som bekræfter en tidligere undersøgelse af maver et al.49. Tilføjelsen af NFC væsentligt forbedret print barhed og strukturel stivhed af kerne/Shell trykte stilladser, men havde ingen signifikant effekt på tværgående egenskaber af materialet.
Brugerdefinerede applikationer, optimeret til specifikke celletyper og eksperimentelle set-ups vil kræve velskrædder syede stilladser materialer, som vil variere i sammensætning og Cross-Linking mekanismer. Den metode, der er beskrevet i dette arbejde, er baseret på en blandet polymeropløsning af alginat-cellulose, som er kryds forbundet ionisk ved hjælp af ca2 + ioner. Alginat er en lineær polymer af blokke af (1, 4)-linkede β-d-mannuronat (M) og α-l-guluronat (G) rester, der kan reversibelt ionisk tværbundet ved anvendelse af ca2 + og andre Divalente kationer såsom SR2+, br2 +, mg 2 +. Ikke desto mindre er den mest udbredte ion for tværbinding af alginat fortsat ca2 + i form af CaCl2. Ca2 + kan også anvendes i form af Caso4 eller CaCO3; men den lave Opløselighed af CaSO4 i forhold til CaCl2 betyder langsommere gelation. CaCO3 giver endnu langsommere gelationstid, hvilket kan resultere i svage og inkonsekvente mekaniske egenskaber.
Længere gelationstid typisk producere en mere homogen konstruktion, dog, visse applikationer, såsom Core/Shell udskrivning kræver hurtige gelering satser50. Mg2 + ioner inducerer også gelation; men deres Cross-Linking effektivitet er omkring 5x-10x lavere, sammenlignet med ca2 +, med Cross-Linking tider på 2-3 h. Desuden er magnesiumioner mere selektive mod guluroniske enheder, og derfor afhænger tvær koblingen mere af den kemiske sammensætning af ALG51. I dette tilfælde er en hurtig gelering sats afgørende for at sikre kontinuerlig hule kanal dannelse, før den hule struktur kan kollapse. CaCl2 giver den hurtigste gelering sats, som er afgørende for direkte aflejring af hule filamenter. 100 mM CaCl2 blev udnyttet, hvilket i tilstrækkelig grad stabiliserede den kontinuerlige dannelse af en hul glødetråd uden at forårsage gel størkning i dysen.
Trykning og efter behandling af stilladser Følgende trin bør overvejes i denne del af processen, herunder 1) sikre, at alle opløsninger og materialer, herunder 3D bioprinter, er korrekt steriliseret inden udskrivning. 2) når hydrogel forberedes, er homogeniteten af materialet afgørende for kontinuerlig udskrivning. Det bør undgås at indføre urenheder eller luftbobler, da de kan tilstoppe dysen og/eller forstyrre ekstrudering. 3) sprøjterne skal være korrekt forbundet til kerne/Shell dysen via luer-Lock mekanismen og korrekt indsat i ekstruders mounts, som det ses i figur 2a, B. 4) før du udskriver en kompleks struktur, anbefales det at pre-Ekstruderer en lille del af gelen og Cross-Linking-opløsningen for at rydde de overskydende luftbobler i kernen/Shell dysen og sikre en kontinuerlig hydrogel flow. Dette kan inkorporeres direkte i g-koden for at forbedre gentagelses evnen. 5) det er nyttigt at tilføje en nederdel omkring stilladset for at sikre udlægning af en homogen hule glødetråd, før trykning af stilladset selv starter.
Derudover, 6) for at forbedre vedhæftningen mellem udskrifts glødetråden og substratet, anbefales det at bruge en flad overflade med god vedhæftning (dvs. en glas rutsjebane eller Petri skål). 7) ekstruderingdysen bør ikke være i direkte kontakt med substratet for at muliggøre uafbrudt strøm af hydrogel. Den indledende afstand vil i høj grad påvirke kvaliteten af print, men tykkelsen af ekstruderet glødetråd er en god tilnærmelse af den oprindelige indstilling. 8) start udskrivnings højden i g-koden skal justeres efter individuelle behov. Når udskrivnings parametrene er optimeret, skal stilladset g-koden importeres til Planet CNC-software, og udskrivningsprocessen startede som beskrevet i protokollen. 9) for at kontrollere og optimere hydrogel flow med det formål at udskrive optimale stilladser, bør både formulerings sammensætning og udskrivningsparametre varieres (dvs. udskrivningshastighed, ekstruderingtryk, udskrivnings temperatur, afstand mellem substrat og ekstruderingdyse, laghøjde, stillads størrelse osv.).
Generelt kræves højere strømningshastigheder for at udskrive formuleringer med højere viskositet. Som nævnt giver alle hydrogel formuleringer, som er egnede til umiddelbar kemisk tværbinding, mulighed for et-trins fabrikation af hule slanger og kan anvendes med den beskrevne kerne/Shell-opsætning. De print og Cross-Linking mekanismer skal optimeres i overensstemmelse hermed. Efter udskrivningen var alle stilladser blevet efterbehandlet ved sekundær tværbinding med 5 WT .% CaCl2 -opløsning, som sikrede fuldstændig tværbinding af ALG-CMC-komponenten og steriliseret fra begge sider under et UV-lys i mindst 30 minutter. Det bør sikres helt at opsluge stilladset med Cross-Linking-opløsningen og inkubere længe nok til at gennemføre tværgående sammenkædningen. Efter behandlingen vil variere afhængigt af den anvendte materiale-og krydsliningsmekanisme, som bør overvejes på forhånd. Efter behandling skal stilladser fjernes forsigtigt fra substratet, overføres til cellekultur medier og inkuberet i en kontrolleret atmosfære i mindst 24 timer før celle såning. Brug af et farveløse medium vil forbedre synligheden af cellesuspensionen under injektion i stilladser.
Levende/dødt assay Den levende/døde opløsning skal tilberedes direkte før udførelse af analysen og holdes i mørke før udførelse af analysen, da den indeholder fluorescens farvestoffer, der er tilbøjelige til at blege. Efter den ønskede inkubationstid skal cellekultur medierne omhyggeligt kasseres omkring stilladser og skylles med PBS. Ideelt bør det samme indgangspunkt anvendes til celle såning efterfulgt af den levende/døde analyse, der injiceres i stilladser.
Resultatenes betydning Både ALG og CMC er allerede blevet brugt til at fremme angiogenese in vitro. Baseret på sine ECM-mimetic funktioner, fysisk Cross-Linking, og biokompatibilitet, har ALG været almindeligt anvendt som en komponent til levering og kontrolleret frigivelse af angiogeniske vækstfaktorer (f. eks bFGF, HGF, VEGF164, og Ang-1 * henholdsvis)52 ,53,54. Desuden er CMC i kombination med gelatine også blevet anvendt til indkapselse af vaskulære endotelceller på grund af dets hurtigt tværgående egenskaber under fysiologiske forhold55. NFC blev tilføjet for yderligere at øge den mekaniske stabilitet og form troskab af stilladser. Det skal understreges, at målet ikke var at forbedre vaskulariseringen, men at demonstrere muligheden for at producere perfbrugbart, hule ALG-CMC stilladser, trykt i kerne/Shell mode, som også letter fastgørelse og spredning af HUVECs. Valget af at bruge en ALG-CMC-blanding var baseret på fund af almindeligt anvendte, lettilgængelige og biokompatible basismaterialer, der kunne muliggøre kerne-/Shell-udskrivning af hule kanaler. Mange andre materialer kan være mere levedygtige muligheder for at øge angiogenesis; men nogle er ikke egnet til kerne/Shell trykning, da de ikke letter hurtig gelation/Cross-Linking, hvilket er afgørende i denne tilgang.

Det ultimative mål for vævsteknik (te) er at fremstille funktionelle væv eller organer in vitro, som kan bruges til at regenerere eller erstatte skadede eller syge dele af den menneskelige krop1,2,3. Aktuel forskning i vævsteknik (TE) er fokuseret på de enkelte aspekter af området (stilladser materialer, fabrikations procedurer, celle kilder osv.) 4,5, samtudvikle enkle in vitro-modeller af væv og organer, der efterligner grundlæggende aspekter af deres in vivo modparter. Sådanne modeller er allerede nyttige for mange applikationer, såsom Drug screening og toksicitetsundersøgelser, især i tilfælde, hvor konventionelle 2D cellekulturer undlader at efterligne den dynamiske respons af de indfødte væv6,7, 8,9. Tredimensionale in vitro-modeller er normalt konstrueret ved at kombinere celler10, fysisk-kemiske signaler11, og biologisk aktive molekyler12,13 på stilladser, som er fremstillet af decellularized væv eller konstrueret de Novo fra biologiske eller biokompatible materialer14,15,16,17,18.
Det er afgørende, at stilladser rekapitulere den komplekse 3D mikroarkitektur og hierarkisk struktur af de indfødte væv til at muliggøre funktionaliteten af de manipulerede væv, repræsentant for in vivo væv19. På trods af de betydelige teknologiske fremskridt i TE, er udvikling af fysiologisk relevante kunstige væv konstruktioner fortsat en udfordring. Tyk væv (> 200 μm i tykkelse) er særligt problematisk, på grund af begrænsninger såsom ilt og næringsstof diffusion20. Der er gjort fremskridt i retning af større vævs konstruktioner; men den påkrævede høje nærhed af celler til blodkar for at transportere ilt og næringsstoffer og fremme fjernelse af affald skal gentages. Vaskularisering af væv (eller alternativt fabrikation af indbyrdes forbundne 3D-vaskulære netværk inden for vævs konstruktioner) spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af cellernes levedygtighed og fremme af funktioner i in vitro-udviklede væv, hvilket er vanskeligere for modeller i længerevarende eksperimenter21,22. Desuden er den nødvendige opløsning, strukturel integritet og samtidig biokompatibilitet endnu ikke opnået23.
Flere TE tilgange er blevet foreslået i et forsøg på at konstruere blodkar-lignende strukturer og lette vaskularisering in vitro. Nogle eksempler omfatter såning endotelceller (også co-kultiveret med andre celler typer såsom fibroblaster), der selv samler til at generere microvaskulære netværk24, brug af vaskulære stamceller og pericytes, der fremmer endotel celle vækst21,25, levering af angiogeniske vækstfaktorer, der inducerer vaskularisering20,26, ved hjælp af celle plade teknologi, der giver mulighed for kontrol over vaskulære lagdeling20, og fabrikation af meget porøse stilladset strukturer, der fremmer angiogenese27. De nævnte tilgange fokuserer på angiogenese induktion, som generelt kræver betydelige mængder af yderligere vækstfaktorer (f. eks. VEGF) og tid til dannelse. Men de største ulemper er deres begrænsede reproducerbarhed og begrænset rumlig kontrol over vaskulære mønster, hvilket sædvanligvis resulterer i en tilfældig vaskulatur fordeling inden for vævs konstruktionen, der ikke nødvendigvis letter perfusion.
Additiv fremstilling (AM, såsom 3D bioprinting) er i stigende grad involveret i fabrikation af 3D-konstruktioner ved hjælp af biologiske eller biokompatible materialer til at skabe stilladser egnet til TE. Flere AM tilgange anvendes og udvikles parallelt (f. eks, ink jet-og microekstrudering-baserede metoder, forskellige typer af litografiske teknikker) til at producere stilladser, der efterligner indfødte væv i deres arkitektur, biokemi, og funktionalitet . De enkelte teknikker udviser visse fordele og ulemper28, hvilket er grunden til forskellige modifikationer, der udforskes (f. eks. mikromønster, induceret angiogenese osv.) for at øge omfanget af, hvor store, komplekse og stabile vaskulære netværk kan fabrikeres22,29,30.
Blandt disse, ekstrudering bioprinting er den mest almindeligt anvendte metode, især på grund af den brede vifte af kompatible materialer (en generelt celle-venlige proces28,31,32) samt ekstraordinær alsidighed i anvendelsesbetingelser (f. eks. indlejret og offer trykning23,33, fabrikation af hule konstruktioner34,35osv.). De vigtigste udfordringer, der optager de nuværende undersøgelser, omfatter overførsel fra 2D til 3D-strukturer, dannelse af et tæt netværk af hule rør med høj rumlig opløsning og generel mekanisk integritet og form troskab under væskestrømmen i cellekulturen betingelser30.
Den mest ligefremme tilgang til perfbrugbart væv er fremstilling af et sammenkoblet netværk af kanaler inden for konstruktionen. Skabelsen af sådanne perfbrugbare kanaler inden for en vævs stilladset forventes at løse mange af de førnævnte problemer, da det straks giver mulighed for næringsstof og ilt diffusion samtidig fjerne affald produkter. Derfor undgås den potentielle dannelse af nekrotiske regioner i konstruktionen36. Sådanne kanaler kan desuden seedet med endotelceller (ECs) og fungere som kunstige blodkar i 3D-vævs modeller37. I den mest elementære forstand, kan et fartøj bestå af en hul kanal, blødt lag af ECs, og stiv shell. For nylig, 3D ekstrudering af to forskellige materialer i en kerne/Shell mode udnytter Co-Axial nåle til ekstrudering har vundet stor interesse38,39,40,41, da det giver mulighed for fabrikation af hule rør.
På samme måde som konventionel microextrusion 3D-udskrivning udføres kerne-/Shell-udskrivning med en koaksial dyse (f. eks. to nåle med forskellige diametre, der er justeret på samme akse på en facon, således at den bredere nål omgår den smallere). Således kan to materialer ekstruderes samtidigt, med en som den centrale glødetråd eller "indre" kerne og et sekund som den "ydre" Shell41. Til dato, Co-Axial bioprinting er blevet udnyttet til at fabrikere strukturer med solid42, Core/Shell43, og hule tråde40,44; men de anvendte materialer er ikke blevet optimeret til både optimal cellelevedygtighed og mekanisk robusthed af de trykte konstruktioner. Som nævnt giver teknikken mulighed for at kombinere biomaterialer med forskellige mekaniske egenskaber, hvor stivere en understøtter den blødere. Endnu vigtigere er det, at hvis stilladset materiale (f. eks. alginat, carboxymethylcellulose) ekstruderes som skallen, mens kernen består af tværbindende middel (f. eks, calciumchlorid) dispenseres fra den indre kapillar derefter skyllet ud efter trykning, er det muligt at fabrikere et kontinuerligt hult rør i et enkelt trin45.
Med dette i tankerne, en enkel og gentagelig en-trins metode blev udviklet til at opbygge veldefinerede og perfektuelt stilladser til ingeniørarbejde af vaskulære strukturer og andre rørformede væv. For at udvikle en omkostningseffektiv teknologi bør fabrikation ideelt set være en enkelt trins proces. Derfor blev en Core/Shell set-up tilpasset og integreret i 3D bioprinter. Det grundlæggende design består af en central dyse lavet af metal for at undgå deformation under injektion, omkring hvilken en anden dyse af en større diameter er placeret. En sådan koaksial dyse opsætning giver mulighed for Co-ekstrudering af de to strømme og umiddelbar tværbinding af den extruderede hydrogel kanal. Dette muliggør direkte fabrikation af flerlags hule filamenter, mens efterfølgende tværgående sammenkobling med højere koncentrationer af calciumchlorid (CaCl2) sikrer mere permanent stabilisering udefra.
Som sådan giver denne metode mulighed for samtidig trykning af stilladser og mikrokanaler, hvor de hule hydrogel filamenter tjener som et stillads til at understøtte den mekaniske integritet af 3D-konstruktioner og samtidig fungere som indbyggede mikrokanaler til at levere næringsstoffer til cellevækst. Denne protokol giver en detaljeret procedure af Core/Shell 3D bioprinting strategi baseret på brug af en skræddersyet koaksial dyse, hvor hydrogel 3D strukturer med indbyggede kanaler er fabrikeret ved at kontrollere tværgående sammenkædning til at producere hule filamenter, som forbliver perfbrugbar under cellekulturen.
Den 3D-udskrivnings opsætning, der anvendes i dette arbejde, er konfigureret som tidligere beskrevet af Banović og Vihar46 og kan opdeles i tre hovedkomponenter: a) en tre-akse CNC mekanisk opsætning med 50 μm positionering nøjagtighed i X, Y, og Z retninger; B) to ekstrudere, tilpasset til engangsbrug, 5 mL luer-Lock sprøjter, med 1,2 μL voxel opløsning; og C) styring af elektronik og software.
For at lette Core/Shell udskrivning, en passende dyse blev udviklet, der kan monteres på en af ekstrudere (primære ekstruder, trykning kernen) og er kompatibel med G27 stump-ende nåle. Det har også luer-Lock kompatibilitet til at forbinde med den anden ekstruder (udskrivning af shell). De første prototyper blev fremstillet ved at indsætte en stump ende G27 nål (indvendig diameter = 210 μm, udvendig diameter = 410 μm) i enten en G21 nål (indvendig diameter = 510 μm, udvendig diameter = 820 μm) eller G20 konisk spids (indvendig diameter = 600 μm), og derefter indsætte en sekundær n på sidelinjen for at forsyne Shell materialet. Men på grund af en let bøjning af nåle akslen, er det ikke muligt at producere en dyse spids med koncentrisk justering af de indre og ydre nåle.
For at løse dette problem, en ny dyse design blev udtænkt, der opfyldte følgende kriterier: 1) det kan fremstilles ved hjælp af en 3-akse CNC mølle, 2) det kan være fremstillet af forskellige materialer (højtydende plast, såsom PEEK eller metaller), 3) det har luer-Lock kompatibilitet for påføring af shell materiale, og 4) er kompatibel for en G27 stump-ende nål og holder den på plads på to positioner for at justere spidsen med den centrale akse. En skematisk af dyse prototypen er vist i figur 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alginic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>180947</td>
			<td>powder; Mw ~80,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTC HUV-EC-C [HUVEC]</td>
			<td>LGC Standards (UK)</td>
			<td>ATCC-CRL-1730</td>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 40 inverted optical microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>three contrastingtechniques in one objective &#8211; e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>C1016</td>
			<td>anhydrou; granular; &#8804;7.0 mm; &#8805;93.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v))</td>
			<td>The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA)</td>
			<td></td>
			<td>nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA Purelab water purification system</td>
			<td>Veolia Water Technologies (UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Advanced Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (Advance DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>12491015</td>
			<td>high glucose; no glutamine; phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>21063029</td>
			<td>high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>10270106</td>
			<td>FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Sterican needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG (Germany)</td>
			<td>9180117</td>
			<td>0.40 x 25mm, 27G x 1&#39;&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>G3126</td>
			<td>ReagentPlus&#174;, &#8805;99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Cell Double Staining Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>4511</td>
			<td>contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask cell culture flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>156367</td>
			<td>Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG (Germany)</td>
			<td>4617053V</td>
			<td>5 mL Luer Lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>P3032</td>
			<td>powder; BioReagent; suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>P4417</td>
			<td>tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>419338</td>
			<td>powder; average Mw ~700,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>powder; BioReagent; suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td>Veolia Water Technologies (UK)</td>
			<td></td>
			<td>18.2 m&#8486; cm at 25&#8304;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitaPrint 3D bio-printer</td>
			<td>IRNAS (Slovenia)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

core/shell printing scaffolds for tissue engineering of tubular structures

Tredimensionel (3D) trykning af kerne/Shell filamenter giver mulighed for direkte fabrikation af kanal strukturer med en stabil shell, der er tværbundet på grænsefladen med en flydende kerne. Sidstnævnte er fjernet efter trykning, efterlader et hult rør. Integrering af en additiv fremstillingsteknik (som den, der er beskrevet her med skræddersyede [bio] blæk, som strukturelt og biokemisk efterligner den indfødte ekstracellulære matrix [ECM]) er et vigtigt skridt i retning af avanceret vævsteknik. Men præcis fabrikation af veldefinerede strukturer kræver skræddersyede fabrikations strategier optimeret til det materiale, der er i brug. Derfor er det fornuftigt at begynde med en opsætning, der er tilpasselig, enkel at bruge, og kompatibel med et bredt spektrum af materialer og applikationer. Dette arbejde præsenterer en nem at fremstille kerne/Shell dyse med luer-kompatibilitet til at udforske kerne/Shell trykning af træpæle strukturer, testet med en veldefineret, alginat-baseret stillads materiale formulering.

Formålet med dette arbejde var at udvikle en kerne/Shell dyse, som er nem at fremstille med luer-kompatibilitet til kerne-/Shell-trykning af træpæle konstruktioner. Desuden blev der beskrevet en enkel og gentagelig One-Step-udskrivningsprotokol, som er enkel at ændre og rummer en bred vifte af materialer og forskellige kemiske tværgående mekanismer til at bygge veldefinerede og perfekerbare stilladser til engineering af vaskulære og andre rørformede væv strukturer.
Kerne/Shell dyse Dysen består af en G27 stump-ende nål (til trykning af den indre aksial glødetråd) og dyselegemet, som holder nålen på plads og skaber en ydre dyse til Shell glødetråden med en tilslutningsport til materialetilførsel. En skematisk er vist i figur 1. To 5 mL sprøjter, som er placeret i de enkelte ekstrudere og levere kernen og Shell materialer. Slange forbinder dysekroppen med sprøjten og giver Shell materialet.
Den komplette samling af kernen/Shell dysen og sprøjtens opsætning er vist i figur 2. Den første funktionelle prototype af dysekroppen blev fremstillet ved CNC fræsning en blok af polyoxymethylen (POM). Kompatibilitet og forsegling mellem elementet, en G27 nål og slanger blev testet ved at installere i Vitaprint. Der blev ikke observeret lækage af Shell materialet i dysen, luer-Lock-stikket eller mellem krop og nål. Dyselegemet passer tæt sammen med nåle navet (luer-stikket), hvilket sikrer synkroniseret bevægelse af hele dysen med ekstruderen.
Stilladsbygning Den mest ligefremme tilgang til opdigte stilladser er ved at deponere materialer lag for lag, hvor trykning retning ændres hvert på hinanden følgende lag, typisk i en vinkel på 90 °. På grund af de Visco-elastiske og hygroskopiske egenskaber af hydrogels, bevarer form troskab af de trykte strukturer stadig udfordrende. Hovedformålet med denne protokol sektion er 3D-udskrivning af perfbrugelige kerne/Shell stilladser ved hjælp af to polymerer, som tidligere har vist lovende resultater for stilladser bygning (ALG og CMC) med tilsætning af cellulose nanofibre (NFC) for øget mekanisk stabilitet. Både ALG og CMC er negativt ladet, vandopløselige lineære copolymerer48 og begge indeholder carboxylgrupper, som kan være kryds forbundet med tilsætning af divalent kationer. Ca2 + partikler danner ioniske obligationer med to funktionelle grupper samtidig, danner forbindelser mellem polymer kæder, øge gel stivhed.
Trykning af perfbrugelige stilladser Formålet med denne proces er at 3D-print simple træpæle stilladset strukturer, som spænder over flere lag og bevarer deres form troskab samt perfusability indtil de bliver fuldt Cross-linked. Dette kræver selv coekstrudering af kerne og Shell uden crossover eller tilbagetrækning bevægelser, som kan afbryde strømmen. Derfor er typiske CAD-modellerings-og skære metoder mindre velegnede. I dette arbejde bruges en manuelt designet g-kode, og en Python-baseret g-kode generator er udviklet til hurtig g-kode forberedelse.
Stilladser blev struktureret i en træpæle gitter form og bygget på en flad glasoverflade. Fabrikation blev udført lag-for-lag, deponering af passage linjer af hvert efterfølgende lag i en vinkel 90 ° til den foregående. Desuden var hvert efterfølgende lag 2% smallere i X-og Y-retningen, hvilket sikrede kontinuerlig filament understøttelse af tidligere lag. Afstanden mellem filamenter (makropore størrelse) kan præcist udformes i g-koden ved at tage hensyn til den udvendige diameter af den ekstruderede glødetråd (0,8 mm) og afstanden mellem gitterlinjer (3 mm).
Stilladser var forpligtet til at opfylde centrale inklusionskriterier til yderligere overvejelse. For det første var stilladser med mindst 4 lag i højden forpligtet til at bevare deres strukturelle integritet og geometri (f. eks. makropore størrelse) under trykning for at være berettiget til yderligere udvikling. For det andet var stilladser nødvendige for at forblive perfbrugelige (stabile mikrokanaler), selv efter de blev inkuberet i 7 dage i cellekultur medier ved 37 °C. På passende tids intervaller (1, 2, 5 og 7 dage) blev der taget stilladser ud af kultur medierne og testet for at se, om de stadig var perfekgenbrugelige. I figur 4aviser tværsnit af en frisk trykt og post-forarbejdet stillads en klart synlig hule kanal inde i glødetråden. I figur 4ber det klart, at selv efter 72 h inkubation i cellekultur medier ved 37 °c bevarer glødetråden den hule struktur gennem hele stilladset længde.
Flere formuleringer var printbare, forblev strukturelt stabile, bevarede den trykte geometri og forblev perfektionelige; der blev dog valgt en enkelt til yderligere prøvning (dvs. 3 WT .% ALG + 3 WT .% CMC + 1,5 WT .% NFC), som tillod udskrivning af perfbrugelige stilladser med op til 10 lag. Udskrivningsprocessen med den brugerdefinerede dyse vises i figur 5a. Core/Shell udskrivning var muligt med mindre viskøse formuleringer; geler med højere koncentrationer tillod dog ikke kontinuerlig strømning gennem dysen. For primær tværbinding (kernemateriale, leveret under udskrivning) 100 mM CaCl2 blev udnyttet, som tilstrækkeligt stabiliseret den kontinuerlige dannelse af en hul glødetråd, uden at forårsage gel størkning i dysen. Efter udskrivningen blev stilladser gennemblødt i en 5 WT .% CaCl2 løsning til fuldstændig Cross-link hydrogel for langsigtet form troskab. En færdig stilladset prøve er afbilledet i figur 5b. Under optimering, proces af formuleringen en kunstig farvestof blev brugt i kernen løsning, for at muliggøre visuel evaluering og undersøge kvaliteten af ekstruderet glødetråd. Farvestoffet blev ikke brugt til fremstilling af de endelige stilladser, som var forberedt til celle såning og dyrkning.
Levende/dødt assay Efter inkubation blev der anvendt en levende/død analyse til at visualisere ECs og skelne mellem de levende (grønne) og de døde (røde) celler inden for den inkuberet stillads. Dette tjente to hovedformål: A) at afgøre, om stilladser giver et biokompatibelt miljø til at fremme vækst og adhæsion uden at udstille skadelige virkninger på cellen, og B) at visualisere den strukturelle integritet af rørformede strukturer og deres interne kanalsystem mere detaljeret.
Resultaterne af den levende/døde analyse er vist i figur 6. I nærværelse af intracellulære esteraser, plasma membranen gennemtrængelig calcein-am omdannes til calcein, udsender grønne fluorescens lys i levende celler. På den anden side visualiseres apoptotiske celler af membran uigennemtrængelige propidium iodide, som fluorescerer i rødt, når de er intercaleret i DNA dobbelt helix. Levende/døde billeder og lyse-feltbilleder af stilladser blev kombineret for at hjælpe med at visualisere cellerne inde i de hule kanaler. Farvningsopløsningen blev injiceret, og analysen optrådte direkte i 3D-trykte stilladser efter stilladser-celleinkubation for 48 h.
Det skal bemærkes, at en relativ lille såning tæthed af ECs blev anvendt (340.000 celler/mL), da denne undersøgelse tjente kun som en proof-of-koncept for kerne/Shell trykning af perfbrugelige stilladser. Den mest betydningsfulde konklusion af den levende/døde analyse er, at selv efter 48 h, ingen døde celler (rød) blev observeret, bevise, at hverken stilladset materiale selv, eller dets nedbrydningsprodukter udstillet toksiske virkninger. Endvidere, ECs faktisk overholde og forblive fastgjort inde i stilladser og syntes at danne jævnt fordelt agglomerater når dyrket inde i kanalerne. Dette antyder, at den beskrevne fabrikationsmetode og stillads formulering udgør en passende ramme for bygning in vivo, relevante, rørformede vævs morfologier. Udover efterligne celle-ECM interaktioner og stram celle-celle kommunikation i alle tre rumlige dimensioner, komplekse vævsteknik kræver også konstant celle eksponering for frisk medium til at opretholde deres levedygtighed. Dette kan til gengæld opnås ved en tæt kanalnetværk under kontinuerlig perfusion, som berettiger yderligere undersøgelse i det fremtidige arbejde, og vil kræve optimering af materiale og vækstparametre for at lette langsigtet vævs konstruktion af vasculature.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig1.jpg"> Figur 1: prototype af kerne/Shell dyse. A) det overordnede design og hovedkomponenterne i dysekrops prototypen vises. Dysen er færdig ved at indsætte en stump ende G27 nål gennem toppen. De øverste og nederste nåle holdere immobiliserer og justere nålen med dyseaksen, hvilket sikrer, at spidsen strækker sig fra dysen gennem midten.  For at forbinde dysen med "Shell" materiale ekstruderet fra den sekundære sprøjte, er slanger med en luer-Lock Connector fastgjort til den laterale indgang. Herfra videresendes materialet til dysen gennem en smal kanal. Fabrikation af den nævnte kanal kræver boring i to positioner, producerer huller, der skal begrænses efter fremstilling). (B) vist er et nærbillede af dysen med en indsat G27 nål, der strækker sig ud af dysen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig2.jpg"> Figur 2: afsluttende kerne/Shell-opsætning. (A) vist er den færdige kerne/Shell dyse med korrekt vedlagte sprøjter indeholdende hydrogel (højre), opbygning af "Shell" og Cross-Linking opløsning (venstre) ekstruderet som "kernen". (B) vist er kernen/Shell set-up installeret i Vitaprint systemet med to ekstrudere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig3.jpg"> Figur 3: G-kode for det rørformede stillads. Her vises et skærmbillede af printersoftwaren, specielt stien Preview (a) og RAW g-kode for det første lag (B). G-koden er et sæt instruktioner med mål koordinater i absolutte rumlige retninger (X, Y, Z), samt ekstrudering (A, B) i relative retninger. Kommandoen G bestemmer typen af instruktion, hvorimod G1 repræsenterer lineær bevægelse mod målkoordinaterne, og G92 bestemmer den oprindelige startposition. Desuden bestemmes tilførselshastigheden for følgende kommandoer med instruktion F i mm/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig4.jpg"> Figur 4: tværsnit af et stillads streng med et hult interiør. (A) vist er tværsnit skive af frisk trykt og post-forarbejdet stillads. B) den viste tværsnits skive af stilladset efter at være blevet inkuberet i cellekultur medier for 72 h. Mens dyseformen definerer ekstrudering af et rør med et rundt tværsnit, synes glødetråden at være noget fladt på aflejring. Den interne kanal forbliver dog intakt og bevarer sin form under inkubationen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig5.jpg"> Figur 5: kerne/Shell trykning af stilladser. Her vises fremstilling (A) af et trestrenget hult rørs stilladset og dets endelige form (B). For forbedret visualisering, Cross-Linking løsning i kernen var plettet med en rød farve. Formuleringen udviser tilstrækkelig mekanisk stabilitet til at bevare stilladset stabilitet, selv om tykkere strukturer (op til 10 lag, data ikke vist) er fabrikeret. Den endelige strukturs udvendige dimensioner var ca. 27 mm x 27 mm x 3,5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig6.jpg"> Figur 6: levende/dødt assay udført direkte i stilladser. En suspension af HUVECs blev injiceret i den indvendige stilladset kanal, inkuberet til 48 h, og behandlet med levende/dødt farvestof. Levedygtige HUVECs udsender grønt fluorescens lys, som er repræsenteret i de lyse pletter af billedet. Døde celler udsender grønt fluorescens lys; ingen er dog synlige i det observerede stillads. Fordelingen af cellerne betyder også den form og bevaret perfusion kapaciteter af kanalerne. I mindre omfang, levende/døde assay løsning også plettet stilladser materiale, producerer lys fluorescens under mikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures at JoVE.com

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Præsenteret her er en enkel at bruge, kerne/shell, tredimensionel bioprinting set-up for One-Step fabrikation af hule stilladser, egnet til vævs konstruktion af vaskulære og andre rørformede strukturer.

Core/Shell trykning stilladser til vævs konstruktion af rørformede konstruktioner

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Fremstillingen af rørformede strukturer er en lovende tilgang til vævsteknik af vaskulære netværk, som fortsat er en af de største udfordringer i dyrkning af tykt væv in vitro. Den største fordel ved kernen / shell teknik er den enkle produktion af hule filament stilladser i et enkelt trin, hvilket reducerer fabrikationstiden og potentielt tillader direkte udskrivning med celler. Forberedelse af en hydrogelformulering med de relevante viskoelastiske egenskaber og opretholdelse af en kontinuerlig afbalanceret strøm af kerne-/skalmaterialerne er afgørende for 3D-print af stabile stilladser.Til at begynde, fyldes den sterile 5 ml sprøjte med frisklavet hydrogel. Fyld en anden 5 ml sprøjte, udstyret med en 27 gauge stump-end nål, med frisklavet crosslinking opløsning. Monter kerne-/skaldysen.Sæt en G27 stump-end nål som kernekomponenten og fastgør nålen ved hjælp af skruen. Den indvendige nål skal stikke ca. 1 mm ud fra den ydre kerneskaldyse. Tilslut sprøjten med krydslinkopløsningen til G27-nålen i dysen, og læg sprøjten i en af ekstruderbeslagene på en ethanolsteriliseret 3D-printer.Monter sprøjten med hydrogel i den anden ekstruder og tilslut den til dysen. Brug en Luer-lås til at forbinde et kort rør til siden Luer-indgangen i kerne-/skaldysen. Juster forsigtigt justeringen manuelt, indtil dysen rører overfladen, før dysen trækkes tilbage til en afstand svarende til den ydre dysediameter.Importer den genererede stillads-g-kode, og tryk på Afspil for at starte udskrivningsprocessen. Efter udskrivning fjernes underlaget forsigtigt med det udskrevne stillads, og den sekundære krydslinkingsopløsning hældes over hele stilladset. Stilladset inkuberes i et minut ved stuetemperatur.For at tage stilladset af underlaget skal du forsigtigt trække stilladset sidelæns. Hvis stilladset klæber kraftigt til underlaget, skal du indsætte en skarp kant mellem de to materialer for at adskille dem. Overfør stilladset til en frisk beholder.UV steriliserer begge sider af stilladset i 30 minutter på hver side. Placer derefter stilladset i et farveløst cellekulturmedium og inkuber stilladset ved 37 grader Celsius med 5 % kuldioxid i mindst 24 timer. Den næste dag, høst huvex fra en in-vitro kultur med 0,25% trypsin i fem minutter ved 37 grader Celsius.Når cellerne er taget af, skal du stoppe den enzymatiske reaktion med 3 ml frisk cellekulturmedium og indsamle cellerne ved centrifugering. Pelleten suspenderes igen i frisk kulturmedium indeholdende fenolrød, og cellerne fortyndes til en 3,4 gange 10 til den femte endotelceller pr. milliliterkoncentration. Indbevar cellerne i en steril 5 ml sprøjte udstyret med en 27 gauge nål og find et indgangspunkt i stilladset.Justering af nålen med den lige del af stilladset glødetråd, forsigtigt punktere stilladset i en lav vinkel. Bekræft, at nålen er inden for kanalens hule glødetråd, og tryk forsigtigt stemplet for at indsprøjte ca. 1-2 ml celleaffjedring i stilladset. Affjedringens flow skal være synlig gennem det gennemsigtige stillads.Når hele stilladset er fyldt med celleaffjedring, nedsænkes stilladset i frisk cellekulturmedium, og stilladset returneres til cellekulturskuvøsen i op til 10 dage. Ved levende/død billeddannelse ved inkubationens afslutning skylles stilladset med PBS, og der skal anvendes en stump nål til omhyggeligt at indsprøjte levende/død opløsning i stilladset. Bekræft, at opløsningen har fyldt hele stilladset, og placer stilladset ved 37 grader Celsius i 30 minutter.Ved slutningen af inkubationen skylles stilladset med PBS, og stilladset overføres forsigtigt til et glasrutsjebane. De farvede celler kan derefter observeres i stilladserne under et fluorescensmikroskop. I dette tværsnit af et frisktrykt og postforarbejdet stillads kan der observeres en klart synlig hul kanal i glødetråden.Selv efter 72 timers inkubation i cellekultur medium ved 37 grader Celsius som påvist, filamentet bevarer den hule struktur i hele stilladset længde. Her vises en repræsentativ levende/død analyse af endotelceller efter 48 timers kultur i et stillads. De levende celler kan identificeres ved deres lyse grønne fluorescerende signal.Denne teknik er grundlaget for et-trins fabrikation af hule rørformede stilladser og kan opgraderes ved direkte udskrivning ved hjælp af celler indarbejdet i bio-blæk.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Postproduktion Behandling af Electrospun Fibre til Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Densitetsgradient flerlags Polymerisation (DGMP): En ny teknik til at skabe Multi-rum, Customizable stilladser til Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kapillarkraft Litografi for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Selvrapportering Stilladser for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelige bruskvæv Fabrication Brug Tre-dimensionel Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Electrospun Fiber Stilladser af poly (glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural væv fra mus embryonale stamceller

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epithelial cellerepopulationskilde og Udarbejdelse af Gnaver ekstracellulær matrix Stilladser for Renal Tissue Udvikling

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Udarbejdelse af termoresponsiv nanostrukturerede overflader for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering af Intrinsic Vaskularisering i en<em&gt; In vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...