Name: core/shell printing scaffolds for tissue engineering of tubular structures
Uploaded: 2019-09-27T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить финансовую поддержку этого проекта, полученную от Словенского исследовательского агентства (гранты: P3-0036 и I0-0029) и Министерства науки, образования и спорта (номер гранта: 5442-1/2018/59).

1. Подготовка гидрогелей и кросс-связывающих растворов
<ol><li>Кратко, энергично смешивания, растворить ALG и CMC порошков в ультра-чистой воды, чтобы получить в общей сложности 3 Wt% ALG и 3 WT% CMC решение. ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе для печати используются шприцы 5 мл; таким образом, конечный объем материала корректируется с учетом этого объема. Однако для других экструзионных картриджей и размеров печатных образцов количество подготовленного материала должно быть соответствующим образом масштабировано.</li>
	<li>Добавьте 1,5 вт целлюлозы нановолокна в смесь ALG-CMC для дополнительного механического усиления для достижения желаемой вязкости, пригодной для печати.</li>
	<li>Агитировать гидрогель подвески до однородной с помощью накладных смесителей. ПРИМЕЧАНИЕ: Нет волокон или пузырьков должны присутствовать в гидрогеле.</li>
	<li>Приготовьте 10 мл хлорида кальция 100 мМ (CaCl2)в ультра-чистой воде, которая используется в качестве основного перекрестного раствора для печати.</li>
	<li>Приготовьте 10 мл 5 wt.% CaCl2 раствор в ультра-чистой воде, которая используется в качестве вторичного кросс-связывающего решения в пост-обработке эшафотов. ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, все гидрогелевые составы, которые подходят для немедленного химического перекрестного соединения, позволяют одноступенчатое изготовление полых труб и могут быть использованы с этим типом ядра/оболочки настройки. Механизмы печати и перекрестного соединения должны быть оптимизированы соответствующим образом. Вискозность гидрогеля будет варьироваться в зависимости от желаемого состава; однако его можно регулировать с помощью концентраций полимеров и добавления утолщений (например, нановолокна). Идеальная вязкость для 3D-печати стабильных структур достаточно высока для экструдированной нити, чтобы сохранить свою форму и для эшафота, чтобы держать свой собственный вес до перекрестного соединения.</li>
</ol>2. Печать основных/оболочки из перфусируемых лесов
<ol><li>Перед печатью, стерилизовать биопринтер путем распыления 70% этанола тщательно и подвергать его ультрафиолетового света в течение 1 ч.</li>
	<li>Включите биопринтер и запустите программное обеспечение для управления, которое поставляется в комплекте с 3D-принтером.</li>
	<li>Выполните процедуру самонаведения, нажав на значок Home.</li>
	<li>Использование панели инструментов в файле управления файлом Импорт G-код, импортировать генерируемые леса g-код.</li>
	<li>Перенесите гидрогель в стерильный шприц 5 мл и поместите его в одну из экструдеров 3D-принтера. Через luer-замок и короткую трубку, подключите его к боковой входним ввода ядра / оболочки сопла.</li>
	<li>Перенесите кросс-связывающее решение (100 мМ CaCl2) в другой стерильный шприц 5 мл с прикрепленной тупой иглой G27 и вставьте его в верхний держатель иглы ядра/оболочки сопла. Внутренняя игла должна слегка выступать (1 мм) от внешнего ядра/ сопла оболочки. Отрегулируйте выравнивание вручную. Вставьте второй шприц в экструзионное крепление.</li>
	<li>Чтобы правильно вставить шприцы в крепления (настройка показана на рисунке 2),вручную управляйте как экструзионными креплениями, нажав на стрелки A и B и Up and Down.</li>
	<li>Перед началом печати отдельно выдавливать гидрогель и перекрестное решение для очистки всех избыточных пузырьков воздуха в сопло ядра/оболочки и обеспечения непрерывного потока гидрогеля.</li>
	<li>Используя стрелки «Кью», «вверх» и «Вниз», вручную отрегулируйте расстояние между соплом и печатным субстратом. Рекомендуется использовать плоский, стеклопечатание субстрат, который имеет хорошую сливку. Экструзионная сопло не должна соприкасаться с субстратом, чтобы обеспечить непрерывный поток гидрогеля. Оптимальное расстояние между соплом и субстратом (высота слоя) обычно совпадает с шириной диаметра наружного сопла, но оно корректируется с учетом используемого материала и индивидуальных параметров печати. Отрегулируйте начальную высоту печати в соответствии с индивидуальными потребностями.</li>
	<li>Нажмите кнопку Воспроизведения, чтобы начать процесс печати. ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется включить печать юбки (Рисунок 3) окружающих эшафот, чтобы обеспечить укладку однородной полой нити до печати фактического эшафот начинается. Для достижения оптимального потока гидрогеля с намерением печатать оптимальные леса, варьировать состав формулировки, поперечной состав раствора и параметры печати (т.е. скорость печати, экструзионное давление, температуру печати, расстояние между субстрат и экструзионный сопло и т.д.).</li>
	<li>После печати, тщательно удалить субстрат с печатной эшафот и залить вторичного кросс-ссылок решение (5 wt.% CaCl2) по всей эшафот для обеспечения перекрестного соединения по всей эшафот. Инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре (RT). ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что весь эшафот погружен в кросс-связывание решения. Этот шаг имеет решающее значение для достижения желаемых свойств прочности эшафот, но будет варьироваться в зависимости от материала и кросс-связывания метода, используемого.</li>
	<li>С помощью скальпеля вручную вырезать избыток материала юбки.</li>
	<li>Стерилизовать эшафот под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут. Осторожно переверните эшафот и повторите процесс стерилизации.</li>
	<li>Аккуратно отсоедините эшафот от подложки, осторожно потянув его в сторону. Если эшафот сильно прилипает к подложке, разделите его, вставив между ними острый край.</li>
	<li>Передача эшафот в бесцветные средства массовой информации культуры клеток (DMEM дополнен5 wt.% FBS, 100 U/mL пенициллин и 1 мг /мл стрептомицин), и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в атмосфере, содержащей 5 wt.% CO2, по крайней мере 24 ч.</li>
</ol>3. Подготовка эндотелиальных клеток и решения для живого/мертвого асссиона
<ol><li>Для культивирования клеток, подготовить передовые DMEM клеточной культуры среды с добавлением фенола красный и дополнить его 5 wt.% FBS и 2 мМ L-глютамин. Добавьте 100 u/mL пенициллин и 1 мг/мл стрептомицина.</li>
	<li>Инициировать человека пупочной вены эндотелиальной клетки (HUVEC) линии и прохождения их в соответствии с протоколами culturing HUVEC, как описано47. ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется культуры клеток в среде клеточной культуры с добавлением фенола красный для простой визуализации во время инъекции клеток в белые полупрозрачные леса, как описано ниже.</li>
	<li>Для подсчета клеток, пипетка 100 л клеток приостановлено в среде клеточной культуры и пятно их с 900 Зл Л 0,1 Вт.% trypan синий раствор.</li>
	<li>Используйте автоматизированный счетчик клеток или ручной гемоцитометр для подсчета и получения предполагаемого количества клеток в подвеске.</li>
	<li>Для живого/мертвого ассса подготовьте раствор 4 мМ Calcein-AM и 2 mM пропидиййййййййййййййй йодид в стерильных PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: решение для живых/мертвых должно быть подготовлено непосредственно перед проведением асссеа.</li>
</ol>4. Передача клеток в леса
<ol><li>Удалите леса из клеточной культуры средств массовой информации и передать их в достаточно большой стакан Петри блюдо.</li>
	<li>Непосредственно перед введением клеток в леса, разъединить HUVECs от колбы с помощью лечения 0,25 wt.% трипсин.<ol>
<li>Кратко, распоряжаться среды культуры клеток и инкубировать клетки с 0,25 Wt.% трипсин (2 мл) в течение 5 мин при 37 градусов по Цельсию.</li>
		<li>После инкубации добавьте 3 мл средств массовой информации клеточной культуры в трипсинизированные клетки и перенесите все отдельные клетки в центрифужную трубку.</li>
		<li>Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин и распоряжаться супернатантом.</li>
		<li>Resuspend клетки в свежих средствах культуры клетки.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подсчитайте ячейки, как описано ранее. Отрегулируйте общую концентрацию клеток в соответствии с индивидуальными потребностями. В этой работе используется начальная концентрация 340 000 ячеек/мл.</li>
	<li>Переприимка клеток в стерильный шприц с прикрепленной тупой иглой G27.</li>
	<li>Найти точку входа и начать тщательно инъекционных клеток в лесах. Клеточная подвеска течет через полупрозрачный эшафот должны быть видны. Убедитесь, что весь эшафот заполняется клеточной подвеской.</li>
	<li>Погрузите леса в среду, чтобы продержаться в среде клеточной культуры, и инкубировать их при 37 градусах Цельсия в атмосфере, содержащей 5 вт.% CO2 в течение 10 дней.</li>
	<li>Пополнить среды клеточной культуры в соответствии с экспериментальными потребностями.</li>
</ol>5. Анализ в реальном маштабе времени/мертвый и изображение клетки
<ol><li>После инкубации, промыть леса с PBS.</li>
	<li>С тупой иглой, тщательно вводить ранее подготовленный живой / мертвый раствор (4 мМ calcein-AM и 2 мМ пропидий йодид в PBS) в лесах и инкубировать их в PBS в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию. Убедитесь, что раствор течет по длине всего эшафота.</li>
	<li>Промыть леса с помощью PBS.</li>
	<li>Аккуратно перенесите эшафот на стеклянную горку.</li>
	<li>Наблюдайте за окрашенными клетками непосредственно в лесах под флуоресцентным микроскопом. ПРИМЕЧАНИЕ: жизнеспособные клетки производят зеленую флуоресценцию и мертвые клетки излучают красный свет флуоресценции.</li>
</ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Конструкция сопла Используя разработанную сопло ядра/оболочки, интегрированную в двухэкструдовую систему Vitaprint, полые, трубчатые леса были изготовлены в одноступенчатом процессе. Для достижения ровной толщины трубчатой стенки через большинство подготовленных эшафотов, игла должна быть расположена централизованно на оси внешнего экструзионного кольца. Стандартные калибровочные иглы часто демонстрируют небольшую, но значительную эксцентриситет от оси. Таким образом, тело сопла было разработано для удержания иглы в двух местах, один раз в верхней части (фиксация концентратора) и один раз перед окончательным ядром / оболочкой камеры (фиксация самой канюли), исправление его осевой выравнивания. Точность выравнивания осевых увеличивается с расстоянием между точкой фиксации. Существует, однако, компромисс между длиной иглы и доступным объемом камеры сопла. Для дальнейшего улучшения функциональности настройки могут быть реализованы определенные модификации сопла: A) насадка с улучшенной стабильностью, B) дополнительные сопла для более широкого диапазона совместимости игл, C) точный механизм регулировки иглы к позиционирование сопла и D) интеграция дополнительных входов и микрофлюидных устройств для подготовки материала мухи.
Оптимизация гидрогеля Для определения оптимального соотношения ALG:CMC было оценено несколько итераций материала. Как правило, печать ядра/оболочки с концентрациями выше 3 wt.% обоих компонентов была невозможна, поскольку она не позволяла непрерывный поток гидрогеля или приводила к засорению сопла. В частности, концентрация АЛГ выше 3 wt.% увеличила вязкость чрезмерно и привела к засорению сопла, в то время как более низкие концентрации АЛГ и более высокие концентрации CMC (Зтт;3 wt.%) концентрации замедлили перекрестное время и, таким образом, не смогли обеспечить достаточное количество структурная поддержка эшафота. Печать ядра/оболочки возможна с менее вязкими составами; однако, экструдированная вязкость геля должна быть достаточной для поддержания долгосрочной формы верности. В конце концов, соотношение 1:1 ALG:CMC оказалось наиболее подходящим выбором, который подтверждает предыдущее исследование Maver et al.49. Добавление NFC значительно улучшило гравюру и структурную жесткость основных/оболочки печатных лесов, но не оказало существенного влияния на перекрестные свойства материала.
Пользовательские приложения, оптимизированные для конкретных типов клеток и экспериментальных настроек, потребуют хорошо скроенных строительных материалов, которые будут варьироваться по составу и механизмам перекрестного соединения. Метод, описанный в этой работе, основан на альгинатно-целлюлозном смешанном полимерном растворе, который связан между собой ионически с использованием ионов Ca2. Alginate сам по себе представляет собой линейный полимер блоков (1,4)-связанных й-d-маннуронат (M) и l-guluronate (G) остатки, которые могут быть обратимым ионически перекрестных путем применения Ca2 "и других divalent катионов, таких как Sr2 ", Br2 "Mg 2 ". Тем не менее, наиболее широко используемым ионом для перекрестного соединения альгината остается Ca2 в виде CaCl2. Ca2 "также может быть использован в виде CaSO4 или CaCO3; однако низкая растворимость CaSO4 по отношению к CaCl2 означает более медленное гелирование. CaCO3 дает еще более медленное время гелирования, что может привести к слабым и непоследовательным механическим свойствам.
Более длинные сроки гелирования обычно производят более однородную конструкцию, однако, некоторые приложения, такие как печать ядра/оболочки требует быстрых скоростей гелирования50. Ионы Mg2 'также вызывают гелевание; однако, их кросс-связь эффективность составляет около 5x-10x ниже, по сравнению с Ca2 ",с перекрестным связыванием раз 2-3 ч. Кроме того, ионы магния более избирательны по отношению к гулуроническим установкам, поэтому перекрестное соединение больше зависит от химического состава ALG51. В этом случае, быстрая скорость гелирования имеет важное значение для обеспечения непрерывного образования полых каналов, прежде чем полая структура может рухнуть. CaCl2 дает самый быстрый уровень гелирования, что имеет решающее значение для прямого осаждения полых нитей. 100 мМ CaCl2 был использован, который адекватно стабилизировал непрерывное образование полой нити, не вызывая гель затвердевания в сопло.
Печать и постобработка эшафотов Следующие шаги должны быть рассмотрены в ходе этой части процесса, в том числе 1) обеспечение того, чтобы все решения и материалы, включая 3D биопринтер должным образом стерилизованы перед печатью. 2) При подготовке гидрогеля, однородность материала имеет решающее значение для непрерывной печати. Введение примесей или пузырьков воздуха следует избегать, так как они могут засорить сопло и / или нарушить экструзию. 3) Шприцы должны быть должным образом подключены к соду ядра/ оболочки через механизм luer-lock и правильно вставлены в экструдеркрепления, как видно на рисунке 2A,B. 4) Перед печатью сложной структуры, рекомендуется предварительно экструдировать небольшую часть геля и поперечной связи решение для очистки избыточных пузырьков воздуха в ядре / оболочки сопла и обеспечить непрерывный поток гидрогеля. Это может быть включено непосредственно в g-код для улучшения повторяемости. 5) Полезно добавить юбку, окружающую эшафот, чтобы обеспечить укладку однородной полой нити до печати эшафот сам начинается.
Кроме того, 6) для улучшения стыковки между типовидной нитью и субстратом рекомендуется использовать плоскую поверхность с хорошей сливкой (т.е. стеклянной горкой или чашкой Петри). 7) Экструзионная сопло не должна находиться в непосредственном контакте с субстратом, чтобы обеспечить непрерывный поток гидрогеля. Начальное расстояние сильно повлияет на качество печати, но толщина экструдированной нити является хорошим приближением первоначальной настройки. 8) Начальная высота печати в g-коде должна быть скорректирована в соответствии с индивидуальными потребностями. После оптимизации параметров печати g-код леса должен быть импортирован в программное обеспечение Planet CNC, и процесс печати начался, как описано в протоколе. 9) Для контроля и оптимизации потока гидрогеля с намерением печатать оптимальные леса, как состав состава, так и параметры печати должны быть разнообразны (т.е. скорость печати, экструзионное давление, температура печати, расстояние между субстратом и экструзионный сопла, высота слоя, размер эшафота и т.д.).
Как правило, для печати составов с более высокой вязкостью требуется более высокая скорость потока. Как уже упоминалось, все гидрогелевые составы, которые подходят для немедленного химического перекрестного соединения, позволяют одноступенчатое изготовление полых труб и могут использоваться при описанной установке ядра/оболочки. Механизмы печати и перекрестного соединения должны быть оптимизированы соответствующим образом. После печати, все леса были после обработки вторичной перекрестной связи с 5 wt.% CaCl2 решение, которое обеспечивает полное перекрестное соединение компонента ALG-CMC и стерилизовать с обеих сторон под ультрафиолетовым светом, по крайней мере 30 минут. Она должна быть обеспечена, чтобы полностью поглотить эшафот с перекрестным соединением решения и инкубировать достаточно долго, чтобы завершить процесс перекрестного соединения. Постобработка будет отличаться в зависимости от используемого материала и механизма перекрестного соединения, который следует рассматривать заранее. После пост-обработки, леса должны быть удалены тщательно из подложки, переданы в среду среды культуры клеток, и инкубируется в контролируемой атмосфере, по крайней мере 24 ч до посева клеток. Использование бесцветной среды улучшит видимость клеточной подвески во время инъекций в леса.
Live/мертвый асссс Решение для живых/мертвых должно быть подготовлено непосредственно перед проведением асссеа и храниться в темноте перед проведением асссе, так как оно содержит красители флуоресценции, которые склонны к отбеливанию. После желаемого времени инкубации, средства массовой информации клеточной культуры должны быть тщательно отбрасываются окружающих леса и промыть PBS. В идеале, та же точка входа должна быть использована для посева клеток, а затем живой / мертвый ассс вводят в лесах.
Важность результатов Оба ALG и CMC уже были использованы для содействия ангиогенеза в пробирке. Основываясь на своих ECM-миметических особенностях, физической перекрестной связи и биосовместимости, ALG обычно используется в качестве компонента для доставки и контролируемого выпуска ангиогенных факторов роста (например, bFGF, HGF, VEGF164 и Ang-1)respective ,53,54. Кроме того, в сочетании с желатином, CMC также используется для инкапсуляции сосудистых эндотелиальных клеток из-за его быстро перекрестного соединения возможностей в физиологических условиях55. NFC были добавлены для дальнейшего повышения механической стабильности и формы верности эшафот. Следует подчеркнуть, что цель заключалась не в повышении васкуляризации, а в том, чтобы продемонстрировать возможность производства перфусируемых, полых эшафотов ALG-CMC, напечатанных в основной форме, что также облегчает привязку и распространение HUVECs. Выбор использования смеси ALG-CMC основывался на выводах широко используемых, легкодоступных и биосовместимых базовых материалов, которые могли бы обеспечить печать ядра/оболочки полых каналов. Многие другие материалы могут быть более жизнеспособными вариантами для повышения ангиогенеза; однако некоторые из них не подходят для печати ядра/оболочки, поскольку они не способствуют быстрому гелянию/перекрестной связи, что имеет решающее значение в этом подходе.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alginic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>180947</td>
			<td>powder; Mw ~80,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTC HUV-EC-C [HUVEC]</td>
			<td>LGC Standards (UK)</td>
			<td>ATCC-CRL-1730</td>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 40 inverted optical microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>three contrastingtechniques in one objective &#8211; e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>C1016</td>
			<td>anhydrou; granular; &#8804;7.0 mm; &#8805;93.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v))</td>
			<td>The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA)</td>
			<td></td>
			<td>nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA Purelab water purification system</td>
			<td>Veolia Water Technologies (UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Advanced Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (Advance DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>12491015</td>
			<td>high glucose; no glutamine; phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>21063029</td>
			<td>high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>10270106</td>
			<td>FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Sterican needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG (Germany)</td>
			<td>9180117</td>
			<td>0.40 x 25mm, 27G x 1&#39;&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>G3126</td>
			<td>ReagentPlus&#174;, &#8805;99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Cell Double Staining Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>4511</td>
			<td>contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask cell culture flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>156367</td>
			<td>Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG (Germany)</td>
			<td>4617053V</td>
			<td>5 mL Luer Lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>P3032</td>
			<td>powder; BioReagent; suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>P4417</td>
			<td>tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>419338</td>
			<td>powder; average Mw ~700,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>powder; BioReagent; suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td>Veolia Water Technologies (UK)</td>
			<td></td>
			<td>18.2 m&#8486; cm at 25&#8304;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitaPrint 3D bio-printer</td>
			<td>IRNAS (Slovenia)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

core/shell printing scaffolds for tissue engineering of tubular structures

Трехмерная (3D) печать ядр/оболочки позволяет прямо едить структуры канала со стабильной оболочкой, которая взаимосвязана на интерфейсе с жидким ядром. Последний удаляется после печати, оставляя полую трубку. Интеграция техники аддитивного производства (как описанная здесь с индивидуальными «био- инкетами», которые структурно и биохимически имитируют родную внеклеточную матрицу (ECM)) является важным шагом на пути к передовой тканевой инженерии. Однако для точного изготовления четко определенных структур требуется специализированные стратегии изготовления, оптимизированные для использоватого материала. Поэтому имеет смысл начать с настройки, которая настраивается, проста в использовании и совместима с широким спектром материалов и приложений. Эта работа представляет собой простой в производстве ядра / оболочки сопла с luer-совместимости для изучения ядра / оболочки печати деревянных структур, испытания с четко определенными, альгината основе эшафот материала формулировки.

Watch this Scientific Journal Video about Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures at JoVE.com

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Здесь представлена простая в использовании, ядро / оболочка, трехмерная биопечать настройки для одноступенчатой изготовления полых лесов, подходит для тканевой инженерии сосудистых и других трубчатых структур.

Ядро / оболочка Печать Scaffolds для ткани инженерных трубчатых структур

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Изготовление трубчатых структур является перспективным подходом к тканевой инженерии сосудистых сетей, которая остается одной из основных проблем при выращивании толстых тканей в пробирке. Основным преимуществом метода ядра/оболочки является простое производство полых нитей леса в один шаг, сокращая время изготовления и потенциально позволяя прямой печати с клетками. Подготовка гидрогеля с соответствующими вязко-вещественные свойства, и поддержание непрерывного сбалансированного потока основных / оболочки материалов имеет решающее значение для 3D-печати стабильных лесов.Для начала заполните стерильный шприц 5 мл свежеприготовленным гидрогелем. Заполните второй шприц 5 мл, оснащенный 27 калибровочных тупых конца иглы, со свежеприготовленным перекрестным раствором. Сопло ядра/оболочки.Вставьте G27 тупой конец иглы в качестве основного компонента и закрепить иглу с помощью винта. Внутренняя игла должна выступать около 1 мм от внешнего ядра сопла оболочки. Соедините шприц с перекрестным раствором иглы G27 в сопле и загрузите шприц в одну из экструдерных крепления стерилизованного этанолом 3D-принтера.Накрените шприц гидрогелем во второй экструдер и соедините его с соплом. Используйте замок Luer для подключения короткой трубки к боковой ввод Luer сопла ядра/оболочки. Тщательно вручную отрегулируйте выравнивание до тех пор, пока сопло не коснется поверхности, прежде чем убирать сопло на расстояние, равное внешнему диаметру сопла.Импорт генерируемых эшафот g-код и нажмите Play, чтобы инициировать процесс печати. После печати, тщательно удалить субстрат с печатной эшафот и залить вторичного перекрестного раствора на весь эшафот. Инкубировать эшафот в течение одной минуты при комнатной температуре.Чтобы отделить эшафот от субстрата, нежный тянуть эшафот боком. Если эшафот прочно прилип к субстрату, вставьте острый край между обоими материалами, чтобы отделить их. Перенесите эшафот в свежий контейнер.УФ стерилизовать обе стороны эшафота в течение 30 минут с каждой стороны. Затем поместите эшафот в бесцветную среду культуры клеток и инкубировать эшафот на 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа, по крайней мере 24 часов. На следующий день, урожай huvex из в пробирке культуры с 0,25%трипсина в течение пяти минут при 37 градусов по Цельсию.Когда клетки отсоединились, остановить энзиматической реакции с 3 мл свежей среды культуры клеток и собирать клетки центрифугации. Повторно приостановить гранулы в свежей среде культуры, содержащей фенол красный, и разбавить клетки в 3,4 раза от 10 до пятой эндотелиальной клетки на миллилитр концентрации. Загрузите клетки в стерильный шприц 5 мл, оснащенный иглой 27 калибра, и найдите точку входа в эшафот.Выравнивание иглы с прямой секцией леса нити, тщательно проколоть эшафот под низким углом. Подтвердите, что игла находится в полой нити канала и осторожно угнетает поршень, чтобы ввести примерно 1-2 мл клеточной подвески в эшафот. Поток подвески должен быть виден через полупрозрачный эшафот.Когда весь эшафот был заполнен клеточной подвеской, погрузит эшафот в среду свежей клеточной культуры и верните эшафот в инкубатор клеточной культуры на срок до 10 дней. Для живых / мертвых изображений в конце инкубации, промыть эшафот с PBS, и использовать тупой конец иглы тщательно вводить жить / мертвый раствор в эшафот. Подтвердите, что раствор заполнил весь эшафот, и поместите эшафот при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.В конце инкубации, промыть эшафот с PBS, и тщательно перенести эшафот на стеклянную горку. Окрашенные клетки можно наблюдать в лесах под микроскопом флуоресценции. В этом поперечном сечении свеженапечатанных и постобработанных эшафот, четко видимый полый канал можно наблюдать в нити.Даже после 72 часов инкубации в среде клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию, как было продемонстрировано, нить сохраняет полую структуру по всей длине эшафота. Здесь показана репрезентативная живая/мертвая анализ эндотелиальных клеток после 48 часов культуры в эшафоте. Можно определить живые клетки по ярко-зеленому флуоресцентный сигнал.Этот метод является основой для одношагового изготовления полых трубчатых лесов и может быть модернизирован путем прямой печати с использованием клеток, включенных в био-чернила.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Эластомерные PGS Строительные леса в Артериальная тканевой инженерии

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Озвучка обработка волокна Electrospun для тканевой инженерии

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Градиента плотности многослойных полимеризации (DGMP): новый метод для создания Multi-купе, Настраиваемые Строительные леса для тканевой инженерии

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Капиллярная сила Литография для сердечной тканевой инженерии

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Строительные леса Self-отчетности для 3-Dimensional культуре клеток

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Человека хрящевой ткани Изготовление с использованием трехмерных струйных технологии печати

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Electrospun волокнистых Строительные леса поли (глицерин-dodecanedioate) инженерного нервных тканях От эмбриональных стволовых клеток мыши

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Эпителиальные Репопуляции сотовый и подготовка грызунов внеклеточный матрикс строительные леса для почечной ткани развития

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Приготовление Thermoresponsive наноструктурированных поверхностей для тканевой инженерии

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Тканевая инженерия по искробезопасности васкуляризации<em&gt; В Vivo</em&gt; Tissue Engineering палата

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...