Name: core/shell printing scaffolds for tissue engineering of tubular structures
Uploaded: 2019-09-27T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures at JoVE.com

Författarna vill erkänna det ekonomiska stödet för detta projekt som erhållits från den slovenska forsknings byrån (bidrags nummer: P3-0036 och I0-0029), och ministeriet för vetenskap, utbildning och idrott (bidrags nummer: 5442-1/2018/59).

1. beredning av hydrogeler och tvär bindnings lösningar
<ol><li>Genom att kraftigt blanda, lös ALG-och CMC-pulver i ultrarent vatten för att få en total 3 WT% ALG och 3 WT% CMC-lösning. Anmärkning: i detta arbete används 5 mL sprutor för tryckning. den slutliga mängden material justeras således till den volymen. För andra extruderingskassetter och tryckta provstorlekar bör dock mängden förberett material skalas i enlighet med detta.</li>
	<li>Tillsätt 1,5 WT% cellulosa nanofibrer till ALG-CMC blandningen för ytterligare mekanisk förstärkning för att nå önskad viskositet, lämplig för utskrift.</li>
	<li>Skaka hydrogelupphängningen tills den är homogen med en överliggande blandare. Obs: inga fibrer eller bubblor bör finnas i Hydrogelen.</li>
	<li>Förbered 10 mL 100 mM kalciumklorid (CaCl2) lösning i ultra-rent vatten, som används som den primära cross-linking lösning för tryckning.</li>
	<li>Förbered 10 mL 5 WT .% CaCl2 lösning i ultrarent vatten, som används som en sekundär cross-linking lösning i efter bearbetning av byggnadsställningar. Anmärkning: i allmänhet, alla hydrogel formuleringar, som är lämpliga för omedelbar kemisk cross-linking, möjliggöra en-stegs tillverkning av ihåliga rör och kan användas med denna typ av kärna/skal set-up. De tryck-och tvär bindnings ande mekanismerna måste optimeras i enlighet med detta. Viskositeten hos hydrogel kommer att variera beroende på önskad sammansättning; Det kan dock justeras med polymerkoncentrationer och tillsats av förtjockningsmedel (t. ex. nanofibrer). Den idealiska viskositeten för 3D-utskrifter av stabila strukturer är tillräckligt hög för den extruderade glödtråden att behålla sin form och för byggnadsställningen att hålla sin egen vikt innan tvärbindning.</li>
</ol>2. kärna/skal utskrift av parfymera ställningar
<ol><li>Före utskrift, sterilisera bioprintern genom att spraya 70% etanol grundligt och utsätta den för UV-ljus för 1 h.</li>
	<li>Slå på bioprinter och kör kontrollerande programvara, som kommer i ett paket med 3D-skrivare.</li>
	<li>Utför homing-proceduren genom att trycka på hem -ikonen.</li>
	<li>Använda kommandofilen i verktygsfält | Importera g-kod, importera den genererade byggnadsställning g-koden.</li>
	<li>Överför Hydrogelen till en steril 5 mL spruta och placera den i en av 3D-skrivarens extruderfästen. Via luer lock-lock och en kort slang, Anslut den till sidan luer lock input av Core/Shell munstycket.</li>
	<li>Överför cross-linking lösning (100 mM CaCl2) till en annan steril 5 ml spruta med en bifogad G27 Blunt-änden nål och sätt in den i den övre Nålhållaren av kärnan/skal munstycket. Den inre nålen bör lätt sticka ut (~ 1 mm) från den yttre kärnan/skal munstycket. Justera justeringen manuellt. Sätt i den andra sprutan i extruderingsfästet.</li>
	<li>För att korrekt sätta in sprutorna i monteringar (set-up visas i figur 2), manuellt kontrollera båda extrudering fästen genom att klicka på A och B och upp och ner pilarna.</li>
	<li>Innan utskriften börjar, separat extrudera hydrogel och cross-linking lösning för att rensa alla överskott luftbubblor i kärnan/skal munstycket och säkerställa en kontinuerlig hydrogel flöde.</li>
	<li>Med hjälp av Z -och upp-och nedpilarna justerar du avståndet mellan munstycket och utskrifts underlaget manuellt. Det rekommenderas att använda en platt, glas-Printing substrat, som har god vidhäftning. Extrudering munstycket bör inte vara i kontakt med underlaget för att möjliggöra oavbruten flöde av hydrogel. Det optimala avståndet mellan munstycket och underlaget (lager höjden) är vanligtvis detsamma som bredden på den yttre mun styckets diameter, men den justeras till det material som används och individuella utskriftsparametrar. Justera start utskrifts höjden efter individuella behov.</li>
	<li>Tryck på uppspelnings knappen för att starta utskriftsprocessen. Anmärkning: det rekommenderas att inkludera tryckning av en kjol (figur 3) som omger ställningen för att säkerställa utläggningen av en homogen ihålig glödtråden innan utskrift av den faktiska byggnadsställningen börjar. För att uppnå optimalt hydrogelflöde med avsikten att skriva ut optimala byggnadsställningar, variera Formuleringens sammansättning, korslänkning av lösnings sammansättning och utskriftsparametrar (dvs. utskriftshastighet, extrudering tryck, tryck temperatur, avstånd mellan och extrudering munstycke, etc.).</li>
	<li>Efter utskrift, ta försiktigt bort underlaget med den tryckta ställningen och häll den sekundära tvär bindnings lösningen (5 WT .% CaCl2) över hela ställningen för att säkerställa tvär kopplingen över hela ställningen. Inkubera i 1 min vid rumstemperatur (RT). Observera: se till att hela ställningen är nedsänkt i tvär bindnings lösningen. Detta steg är avgörande för att uppnå önskade hållfasthetsegenskaper hos ställningen men varierar beroende på material och tvär bindnings metod som används.</li>
	<li>Med en skalpell manuellt skära överflödigt kjol material.</li>
	<li>Sterilisera ställningar under en UV-ljus i 30 min. Vänd försiktigt ställningen och upprepa steriliseringsprocessen.</li>
	<li>Ta försiktigt loss ställningen från underlaget genom att försiktigt dra den i sidled. Om ställningen fäster starkt vid underlaget, separera den genom att föra in en skarp kant mellan dem.</li>
	<li>Överför ställningen till ett färglöst cellodlingsmedium (DMEM kompletterad med 5 WT .% FBS, 100 U/mL penicillin och 1 mg/mL streptomycin) och inkubera dem vid 37 ° c i en atmosfär som innehåller 5 WT% CO2 i minst 24 timmar.</li>
</ol>3. beredning av endotelceller och levande/död analyslösning
<ol><li>För cellodling, Förbered avancerad DMEM cellkulturmedium med tillsats av fenolrött och komplettera den med 5 WT .% FBS och 2 mM L-glutamin. Tillsätt 100 U/mL penicillin och 1 mg/mL streptomycin.</li>
	<li>Initiera den humana navel Strängs endotelcell (HUVEC) linje och passage dem i enlighet med HUVEC odlings protokoll enligt beskrivningen47. ANMÄRKNINGAR: det rekommenderas att odla cellerna i cell odlingsmedier med tillsats av fenolrött för enkel visualisering under injektion av cellerna i vita genomskinliga ställningar enligt beskrivningen nedan.</li>
	<li>För cellräkning, Pipettera 100 μL celler suspenderade i cell odlingsmedier och fläcka dem med 900 μL av 0,1 WT .% trypan blå lösning.</li>
	<li>Använd en automatiserad cell räknare eller manuell hemocytometern att räkna och få det uppskattade antalet celler i suspensionen.</li>
	<li>För den levande/döda analysen, Bered en lösning av 4 mm calcein-am och 2 mm propidiumjodid jodid i steril PBS. Obs: den levande/döda lösningen ska förberedas direkt innan analysen utförs.</li>
</ol>4. överföring av celler till byggnadsställningar
<ol><li>Ta bort ställningar från cell odlingsmedier och överför dem till ett tillräckligt stort glas petriskål.</li>
	<li>Omedelbart innan du injicerar cellerna i ställningar, separera HUVECs från kolvar med hjälp av behandling med 0,25 WT .% trypsin.<ol>
<li>Kortfattat, avyttra cellkultur media och inkubera cellerna med 0,25 WT .% trypsin (~ 2 mL) för 5 min vid 37 ° c.</li>
		<li>Efter inkubering tillsätt ~ 3 mL cellkultur media till trypsinized celler och överföra alla fristående celler till en centrifug röret.</li>
		<li>Centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 min och Kassera supernatanten.</li>
		<li>Omsuspendera cellerna i färskt cellodlingsmedium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Räkna cellerna enligt beskrivningen ovan. Justera den totala cellkoncentrationen efter individuella behov. I detta arbete används en startkoncentration på 340 000 celler/mL.</li>
	<li>Omsuspendera cellerna i en steril spruta med en fastsatt trubbig G27 nål.</li>
	<li>Hitta en startpunkt och börja försiktigt injicera celler i ställningar. Cellsuspensionen flöde genom en genomskinlig byggnadsställning bör vara synlig. Se till att hela ställningen fylls med cellsuspension.</li>
	<li>Sänk samman byggnadsställningar i cell odlingsmedier och inkubera dem vid 37 ° c i en atmosfär som innehåller 5 WT .% CO2 i upp till 10 dagar.</li>
	<li>Fylla på cell odlingsmediet enligt experimentella behov.</li>
</ol>5. live/död analys och cell avbildning
<ol><li>Skölj byggnadsställningarna med PBS efter inkubering.</li>
	<li>Med en trubbig nål, injicera försiktigt den tidigare beredda levande/döda lösningen (4 mm calcein-am och 2 mm propidiumjodid jodid i PBS) i ställningar och inkubera dem i PBS i 30 min vid 37 ° c. Se till att lösningen flödar genom längden på hela ställningen.</li>
	<li>Skölj byggnadsställningar med PBS.</li>
	<li>Överför omsorgsfullt byggnadsställningar till en glas rutschbana.</li>
	<li>Observera de färgade cellerna direkt i byggnadsställningarna under ett fluorescensmikroskop. Obs: livskraftiga celler producerar grön fluorescens och döda celler avger rött fluorescens ljus.</li>
</ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Munstycke design Med hjälp av den utvecklade core/shell munstycke, integreras i en två-extruder Vitaprint system, ihåliga, rörformiga ställningar var fabricerade i en enda steg process. För att uppnå en jämn tjocklek av rörväggen genom de flesta av de förberedda byggnadsställningar, måste nålen placeras centralt på axeln av den yttre extrudering ringen. Standard gauge nålar uppvisar ofta en liten, men ändå betydande excentricitet utanför axeln. Sålunda, munstycket kroppen var avsedd att hålla nålen på två ställen, en gång på toppen (fastställande av navet) och en gång före den slutliga kärnan/skal kammaren (fastställande av kanyl själv), korrigera dess axiella anpassningen. Precisionen för den axiella justeringen ökar med avståndet mellan fixeringspunkten. Det finns dock en avvägning mellan nål längd och tillgängliga munstycke kammar volym. För att förbättra funktionaliteten hos set-up ytterligare, kan vissa modifieringar av munstycket implementeras: A) ett munstycke fäste med förbättrad stabilitet, B) ytterligare munstycken för ett bredare spektrum av nålkompatibilitet, C) en exakt justerningsmekanism för nål och D) integrering av ytterligare ingångar och mikrofluidiska anordningar för beredning av material i fluga.
Hydrogel optimering För att fastställa den optimala ALG: CMC-kvoten utvärderades flera materialiterationer. Generellt har kärn-/skal tryck med koncentrationer över 3 WT% av båda komponenterna omöjliggjorts, eftersom det inte tillät ett kontinuerligt hydrogelflöde eller resulterade i igensättning av munstycket. Specifikt, ALG koncentration över 3 WT .% ökade viskositeten överdrivet och resulterade i munstycke igensättning, medan lägre ALG koncentrationer och högre CMC (> 3 WT .%) koncentrationer bromsade tvär bindningstider och därmed misslyckats med att ge tillräcklig strukturellt stöd av ställningen. Kärna/Shell utskrift var möjligt med mindre trögflytande formuleringar; extruderad gel viskositet måste dock vara tillräckligt för att upprätthålla långsiktig form trohet. I slutändan, en 1:1 ALG: CMC förhållandet har visat sig vara det lämpligaste valet som bekräftar en tidigare studie av Maver et al.49. Tillsatsen av NFC avsevärt förbättrad tryckbarhet och strukturell stelhet i Core/Shell tryckta ställningar men hade ingen signifikant effekt på tvär bindningsegenskaper av materialet.
Anpassade program, optimerade för specifika celltyper och experimentella uppställningar kommer att kräva välskräddade byggnads ställnings material, som kommer att variera i sammansättning och tvär bindningsmetoder. Den metod som beskrivs i detta arbete är baserad på en alginate-cellulosa blandad polymer lösning, som är tvärbunden joniskt med ca2 + joner. Alginat självt är en linjär polymer av block av (1,4)-länkade β-d-mannuronat (M) och α-l-guluronat (G) rester som kan vara reversibelt genom användning av ca2 + och andra divalenta katjoner såsom SR2 +, br2 +, mg 2 +. Icke desto mindre, den mest använda Jon för tvärbindning av alginat förblir ca2 + i form av CaCl2. Ca2 + kan även användas i form av Caso4 eller Caco3; den låga lösligheten hos CaSO4 i förhållande till CaCl2 innebär dock långsammare gelering. CaCO3 ger ännu långsammare gelationstider vilket kan resultera i svaga och inkonsekventa mekaniska egenskaper.
Längre gelation gånger producerar vanligtvis en mer homogen konstruktion, men vissa tillämpningar, såsom core/shell utskrift kräver snabb gelation priser50. Mg2 + joner inducerar också gelation; men deras cross-linking effektivitet är ca 5x-10X lägre, jämfört med ca2 +, med cross-linking tider på 2-3 h. Dessutom är magnesium joner mer selektiva mot guluroniska enheter, därav tvärbindning beror mer på den kemiska sammansättningen av ALG51. I detta fall är en snabb gelation hastighet avgörande för att säkerställa kontinuerlig ihåliga kanal bildning innan den ihåliga strukturen kan kollapsa. CaCl2 ger den snabbaste gelation hastighet, vilket är avgörande för direkt avsättning av ihåliga glödtrådar. 100 mM CaCl2 utnyttjades, som adekvat stabiliserade kontinuerlig bildandet av en ihålig glödtråden utan att orsaka gel stelning i munstycket.
Tryckning och efter bearbetning av byggnadsställningar Följande steg bör övervägas under denna del av processen, inklusive 1) se till att alla lösningar och material inklusive 3D bioprinter är ordentligt steriliserade före utskrift. 2) vid beredning av hydrogel är homogenitet av materialet avgörande för kontinuerlig tryckning. Införandet av föroreningar eller luftbubblor bör undvikas, eftersom de kan täppa till munstycket och/eller störa extrudering. 3) sprutorna bör vara ordentligt anslutna till kärnan/skal munstycket via luer-lock-mekanismen och sättas in korrekt i extrudermonteringar som framgår av figur 2A, B. 4) innan du skriver ut en komplex struktur, det rekommenderas att pre-extrudera en liten del av gelen och cross-linking lösning för att rensa överskott luftbubblor i kärnan/skal munstycke och säkerställa en kontinuerlig hydrogel flöde. Detta kan införlivas direkt i g-koden för att förbättra repeterbarheten. 5) det är bra att lägga till en kjol som omger ställningen för att säkerställa utläggningen av en homogen ihålig glödtråden innan tryckningen av byggnadsställningen själv börjar.
Dessutom, 6) för att förbättra vidhäftning mellan tryck glödtråden och substrat, det rekommenderas att använda en plan yta med god vidhäftning (dvs, en glas bild eller petriskål). 7) extrudering munstycket bör inte vara i direkt kontakt med underlaget för att möjliggöra oavbruten flöde av hydrogel. Det initiala avståndet kommer starkt att påverka kvaliteten på utskriften, men tjockleken av extruderad glödtråden är en god approximation av den ursprungliga inställningen. 8) Start utskrifts höjden i g-koden bör justeras efter individuella behov. När utskrifts parametrarna har optimerats ska den byggnadsställning g-koden importeras till planet CNC-programvaran och utskriftsprocessen startas enligt beskrivningen i protokollet. 9) för att kontrollera och optimera hydrogel Flow med avsikten att skriva ut optimala ställningar bör både formulerings sammansättning och utskriftsparametrar varieras (dvs. utskriftshastighet, extrudering, tryck temperatur, avstånd mellan underlaget och extrudering munstycke, Lagerhöjd, byggnadsställning storlek, etc.).
I allmänhet krävs högre flödeshastigheter för att skriva ut formuleringar med högre viskositet. Som nämnts, alla hydrogel formuleringar, som är lämpliga för omedelbar kemisk tvärbindning, möjliggöra en-stegs tillverkning av ihåliga rör och kan användas med den beskrivna core/shell set-up. De tryck-och tvär bindnings ande mekanismerna måste optimeras i enlighet med detta. Efter utskrift, alla ställningar var efter bearbetas av sekundära tvärbindning med 5 WT .% CaCl2 lösning, som försäkrade fullständig tvärbindning av alg-CMC komponenten och steriliseras från båda sidor under en UV-ljus i minst 30 min. Det bör säkerställas att helt uppslukande ställningen med cross-linking lösning och inkubera tillräckligt länge för att slutföra tvär bindningsprocessen. Efter behandling kommer att variera beroende på den material och tvärbindning mekanism som används, som bör övervägas i förväg. Efter efter behandling bör byggnadsställningar avlägsnas försiktigt från underlaget, överföras till cell odlingsmediet och inkuberas i en kontrollerad atmosfär i minst 24 timmar före cell sådd. Med hjälp av ett färglöst medium kommer att förbättra synligheten av cellsuspensionen under injektion i ställningar.
Live/död analys Den levande/döda lösningen bör förberedas direkt innan du utför analysen och förvaras i mörker innan du utför analysen, eftersom den innehåller fluorescensfärger som är benägna att blekning. Efter önskad inkubationstid ska cell odlingsmediet försiktigt kasseras runt byggnadsställningar och sköljas med PBS. Helst bör samma ingångspunkt användas för cell sådd följt av levande/död analys som injiceras i ställningar.
Betydelsen av resultat Både ALG och CMC har redan använts för att främja angiogenes in vitro. Baserat på dess ECM-mimetic funktioner, fysiska tvärbindning, och biokompatibilitet, ALG har varit vanligt förekommande som en komponent för leverans och kontrollerad frisättning av angiogena tillväxtfaktorer (t. ex., bFGF, HGF, VEGF164, och ang-1 * respektive)52 ,53,54. Dessutom, i kombination med gelatin, CMC har också använts för att kapa vaskulära endotelceller på grund av dess snabbt tvär bindningsförmåga under fysiologiska förhållanden55. NFC har lagts till för att ytterligare öka den mekaniska stabiliteten och forma återgivningen av byggnadsställningar. Det bör understrykas att målet inte var att öka vaskularisering utan att Visa möjligheten att producera parfymera, ihåliga alg-CMC ställningar, tryckt i kärna/Shell mode, vilket också underlättar fastsättning och spridning av HUVECs. Valet att använda en ALG-CMC-blandning baserades på resultaten av vanliga, lättillgängliga och biokompatibla basmaterial som kunde möjliggöra kärn-/skal tryckning av ihåliga kanaler. Många andra material kan vara mer livskraftiga alternativ för att förbättra angiogenes; men vissa är inte lämpliga för kärna/skal utskrift, eftersom de inte underlättar snabb gelation/cross-linking, vilket är avgörande i detta tillvägagångssätt.

Förmodligen är det slutgiltiga målet för vävnadsteknik (te) att producera funktionella vävnader eller organ in vitro, som kan användas för att regenerera eller ersätta skadade eller sjuka delar av människokroppen1,2,3. Aktuell forskning inom vävnadsteknik (TE) är inriktad på enskilda aspekter av området (byggnadsställningar material, tillverknings procedurer, cell källor, etc.) 4,5, samtutveckla enkla in vitro-modeller av vävnader och organ som efterliknar grundläggande aspekter av deras in vivo motsvarigheter. Sådana modeller är redan användbara för många tillämpningar, såsom Drug screening och toxicitetsstudier, särskilt i fall där konventionella 2D-cellkulturer misslyckas med att efterlikna de dynamiska svaren från de infödda vävnaderna6,7, 8,9. Tredimensionella in vitro-modeller konstrueras vanligtvis genom att kombinera celler10, fysikalisk-kemiska ledtrådar11, och biologiskt aktiva molekyler12,13 på ställningar, som erhålls från deellulariserade vävnader eller konstruerade de Novo från biologiskt eller biokompatibelt material14,15,16,17,18.
Det är viktigt att byggnadsställningar recapitulate komplexa 3D mikroarkitektur och hierarkisk struktur av de infödda vävnader för att möjliggöra funktionaliteten hos de konstruerade vävnader, representativa för in vivo vävnader19. Trots den betydande tekniska framsteg i TE, utveckling av fysiologiskt relevanta konstgjorda vävnad konstruktioner är fortfarande en utmaning. Tjocka vävnader (> 200 μm i tjocklek) är särskilt problematiska, på grund av begränsningar såsom syre och näringsämne diffusion20. Framsteg mot större vävnads konstruktioner har gjorts. den erforderliga höga närheten av celler till blodkärl för att transportera syre och näringsämnen och främja avlägsnande av avfall måste dock rekapitueras. Vascularization av vävnader (eller alternativt, tillverkning av sammankopplade 3D-vaskulära nätverk inom vävnad konstruktioner) spelar en avgörande roll för att upprätthålla cellernas lönsamhet och främja funktioner i in vitro-konstruerade vävnader, vilket är svårare för modeller i långvariga experiment21,22. Vidare har den erforderliga upplösningen, den strukturella integriteten och samtidig biokompatibilitet ännu inte uppnåtts23.
Flera TE metoder har föreslagits i ett försök att konstruera blodkärl-liknande strukturer och underlätta vaskularisering in vitro-. Några exempel är sådd endotelceller (även co-odlade med andra celler typer såsom fibroblaster) att själv-montera för att generera mikrovaskulära nätverk24, användning av vaskulära stamceller och pericyter som främjar endotelceller tillväxt21,25, leverans av angiogena tillväxtfaktorer som inducerar vaskularisering20,26, med hjälp av cellark teknik som möjliggör kontroll över vaskulär skiktning20, och tillverkning av mycket porösa byggnadsställning strukturer som främjar angiogenes27. De nämnda tillvägagångssätten fokuserar på angiogeneshämning, som i allmänhet kräver avsevärda mängder ytterligare tillväxtfaktorer (t. ex. VEGF) och tid till form. Men de största nackdelarna är deras begränsade reproducerbarhet och begränsad rumslig kontroll över vaskulär mönkning, vanligtvis resulterar i en slumpmässig kärlsystemet fördelning inom vävnad konstruera som inte nödvändigtvis underlättar perfusion.
Additiv tillverkning (AM, såsom 3D bioprinting) är alltmer involverad i tillverkningen av 3D konstruktioner med hjälp av biologiskt eller biokompatibelt material för att skapa ställningar som lämpar sig för TE. Flera AM-strategier används och utvecklas parallellt (t. ex. bläckstråle-och microextrudering-baserade metoder, olika typer av litografiska tekniker) för att producera ställningar som imiterar inhemska vävnader i deras arkitektur, biokemi och funktionalitet . De enskilda teknikerna uppvisar vissa fördelar och nackdelar28, varför olika modifieringar utforskas (t. ex. mikromönstringar, inducerad angiogenes, etc.) för att öka i vilken utsträckning stora, komplexa och stabila vaskulära nätverk kan tillverkas22,29,30.
Bland dessa, extrudering bioprinting är den vanligaste metoden, särskilt på grund av det breda utbudet av kompatibla material (en allmänt cell-vänlig process28,31,32) samt exceptionell mångsidighet i användningsvillkor (t. ex. inbäddade och offer tryck23,33, tillverkning av ihåliga konstruktioner34,35, etc.). De viktigaste utmaningarna med närvarande studier inkluderar överföring från 2D till 3D strukturer, bildandet av ett tätt nätverk av ihåliga rör med hög rumslig upplösning, och övergripande mekanisk integritet och form trohet under vätskeflödet i cellkulturen villkor30.
Den enklaste metoden för perfusable vävnad är tillverkningen av ett sammanlänkat nätverk av kanaler inom konstruktionen. Skapandet av sådana parfymiserbara kanaler inom en vävnad byggnadsställning förväntas lösa många av de ovan nämnda problem, eftersom det omedelbart möjliggör för näringsämnen och syre diffusion samtidigt ta bort slaggprodukter. Därför undviks den potentiella bildandet av nekrotiska regioner inom konstruktionen36. Sådana kanaler kan dessutom vara seedade med endotelceller (ECs) och fungera som konstgjorda blodkärl i 3D-vävnadsmodeller37. I den mest elementära bemärkelse, ett fartyg kan bestå av en ihålig kanal, mjukt skikt av ECs, och stela skal. Nyligen 3D extrudering av två olika material i en kärna/Shell mode utnyttjar Co-Axial nålar för extrudering har vunnit mycket intresse38,39,40,41, eftersom det gör det möjligt för tillverkning av ihåliga rör.
I likhet med konventionella microextrudering 3D-utskrifter, Core/Shell utskrift utförs med en Co-Axial munstycke (t. ex., två nålar med olika diametrar justeras på samma axel på ett sätt, så att den bredare nålen omsluter den smalare en). Således kan två material extruderas samtidigt, med en som den centrala glödtråden eller "inre" kärna och en sekund som den "yttre" skal41. Hittills har Co-Axial bioprinting utnyttjats för att fabricera strukturer med solid42, Core/Shell43, och ihåliga strängar40,44; de material som används har dock inte optimerats för både optimal cell lönsamhet och mekanisk robusthet hos de tryckta konstrukkterna. Som nämnts, tekniken ger möjlighet att kombinera biomaterial med olika mekaniska egenskaper, där styvare en stöder mjukare en. Ännu viktigare, om byggnadsställningen material (t. ex., alginat, karboxymetylcellulosa) extruderas som skalet, medan kärnan består av tvärbindningsmedel (t. ex., kalciumklorid) dispenseras från den inre kapillär sedan sköljas ut efter tryckning, är det möjligt att tillverka ett sammanhängande ihåligt rör i ett enda steg45.
Med detta i åtanke, en enkel och repeterbara en-stegs metod utvecklades för att bygga väldefinierade och parfymera ställningar för konstruktion av vaskulära strukturer och andra tubulära vävnader. För att utveckla en kostnadseffektiv teknik, bör tillverkningen helst vara en enda steg process. Därför anpassades och integrerades en Core/Shell-uppsättning i 3D bioprinter. Den grundläggande konstruktionen består av en central munstycke av metall för att undvika deformation under injektion, runt vilken ett andra munstycke av en större diameter placeras. En sådan Co-Axial munstycke set-up möjliggör co-extrudering av de två flödena och omedelbar tvärbindning av extruderade hydrogel kanalen. Detta möjliggör direkt tillverkning av flerskiktade ihåliga glödtrådar, medan efterföljande tvärbindning med högre koncentrationer av kalciumklorid (CaCl2) säkerställa mer permanent stabilisering från utsidan.
Som sådan tillåter denna metod för samtidig tryckning av ställningar och mikrokanaler, där de ihåliga hydrogel glödtrådar fungera som en byggnadsställning för att stödja den mekaniska integriteten i 3D konstruktioner och samtidigt fungera som inbyggda mikrokanaler för att leverera näringsämnen för celltillväxt. Detta protokoll ger ett detaljerat förfarande av Core/Shell 3D bioprinting strategi baserat på användning av en skräddarsydd Co-Axial munstycke där hydrogel 3D-strukturer med inbyggda kanaler tillverkas genom att kontrollera tvärbindning för att producera ihåliga glödtrådar, som fortfarande är parfymera under cellkulturen.
3D-utskriftset-up som används i detta arbete är konfigurerad som tidigare beskrivits av Banović och Vihar46 och kan delas in i tre huvudkomponenter: a) en tre-AXLIG CNC mekanisk set-up med 50 μm positionering noggrannhet i X, Y, och Z riktningar; B) två Extrudrar, anpassade för engångssprutor med 5 mL luer-lock, med 1,2 μL Voxel-upplösning. och C) styrning av elektronik och programvara.
För att underlätta kärn-/skal tryck utvecklades ett lämpligt munstycke som kan monteras på en av extruderarna (primär extruder, tryckning av kärnan) och är kompatibelt med G27 Blunt-pinnnålar. Det har också luer-lock kompatibilitet för att ansluta med den andra extruder (utskrift skalet). De första prototyperna var fabricerade genom att sätta in en trubbig ände G27 nål (innerdiameter = 210 μm, ytterdiameter = 410 μm) i antingen en G21 nål (innerdiameter = 510 μm, ytterdiameter = 820 μm) eller G20 konisk spets (innerdiameter = 600 μm), sedan sätta i en sekundär n Eedle Terrace sidled för att förse skalet materialet. Men på grund av lätt böjning av nålens skaft, är det inte möjligt att producera en munstycke spets med koncentrisk justering av inre och yttre nålar.
För att lösa detta problem, utformades ett nytt munstycke design som uppfyllde följande kriterier: 1) det kan tillverkas med hjälp av en 3-axlig CNC Mill, 2) det kan göras från olika material (hög prestanda plast, såsom PEEK eller metaller), 3) det har luer-lock kompatibilitet för applicering av Shell material, och 4) är kompatibel för en G27 trubbig-end nål och håller den på plats i två lägen för att rikta spetsen med den centrala axeln. En schematisk av munstycket prototypen visas i figur 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alginic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>180947</td>
			<td>powder; Mw ~80,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTC HUV-EC-C [HUVEC]</td>
			<td>LGC Standards (UK)</td>
			<td>ATCC-CRL-1730</td>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 40 inverted optical microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>three contrastingtechniques in one objective &#8211; e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>C1016</td>
			<td>anhydrou; granular; &#8804;7.0 mm; &#8805;93.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v))</td>
			<td>The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA)</td>
			<td></td>
			<td>nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA Purelab water purification system</td>
			<td>Veolia Water Technologies (UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Advanced Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (Advance DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>12491015</td>
			<td>high glucose; no glutamine; phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>21063029</td>
			<td>high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>10270106</td>
			<td>FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Sterican needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG (Germany)</td>
			<td>9180117</td>
			<td>0.40 x 25mm, 27G x 1&#39;&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>G3126</td>
			<td>ReagentPlus&#174;, &#8805;99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Cell Double Staining Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>4511</td>
			<td>contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask cell culture flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)</td>
			<td>156367</td>
			<td>Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG (Germany)</td>
			<td>4617053V</td>
			<td>5 mL Luer Lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>P3032</td>
			<td>powder; BioReagent; suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>P4417</td>
			<td>tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carboxymethyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>419338</td>
			<td>powder; average Mw ~700,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>powder; BioReagent; suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td>Veolia Water Technologies (UK)</td>
			<td></td>
			<td>18.2 m&#8486; cm at 25&#8304;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitaPrint 3D bio-printer</td>
			<td>IRNAS (Slovenia)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

core/shell printing scaffolds for tissue engineering of tubular structures

Tredimensionell (3D) tryckning av Core/Shell filament möjliggör direkt tillverkning av kanal strukturer med ett stabilt skal som är tvärbunden vid gränssnittet med en flytande kärna. Den senare avlägsnas efter tryckning, lämnar bakom en ihålig tub. Integrera en tillsats tillverkningsteknik (som den som beskrivs här med skräddarsydda [bio] bläck, som strukturellt och biokemiskt efterlikna den infödda extracellulära matrix [ECM]) är ett viktigt steg mot avancerad vävnadsteknik. Men exakt tillverkning av väldefinierade strukturer kräver skräddarsydda Fabrication strategier optimerade för det material som används. Därför är det klokt att börja med en uppsättning som är anpassningsbar, enkel att använda och kompatibel med ett brett spektrum av material och applikationer. Detta arbete presenterar en enkel att tillverka kärna/skal munstycke med luer-kompatibilitet för att utforska core/shell tryckning av träpile strukturer, testade med en väldefinierad, alginate-baserade byggnadsställning material formulering.

Syftet med detta arbete var att utveckla ett lätt-till-tillverkning kärna/skal munstycke med luer-kompatibilitet för core/shell tryckning av träpile strukturer. Dessutom beskrevs ett enkelt och repeterbart tryck protokoll i ett steg, som är enkelt att modifiera och rymmer ett brett spektrum av material och olika kemiska tvär bindnings ningsmekanismer för att bygga väldefinierade och parfymera ställningar för konstruktion av vaskulära och andra tubulär vävnad strukturer.
Kärna/skal munstycke Munstycket består av en G27 trubbig-end nål (för tryckning den inre axiella glödtråden) och munstycket kroppen, som håller nålen på plats och skapar ett yttre munstycke för skalet glödtråden med en Anslutningsport för material ingång. En schematisk visas i figur 1. Två 5 mL sprutor, som är placerade i de enskilda Extrudrar och tillhandahålla kärn-och skalmaterial. Slangen förbinder mun stycks kroppen med sprutan, vilket ger skal materialet.
Den kompletta monteringen av Core/Shell-munstycket och sprutset visas i figur 2. Den första funktionella prototypen av munstycket kroppen tillverkades av CNC-fräsning ett block av polyoxymetylen (POM). Kompatibilitet och tätning mellan elementet, en G27 nål och slangar testades genom att installera i Vitaprint. Inget läckage av skal materialet observerades i munstycket, luer-lock-kontakten, eller mellan kropp och nål. Munstycket kroppen passar tätt med nålen navet (Luer kontakt), vilket säkerställer synkroniserad rörelse av hela munstycket med extrudern.
Byggnadsställning Den enklaste metoden att fabricera ställningar är genom att deponera material lager för lager där utskriftsriktningen ändras varje skikt i följd, typiskt i en vinkel på 90 °. På grund av hydrogels Visco-elastiska och hygroskopiska egenskaper behåller form återgivningen av de tryckta strukturerna en utmaning. Det huvudsakliga syftet med detta protokoll avsnitt är 3D-utskrift av parfymerade core/shell ställningar med hjälp av två polymerer, som tidigare har visat lovande resultat för byggnadsställning (ALG och CMC) med tillsats av cellulosa nanofibrer (NFC) för ökad mekanisk stabilitet. Både ALG och CMC är negativt laddade, vattenlösliga linjära sampolymerer48 och båda innehåller Karboxylgrupper, som kan tvärbunden med tillsats av divalenta katjoner. Ca2 + partiklar bildar Joniska obligationer med två funktionella grupper samtidigt, som bildar kopplingar mellan polymerkedjor, ökande gel styvhet.
Tryckning av parfyserbara ställningar Syftet med denna process är att 3D-Print enkla vedtrave byggnadsställning strukturer, som spänner över flera skikt och behålla sin form trohet samt perfusability tills de blir helt tvärbunden. Detta kräver även coextrudering av kärna och skal utan crossover eller indragning rörelser, som kan avbryta flödet. Därför är typiska CAD-modellering och skivning metoder mindre lämpade. I detta arbete används en manuellt utformad g-kod, och en python-baserad g-kod generator utvecklades för snabb g-kod beredning.
Byggnadsställningar var strukturerade i en träpile rutnät form och byggd på en platt glasyta. Tillverkningen utfördes lager-för-lager, deponering av korsningen linjerna i varje efterföljande skikt i en vinkel 90 ° till den föregående. Dessutom var varje efterföljande skikt 2% smalare i X-och Y-riktningarna, vilket garanterar kontinuerlig glöd tråds stöd av föregående skikt. Avståndet mellan glödtrådar (makroporstorlek) kan exakt utformas i g-koden genom att ta hänsyn till den yttre diametern hos den extruderade glödtråden (0,8 mm) och avståndet mellan stödlinjerna (3 mm).
Ställningar krävdes för att uppfylla viktiga inklusionskriterier för vidare övervägande. För det första krävdes byggnadsställningar med minst 4 skikt i höjdled för att bibehålla sin strukturella integritet och geometri (t. ex. makroporstorlek) Undertryckning, för att vara berättigad till vidareutveckling. För det andra behövde byggnadsställningar förbli perfusable (stabila mikrokanaler) även efter att ha inkuberats i 7 dagar i cell odlingsmedier vid 37 ° c. Vid lämpliga tidsintervall (1, 2, 5 och 7 dagar) togs byggnadsställningar ut ur odlings medierna och testades för att se om de fortfarande var perfusable. I figur 4avisar tvärsnittet av en nyligen tryckt och efterbehandlad byggnadsställning en tydligt synlig ihålig kanal inuti glödtråden. I figur 4bär det tydligt att även efter 72 h inkubering i cell odlingsmedier vid 37 ° c behåller glödtråden den ihåliga strukturen genom hela byggnadsställningen.
Flera formuleringar var utskrivbara, förblev strukturellt stabila, bevarade den tryckta geometrin, och förblev perfusable; en enda valdes dock för ytterligare testning (d.v.s. 3 WT .% ALG + 3 WT .% CMC + 1,5 WT .% NFC), vilket möjliggjorde utskrift av parfymera ställningar med upp till 10 lager. Tryckprocessen med det anpassade munstycket visas i figur 5a. Kärna/Shell utskrift var möjligt med mindre trögflytande formuleringar; emellertid, geler med högre koncentrationer tillät inte kontinuerligt flöde genom munstycket. För primär cross-linking (kärnmaterial, levereras undertryckning) 100 mM CaCl2 utnyttjades, som adekvat stabiliserades kontinuerlig bildandet av en ihålig glödtråden, utan att orsaka gel stelning i munstycket. Post-Printing, var ställningar dränkts i en 5 WT .% CaCl2 lösning för att helt Cross-Link hydrogel för långsiktig form trohet. Ett färdigt byggnadsställning-prov avbildas i Figur 5b. Under optimeringen, process av formuleringen ett konstgjort färgämne användes i den centrala lösningen, att möjliggöra visuell utvärdering och undersöka kvaliteten på extruderad glödtråden. Färgen användes inte för tillverkning av de slutliga byggnadsställningar, som var förberedda för cell sådd och odling.
Live/död analys Efter inkubering användes en levande/död analys för att visualisera ECs och skilja mellan de levande (gröna) och de döda (röda) cellerna i den ruvade ställningen. Detta tjänade två huvudsakliga syften: A) för att avgöra om byggnadsställningar ger en biokompatibel miljö för att främja tillväxt och vidhäftning utan att uppvisar skadliga effekter på cellen, och B) för att visualisera den strukturella integriteten av rörformiga strukturer och deras interna kanalsystemet mer detaljerat.
Resultaten av den levande/döda analysen visas i figur 6. I närvaro av intracellulära esteraser, plasmamembranet permeabel calcein-AM omvandlas till calcein, avger grönt fluorescens ljus i levande celler. Å andra sidan, apoptotiska celler visualiseras av membran ogenomtränglig propidiumjodid jodid, som fluorescerar i rött när interkalenderat i DNA dubbel Helix. Levande/döda bilder och ljusa fält bilder av byggnadsställningar kombinerades för att visualisera cellerna inuti de ihåliga kanalerna. Infärgnings lösningen injicerades, och analysen utfördes direkt i 3D-tryckta ställningar efter scaffold-cell inkubering för 48 h.
Det bör noteras att en relativt liten sådd täthet av ECs användes (340 000 celler/mL), eftersom denna studie tjänade endast som ett proof-of-koncept för kärna/skal tryckning av parfymera ställningar. Den mest betydande slutsats av Live/Dead analysen är att även efter 48 h, inga döda celler (röd) observerades, visar att varken den byggnadsställning själva materialet, eller dess nedbrytningsprodukter uppvisade toxiska effekter. Dessutom gjorde ECs i själva verket fästa och förbli fäst inne i byggnadsställningar och verkade bilda jämnt fördelade agglomeratbildning när de odlas inne i kanalerna. Detta tyder på att den beskrivna tillverkningsmetoden och byggnadsställning formulering ger en lämplig ram för att bygga in vivo, relevanta, rörformiga vävnadens morfologier. Förutom imitera cell-ECM interaktioner och snäva cell-cellkommunikation i alla tre rumsliga dimensioner, komplexa vävnadsteknik kräver också konstant cell exponering för färskt medium för att upprätthålla deras lönsamhet. Detta i sin tur kan uppnås genom en tät kanal nätverk under kontinuerlig perfusion, som motiverar ytterligare utredning i framtida arbete, och kommer att kräva att optimera material och tillväxt parametrar för att underlätta långsiktig vävnadsteknik av kärl.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig1.jpg"> Figur 1: prototyp för kärna/skal munstycke. (A) den övergripande utformningen och huvudkomponenterna i munstycke kroppen prototyp visas. Munstycket är klar genom att sätta in en trubbig-end G27 nål genom toppen. De övre och nedre nålhållarna immobilisera och justera nålen med munstycket axeln, se till att spetsen sträcker sig från munstycket genom centrum.  För att ansluta munstycket med "Shell" material extruderad från den sekundära sprutan, slangar med en luer-lock-kontakt är ansluten till den laterala ingången. Härifrån vidarebefordras materialet till munstycket genom en smal kanal. Tillverkningen av den nämnda kanalen kräver borrning i två positioner, som producerar hål som måste begränsas efter tillverkning). (B) visas är en närbild av munstycket med en isatt G27 nål, som sträcker sig ut ur munstycket. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig2.jpg"> Figur 2: slutlig kärna/Shell-uppsättning. (A) visas är det färdiga core/shell-munstycket med korrekt bifogade sprutor som innehåller hydrogel (höger), som bygger "skalet" och tvär bindnings lösning (vänster) extruderad som "kärna". (B) visas är kärnan/Shell set-up installeras i Vitaprint systemet med två Extrudrar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig3.jpg"> Figur 3: G-kod för den rörformiga ställningen. Här visas en skärmbild av skrivarens programvara, särskilt sökvägen för förhandsgranskningen (a) och den råa g-koden för det första lagret (B). G-koden är en uppsättning instruktioner med målkoordinater i absoluta rumsliga riktningar (X, Y, Z), samt extrudering (A, B) i relativa riktningar. G-kommandot bestämmer vilken typ av instruktion, medan G1 representerar linjär rörelse mot målkoordinaterna och G92 bestämmer den initiala startpositionen. Dessutom bestäms matningshastigheten för följande kommandon med instruktion F i mm/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig4.jpg"> Figur 4: tvärsnitt av en byggnadsställning strand med en ihålig interiör. (A) som visas är tvärsnitts delen av den nyligen tryckta och efterbehandlade byggnadsställningen. (B) visas är tvärsnitts biten av ställningen efter att inkuberas i cell Odlingsmedier för 72 h. Medan munstycket formen definierar extrudering av ett rör med ett runt tvärsnitt, glödtråden verkar vara något tillplattad på deposition. Den interna kanalen förblir dock intakt och behåller sin form under inkubering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig5.jpg"> Figur 5: kärna/skal tryckning av byggnadsställningar. Här visas fabrikation (a) av en treskiktade hålrörs byggnadsställning och dess slutliga form (B). För förbättrad visualisering färgas tvär bindnings lösningen i kärnan med ett rött färgämne. Formuleringen uppvisar tillräcklig mekanisk stabilitet för att behålla byggnadsställningen stabilitet, även om tjockare strukturer (upp till 10 skikt, data som inte visas) är fabricerade. Den slutliga strukturens yttermått var ca 27 mm x 27 mm x 3,5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig5large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig6.jpg"> Figur 6: Live/Dead-analys utförd direkt i byggnadsställningar. En suspension av HUVECs injicerades i den inre ställningen kanal, inkuberades för 48 h, och behandlas med levande/död färgämne. Livskraftiga HUVECs avger grönt fluorescens ljus, som representeras i de ljusa fläckar av bilden. Döda celler avger grönt fluorescens ljus; dock är ingen synlig i den observerade ställningen. Cellernas utbredning betecknar också kanalernas form och balanserade kapacitet för perfusion. I mindre utsträckning, den levande/död analyslösning också målat byggnadsställningar material, producerar ljus fluorescens under mikroskopet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures at JoVE.com

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Presenteras här är en enkel att använda, Core/Shell, tredimensionell bioprinting set-up för ett steg tillverkning av ihåliga ställningar, lämplig för vävnadsteknik av vaskulära och andra tubulär strukturer.

Kärna/Shell tryck ställningar för vävnadsteknik av rörformiga konstruktioner

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Tillverkning av rörformiga strukturer är en lovande inställning till vävnadsteknik av vaskulära nätverk, som fortfarande är en av de stora utmaningarna i odling av tjocka vävnader in vitro. Den största fördelen med kärn/skaltekniken är den enkla produktionen av ihåliga glödtrådsställningar i ett enda steg, vilket minskar tillverkningstiden och eventuellt möjliggör direkt utskrift med celler. Förbereda en hydrogel formulering med lämpliga viskoelastiska egenskaper, och upprätthålla en kontinuerlig balanserad flöde av kärnan / skalmaterial är avgörande för 3D-utskrift av stabila byggnadsställningar.Till att börja, fyll den sterila 5 mL sprutan med nyberedd hydrogel. Fyll en andra 5 mL spruta, utrustad med en 27 gauge trubbig-end nål, med nyberedda crosslinking lösning. Montera ihop kärnan/skalmunstycket.Sätt in en G27-trubbig-end nål som kärnkomponent och fäst nålen med hjälp av skruven. Den inre nålen ska sticka ut ca 1 mm från den yttre kärnan skalmunstycke. Anslut sprutan med tvärbindningslösningen till G27-nålen i munstycket och ladda sprutan i en av extruderfästena på en etanolsteriliserad 3D-skrivare.Montera sprutan med hydrogel i den andra extrudern och anslut den till munstycket. Använd ett Luerlås för att ansluta ett kort rör till sidan Luer-ingången av kärnan/skalmunstycket. Justera anpassningen manuellt manuellt tills munstycket vidrör ytan innan munstycket dras in till ett avstånd som är lika med den yttre munstyckets diameter.Importera den genererade ställningen g-kod och tryck spela för att inleda tryckprocessen. Efter utskriften avlägsnar du försiktigt underlaget med den tryckta ställningen och häller den sekundära tvärbindningslösningen över hela ställningen. Inkubera ställningen i en minut i rumstemperatur.För att lossa ställningen från substratet drar du försiktigt ställningen i sidled. Om ställningen fäster starkt vid substratet, sätt in en skarp kant mellan båda materialen för att separera dem. Överför ställningen till en färsk behållare.UV sterilisera båda sidor av ställningen i 30 minuter per sida. Placera sedan byggnadsställningen i ett färglöst cellodlingsmedium och inkubera byggnadsställningen vid 37 grader Celsius med 5 %koldioxid i minst 24 timmar. Nästa dag, skörda huvex från en in vitro-kultur med 0,25%trypsin i fem minuter vid 37 grader Celsius.När cellerna har lossnat, stoppa den enzymatiska reaktionen med 3 mL av färskt cellodlingsmedium och samla cellerna genom centrifugeringen. Åter upphäva pelleten i färskt odlingsmedium som innehåller fenolrött, och späd cellerna till en 3,4 gånger 10 till den femte endotelceller per milliliter koncentration. Fyll på cellerna i en steril 5 mL spruta utrustad med en 27 gauge nål och lokalisera en ingångspunkt i ställningen.Rikta nålen med den raka delen av ställningen glödtråden, försiktigt punktera ställningen i en låg vinkel. Bekräfta att nålen ligger inom kanalens ihåliga glödtråd och försiktigt trycka ned kolven för att injicera ungefär 1-2 mL cellupphängning i ställningen. Suspensionens flöde bör vara synligt genom den genomskinliga ställningen.När hela ställningen har fyllts med cellupphängning, undersänka ställningen i färskt cellodlingsmedium och återföra ställningen till cellodlingsinkubatorn i upp till 10 dagar. För levande/död avbildning i slutet av inkubationen, skölj ställningen med PBS, och använd en trubbig-end nål för att försiktigt injicera levande / död lösning i ställningen. Bekräfta att lösningen har fyllt hela ställningen, och placera ställningen på 37 grader Celsius i 30 minuter.I slutet av inkubationen, skölj ställningen med PBS, och försiktigt överföra ställningen till ett glas slide. De färgade cellerna kan sedan observeras i ställningen under fluorescensmikroskop. I detta tvärsnitt av en nytryckt och efterbeskriven byggnadsställning kan man observera en väl synlig ihålig kanal inom glödtråden.Även efter 72 timmars inkubation i cellodlingsmedium vid 37 grader Celsius som visats, behåller glödtråden den ihåliga strukturen i hela byggnadsställningens längd. Här visas en representativ levande/död analys av endotelceller efter 48 timmars odling inom en byggnadsställning. De levande cellerna kan identifieras genom sin ljusgröna fluorescerande signal.Denna teknik är grunden för enstegs tillverkning av ihåliga rörformiga byggnadsställningar och kan uppgraderas genom direkt utskrift med hjälp av celler införlivas i bio-bläck.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Elastomerisk PGS Byggnadsställningar i arteriellt Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Postproduktion Bearbetning av Electrospun Fibrer för Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Densitetsgradient flerskiktad polymerisation (dGMP): en ny teknik för att skapa flera fack, Anpassningsbara Byggnadsställningar för Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kapillärkraften Litografi för Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Självrapporterings Ställningar för 3-dimensionell cellodling

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human Brosk Tissue Fabrication Använda Tredimensionell Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Electrospun Fibrer Byggnadsställningar av poly (glycerol-dodecanedioate) för Engineering neurala vävnader från mus embryonala stamceller

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epitelceller Återplantering och framställning av gnagare Extracellular Matrix Byggnadsställningar för njurvävnad utveckling

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Framställning av termoresponsiv nanostrukturerade ytor för Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering av Intrinsic Vascularization i en<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering avdelningen

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...