Name: extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00
Duration: 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Wellcome-finansiering til JB [104648]. Arbejdet i Wellcome Center for Cell Biology understøttes af Wellcome Core-finansiering [092076]. Forfatterne anerkender medlemmerne af laboratoriet for deres hjælp: Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna de Lucas-Arias og shiney George. Forfatterne vil også gerne takke Patrick Cramer for plasmid YEpEBI31111.

<ol>
	<li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine.">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513 (2018).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li><li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity.">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li><li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast.">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li><li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion.">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA's+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression.">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li><li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).</li><li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li><li>R&#228;dle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis,+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture.">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).</li><li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics.">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li><li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system.">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li><li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboSys,+a+high-resolution,+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3&#8242;-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3&#8242;-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li><li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+fast+and+incredibly+close:+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast.">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li><li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters.">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li><li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast.">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li><li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimeLapse-seq:+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding.">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne artikel præsenterer en protokol for ekstremt hurtig og specifik 4tU mærkning, for genopretning af spirende, nyligt syntetiseret RNA fra S. cerevisiae efter så lidt som 15 S af mærkning, med meget lav kontaminering af umærkede RNA.
Brugeren skal altid sørge for at opretholde integriteten af RNA ved brug af kolde temperaturer og DEPC-behandlede reagenser. Streptavidin perle rensning er generelt pålidelig; Men, vulst buffer er vanskeligt at håndtere; Det skal gøres frisk, med dets komponenter tilsættes i den rigtige rækkefølge, og ikke kølet eller autoklave. Fælles mangler omfatter RNA er ufuldstændigt opløst efter nedbøren trin, og så er enten ikke biotinylated eller på anden måde tabt under behandlingen trin. Der er omfattende fejlfindingshjælp i det supplerende materiale.
Der er nogle begrænsninger at være opmærksom på i ers4tU. En allerede nævnt er, at 4tU bremser væksten af gær (figur 1a). Bortset fra endogent lerede RNAs9, kun RNAs, der er blevet transskriberet i mærknings perioden kan renses ved denne metode. Polymeraser sat på pause på gener i hele thiolationstid vil ikke frembringe de tiolerede udskrifter, der kan renses, selv om udskrifter, der er delvist mærket på grund af polymeraser, som kommer ind i eller forlader en pausetilstand under thiolation, kan inddrives. Stammer, der transskribere dårligt, enten på grund af mutation eller vækstbetingelser, producere lille nsRNA, selv om de teknikker, der anvendes her, vil ikke desto mindre forbedre genopretning af nsRNA i forhold til andre metoder. Længere tid og øget kultur volumen kan være nødvendigt i disse stammer og betingelser. Bemærk, at uracil er en god kilde til kvælstof og så denne metode bør ved, før de anvendes til undersøgelser, der involverer kvælstof sult.
Ers4tU-protokollen er især nyttig til analyse af kortvarige RNAs, hvoraf mange er så hurtigt forringet, at de ikke kan identificeres uden at lamme nedbrydnings maskinerne. Eksempler omfatter kryptiske ustabile udskrifter (nedskæringer)4, og korte udskrifter produceret af for tidlig opsigelse eller promotor proksimale pauser18 og antisense transkriptionen "upstream" fra en promotor (prompter)19. De mellemprodukter, der produceres under behandling af stabile RNA-arter, er også forbigående, men kan beriges ved hjælp af ers4tU transskription4. Ers4tU-protokollen er derfor usædvanlig i at tillade meget forbigående RNA-arter, der skal analyseres og fanges under nær fysiologiske forhold, hvilket er en enorm fordel i forhold til andre metoder. Denne teknik er blevet brugt til at studere transkriptionen og downstream-RNA-behandling kinetik i RNA-polymerase-mutanter, der forlænges hurtigere eller langsommere end normalt20.
Thiolation er også kompatibel med RNA-SEQ og SLAM-SEQ21, så alle RNA produceret inden for en meget kort tid vindue, der skal karakteriseres i udsøgte detaljer.

RNA har en dynamisk karakter; snart efter det er produceret meget RNA hurtigt forarbejdes og nedbrydes. I øjeblikket, de fleste undersøgelser af RNA metabolisme analysere den samlede cellulære RNA, der er for det meste fuldt forarbejdet og på Steady State niveau. Dette niveau afhænger af balancen mellem transkription, post-transkriptional modning og nedbrydning. Analyse af de processer, der fører til Steady State ligevægt kræver specialiserede teknikker til at fange meget kortlivede RNA-arter.
Metabolisk mærkning af RNA med nukleotidanaloger såsom 4-thiouracil (4tu) eller 4-thiouridin (4su) (Se Duffy et al.1 for en fremragende anmeldelse), giver mulighed for at isolere thio-mærkede spirende RNAs og deres behandling mellemprodukter. Men, offentliggjorte protokoller indebærer mærkning gange på flere minutter2,3, somer langsom i forhold til produktionshastigheden af mange udskrifter. Det tager i rækkefølgen af et minut til at transskribere den gennemsnitlige gær gen, så mærkning gær RNA for mindre end et minut kan betragtes som ekstremt kort. Den ekstremt hurtige og specifikke 4 thiouracil protokol (ers4tU) maksimerer signal til støj ratio ved at maksimere 4tU inkorporering og minimere inddrivelse af ikke-mærket, præ-eksisterende RNA gør meget kort mærkning gange muligt4.
Den thio-modificerede base skal importeres til cellerne hurtigt og i tilstrækkelig mængde til effektivt at mærke det nyligt syntetiserede RNA (nsRNA). For at fremme dette, celler dyrkes i uracil-fri medium, og udtryk for en passende permease hjælper med at øge 4tU eller 4sU optagelse (Se tabel 1 for en liste over plasmider, som bærer egnede permease gener og supplerende figur 1). 4tU's Opløselighed i natriumhydroxid undgår behovet for giftige organiske opløsningsmidler, der kræves af andre nukleotidanaloger. Desværre er dyrkning af kulturer i lange perioder med thio-modificerede Nukleosider ved koncentrationer større end 50 μM blevet observeret for at forstyrre ribosomer5. Men den koncentration (10 μM), der anvendes her, og de ekstremt korte mærknings tider, minimerer skadelige virkninger5 (figur 1a), mens den stadig giver tilstrækkelig RNA til analyse.
Denne teknik kan kombineres med hurtig og specifik auxin-medieret nedbrydning af et målprotein på6,7 (figur 2), benævnt "β-Est Aid 4U"-protokollen, hvor β-estradiol-reguleret ekspression af auxin- inducerbar degron (støtte) system kombineres med 4tU mærkning. Med β-Est AID 4U-tilgangen kan et målprotein være opbrugt, og virkningen på RNA-metabolismen overvåges nøje (figur 2). Timingen er kritisk; Det er tilrådeligt at se den medfølgende video og være meget opmærksom på figur 2 og dens animerede form (Se supplerende figur 2).
Behandling og nedbrydning af RNA skal stoppes ekstremt hurtigt for nøjagtig tidsopløsning. Dette opnås ved hjælp af methanol ved lav temperatur, som fikserer celleindholdet meget hurtigt og nedbryder cellemembranen, samtidig med at nukleinsyre indholdet bevares8. RNA-ekstraktionen skal være effektiv og ikke beskadige RNA. Mekanisk lysis er effektiv i fravær af chaotropic agenter (ofte disse indeholder thio grupper, så bør undgås). Litium klorid udfældning af RNA foretrækkes, da tRNAs er mindre effektivt fældet. trnas er hurtigt transkriberet og naturligt lerede9, så fjerner trnas reducerer konkurrencen om biotinylering reagens. Hvis små, meget strukturerede RNAs er af interesse, alkohol-baserede RNA nedbør metoder anbefales.
For at genvinde det thiolerede RNA, biotin er kovalent fastgjort via thio grupper indarbejdet i RNA med 4tU. Anvendelse af modificeret biotin som binder via en spalte disulfid obligation (f. eks hpdp-biotin (N-[6-(biotinamido)hexyl]-3 ́-(2 ́-pyridyldithio)propionamid,) eller MTS-biotin (methan thiosulfonat)) anbefales da det tillader frigivelse af RNA ved tilsætning af et reduktionsmiddel. Det biotinylerede RNA er affinitet renset på streptavidin koblet til magnetiske perler. Denne protokol er magen til andre nævnt tidligere10 , men er blevet intensivt optimeret til at reducere baggrunden.
Der findes to typer af thiol-mærknings forsøg, der kan udføres, kontinuerlig og diskontinuerlig mærkning. Hver har sine egne fordele. I kontinuerlig mærkning tilsættes 4tU kulturen og prøverne tages med jævne mellemrum. Denne type eksperiment viser, hvordan RNA behandles, og hvordan niveauerne ændres over tid. Som eksempler kan nævnes sammenligning af mutant med vilde-type eksperimenter og et impuls-Chase eksperiment. De eksperimenter, der er vist i figur 3b, c, er af denne type. For diskontinuerlig mærkning induceres en ændring i systemet, og RNA overvåges. Når ændringen er blevet induceret kulturen skal opdeles i flere sub-kulturer, og på bestemte tidspunkter, hver enkelt er derefter thio-mærket for en kort periode. Et eksempel er β-Est AID 4U vist i figur 27. Denne type eksperiment er især nyttig til at overvåge virkningen af en metabolisk ændring på RNA-behandling (Se figur 3D).
En grafisk gengivelse af et thio-mærknings eksperiment er præsenteret i figur 4 og figur 5, og et regneark, der i høj grad forenkler protokollens ydeevne, er tilgængelig (Se 4tu Experiment template. xlsx). De supplerende oplysninger indeholder også en omfattende fejlfindingsvejledning. For den β-Est AID 4U-protokol, der integrerer 4tU-mærkning med auxin-nedfiskningsprotokollen, se figur 2 og supplerende figur 2. Se Barrass et al.7 for detaljeret Aid depletering protokol.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#946;-mercaptoethanol (&#946;ME)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M3148</td>
			<td >CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25668</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMF (N,N-dimethylformamide)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td >Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EZ-link HPDP Biotin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21341</td>
			<td >Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark &#38; at -20 &#176;C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 &#176;C to resuspend.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Fisher Scientific&#160;</td>
			<td >G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen [20 mg/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10901393001</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>77712</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793620</td>
			<td >10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >63033</td>
			<td >1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >M/4000/PC17</td>
			<td >CAUTION Toxic and flammable</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td rowspan="2">Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-M</td>
			<td>5 M solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol, low pH.&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce Spin Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69702</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SCSM single drop-out &#8211;ura</td>
			<td >Formedium&#160;</td>
			<td >DSCS101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32318-M</td>
			<td>Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td>CAUTION corrosive</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >436143</td>
			<td>CAUTION irritant, do not inhale</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>NEB</td>
			<td>1420S</td>
			<td>Store at 4&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUPERase-In, RNase inhibitor</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See section 1.7 of the protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-thiouracil (4tU)&#160;</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>359930010</td>
			<td>Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >93362</td>
			<td>1 M solutions at various pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>5mg/ml, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base without amino acids&#160; with amonium sulphate</td>
			<td >Formedium</td>
			<td >CYN0410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeba Columns 0.5ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zirconia beads</td>
			<td>Thistle Scientific</td>
			<td>110791052</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beadbeater</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>112011EUR</td>
			<td >Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 &#176;C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="3" >Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H179467N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 50 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td rowspan="2" >Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, 2 mL, screw cap</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>723361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids</td>
			<td>Brand</td>
			<td >781332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)

Nucleotid analog, 4-thiouracil (4tU), er let optages af celler og indarbejdet i RNA, da det er transkriberet in vivo, tillader isolering af RNA produceret i en kort periode med mærkning. Dette gøres ved at knytte en biotin-delen til den inkorporerede thio-gruppe og affinitet rensende, ved hjælp af streptavidin belagt perler. Opnåelse af et godt udbytte af rent, nyligt syntetiseret RNA, der er fri for allerede eksisterende RNA, gør kortere mærknings tider muligt og tillader øget tidsmæssig opløsning i kinetiske undersøgelser. Dette er en protokol til meget specifik, høj udbytte rensning af nyligt syntetiseret RNA. Den protokol, der præsenteres her, beskriver, hvordan RNA udvindes fra gær Saccharomyces cerevisiae. Men protokollen til rensning af lerede RNA fra Total RNA bør være effektiv ved hjælp af RNA fra enhver organisme, når den er blevet udvundet fra cellerne. Det rensede RNA er velegnet til analyse af mange udbredte teknikker, såsom reverse transkriptase-qPCR, RNA-SEQ og SLAM-SEQ. Specificiteten, følsomheden og fleksibiliteten af denne teknik giver uovertruffen indsigt i RNA-metabolisme.

Typiske udbytter for nsRNA genvundet ved hjælp af denne ers4tU-protokol vises i figur 1b, dette er blevet produceret af en bioanalysator, og sporingen viser UDBYTTET af RNA versus Size (nucleotides [NT]). Bemærk, at RNA-genvinding fra tidspunkt 0 er en meget lille del af det, der er genvundet fra længere tidspunkter-ca. 0,3 μg RNA genvundet fra ca. 109 celler sammenlignet med over dobbelt så meget efter blot 30 s mærkning (0,8 μg nsRNA) fra det samme antal celler. RNA opsving på 15 s er mere variabel som små forskelle i udførelsen af prøvetagning har en forholdsmæssigt større effekt på RNA opsving. I bioanalysator sporet kan rRNA-prækursorer ses som et højdepunkt nær 1000 NT og en tvivlet på toppe ved 1700-1800 NT. Den overflod af disse mellemprodukter stiger som tiolation fortsætter.
Thio-mærkning blev anvendt til at kvantificere splejsning af ACT1 transskriptionen (figur 3). Thiolation blev udført, og prøver taget med 15 s intervaller fra starten af thio-mærkningen og behandlingen af ACT1 RNA overvåges (figur 3a, b). Som det kan ses, præ-mRNA genereres (ved transskription), og lariats (ved det første trin af splejset fra præ-mRNA), selv efter blot 15 s af mærkning. Efter ca 45 s til 1 min, mængden af lariats og præ-mRNA nå ligevægt med så meget af disse RNA arter bliver skabt af transskription som behandles væk ved splejning.
For at fremstille de data, der er vist i figur 3c , blev stammen pulseret med 4tu for 25 s og derefter jaget med uridine. Den generation af præ-mRNA og lariats når et maksimum på 1 minut. Dette sammenlignes godt med figur 3b; det maksimale opnås efter 45 s at nå ligevægt plus 25 s af mærkningen. Efter toppen falder niveauerne, når de thio-mærkede RNAs jages gennem splejnings processen.
Figur 3D viser nedbrydningen af en protein splejnings faktor og dens virkning på RNA-metabolismen ved hjælp af β-Est-støtte 4U-systemet6,7. Her, Prp16p er reduceret fra nær fysiologiske niveauer til 5% af dette niveau efter 25 min af udtømning. Prp16p er en essentiel splejnings faktor for andet trin i splejsning15. Lariats fjernes under det andet trin i splejsning (figur 3a), men her stiger de over niveauet af præ-mRNA som Prp16 bliver begrænsende. Ved senere udtynding gange, andre faktorer bliver begrænsende på grund af sekundære virkninger, således at niveauet af Lariat falde, og præ-mRNA niveauer stige. Niveauet af splejset mRNA falder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> Figur 1: vækst i 4tU og RNA opsving. (a) 4-thiouracil påvirker væksten. Øge koncentrationen af 4tU i YMM Drop-out vækstmedium uden uracil øger fordoblingen tid af S. cerevisiae (BY4741) transporterer p4FuiΔPEST plasmid. Vækst i fire replikate kulturer blev overvåget ved 30 °C i en Tecan Infinite Pro 200. Alle kulturer var i log fase hele vejen igennem, med OD600 mellem 0,1 og 0,6. Mock er en kontrolkultur med et tilsvarende beløb af NaOH tilsat, som ikke i sig selv ændre vækstraten. Denne graf viser, at thio-mærkningen er et kompromis mellem hurtig mærkning og beskadigelse af cellen. Fejllinjer er standardfejl på 4 replikater. (b) nsrna-udbyttet stiger lineært fra ca. 15 s mærkning. Den vigtigste figur viser bioanalysator spor af renset, nsRNA fra 0 (ikke thiolated) til 2 min efter tilsætning af 4tU ved 15 s intervaller. Bemærk, at 15 s-prøven ikke er vist, da den ikke kunne skelnes fra den ikke-mærkede prøve. De to store toppe svarer til ribosomale RNAs (rRNAs). RRNA-prækursorer og mellemprodukter er synlige som flere toppe med større molekylvægt end modne rRNAs. Genopretningen af disse prækursorer og mellemprodukter stiger med tiden. Resultaterne fra et repræsentativt eksperiment vises. Den indsatte graf viser genopretning af nsRNA med stigende inkubation med 4tU. Afkastet af nsRNA stiger med stigende tid for vækst med 4tU. Opsvinget er bemærkelsesværdigt lineær (R2 = 0,934) i hele tidsskalaen af dette eksperiment og viser en lille stigning i baggrunden selv ved 15 s mærkning med 4tu, selv om det ikke adskiller sig fra den ikke-mærkede prøve i øjet fra bioanalysator Spore. Fejllinjer viser standardfejl for tre biologiske replikater. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> Figur 2: β-Est Aid 4U β-Est støtte 4U grafisk protokol. Et grafisk Resumé af protokollen for β-Est AID 4U-protokollen. β-estradiol (β-EST) fremmer ekspression af det auxin inducerbare degron (støtte) system, som til gengæld udtømmer en støtte * Tagged Target protein, henvises til Barrass et al.7 for en detaljeret protokol. I dette tilfælde initieres degron system Expression 25 min før protein nedbrydning påbegyndes og thiolation på hvert tidspunkt er i 1 min. prøverne tages før induktion og hvert 2. En animeret version vises i det supplerende figur 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> Figur 3: prækursorer og mellemprodukter af ACT1 RNA-splicing. Splicing af ACT1 præ-mRNA-transskriptioner blev overvåget af kvantitativ reverse TRANSSKRIPTION PCR16. Niveauerne af ACT1 forløber (præ-mRNA), intermediært Lariat-exon2 (Lariat) og splejset produkt (mRNA) vises normaliseret mod niveauet af ACT1 exon2 og Steady State niveauer af disse RNAs. a) placeringen af qPCR-produkter på ACT1 udskriften. Skematisk placering af de qPCR-produkter, der anvendes til analyse af niveauerne af prækursorer, mellemprodukter og præparater af splejsning-reaktionen fra ACT1 -transskriptioner16. Exons er repræsenteret af kasser, intron som en linje og qPCR produkter som linjer med diamanter i begge ender, farven matcher dem, der anvendes i graferne. Den præ-mRNA PCR er specifik for præ-mRNA og ikke nogen mellemprodukter af splejsning som dette produkt krydser filial punkt, som er forstyrret efter det første trin af splejsning. Lariat PCR vil detektere produktet af det første trin i splejsning og den fjernede Lariat produceret efter den anden. MRNA PCR er specifik for produktet af splicing, mRNA. Resultater fra exon PCR (til stede i alle prækursorer, mellemprodukter og varer, bortset fra den fjernede Lariat) er ikke vist i graferne, da dette blev brugt til at normalisere dataene og er derfor altid lig med 1. b) kontinuerlig thiolmærkning. Mængden af præ-mRNA stiger med tiden som 4tu er indarbejdet ved transkriptionen og, efter en kort forsinkelse, splejsning konverterer det til Lariat-exon2 Intermediate og splejset produkter. Niveauerne af disse præ-mRNA og Lariat arter er detekterbare over baggrund efter så lidt som 15 s af vækst med 4tu og nå et maksimum efter ca. 45 s kontinuerlig mærkning med 4tu, på hvilket tidspunkt deres produktion er afbalanceret ved omdannelse til splejset mRNA og/eller nedbrydning. Værdier normaliseret til deres Steady State (venstre-mest punkt i grafen), og exon 2 niveauer for at vise deres udseende og behandling i forhold til transkriptionen af exon 2. Som RNA splejsning af ACT1 er stort set Co-transkriptional4,17 splejset mRNA hurtigt bliver den mest rigelige arter, dens niveau er magen til den af exon 2. Standard fejl af tre biologiske replikater, hver analyseret i tretre. (c) puls/Chase. Tiolation puls på 25 sekunder efterfulgt af Chase med uridine. Sammenlignet med Steady State niveauer af disse RNAs (venstre-mest punkt), de er i første omgang meget rigelige i den nysyntetiserede pulje. Niveauerne gradvist falde, da de er forarbejdet til mRNA (eller forringet), nærmer sig niveauer meget lig Steady State niveauer med 5 min. standard fejl af tre biologiske replikater, hver analyseret i tre eksemplarer. d) nsrna og protein udtømning. Splicing af ACT1 præ-mRNA-udskrifter overvåget ved kvantitativ reverse transkriptionspcr som i panel (a) ved udtømning af Prp16 proteinet ved hjælp af auxin degron-systemet som beskrevet i figur 2. De Prp16 protein niveauer vises også i grafen afbildet mod den anden Y-akse som procentdel af niveauer før auxin nedbrydning. Prp16 er en vital bestanddel af spliceosome, især vigtigt for det andet trin i splejsning vist i panel (a), hvorefter lariats nedbrydes. Når dette trin bliver begrænsende lariats ophobes i første omgang. På et senere tidspunkt splejsning fejler helt, lariats er ikke længere produceres og præ-mRNA niveauer stige. Fejllinjer er standardfejl i tre biologiske replikater, der hver er analyseret i triplicate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> Figur 4: grafisk oversigt over protokollens afsnit 1 til 3. Cellerne er lerede med 4tu og lov til at vokse til at indarbejde den modificerede nucleotid i RNA. En lerede S. pombe Spike kan tilføjes for at tillade normalisering på tværs af tidspunkter og eksperimenter. Pulsen på 4tU kan jages ved hjælp af un-thiolated uridine. Mærkningen kan enten udføres kontinuerligt fra 4tU tilføjelse eller fra en ændring til vækstbetingelser, kultur Split og 4tU føjet til kulturer i stigende tider fra vækst betingelsen forandring, men hver mærkning kun for en kort tid. Cellerne opsamles, og RNA fremstilles fra cellerne, fortrinsvis ved hjælp af en homogenisator og phenol-baserede metoder. RNA er biotinyleret og derefter biotinyleret RNA renset fra uindarbejdet biotin ved hjælp af en størrelses udelukkelse kolonne. NsRNA er nu klar til rensning med streptavidin perler (afsnit 4, figur 5). Tal i rødt svarer til trin numrene i protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> Figur 5: grafisk oversigt over protokollens afsnit 4. Som følge af punkt 1 til 3 (figur 4) blokeres streptavidin-perlerne, og den biotinylerede RNA-prøve tilsættes de tilberedte perler. Den biotinylerede RNA binder sig til streptavidin perler og un-biotinylated RNA fjernet og vasket. Den biotinylerede RNA er elueret fra perlerne ved hjælp af βME og udfældede klar til yderligere forskning. Tal i rødt svarer til trin numrene i protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende figur 1: forbedring af nsRNA-genvinding fra gærceller med og uden yderligere kopier af importøren på 1 og 3 minutter af thio-mærkningen. Bemærk, at Fui1 er gæren egen promotor udtrykt fra en 2 μm plasmid. Den genomiske kopi af dette gen er til stede i begge disse stammer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 2: animeret version af den β-Est Aid 4U β-Est støtte 4U grafisk protokol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 1:4tU_experiment_template. xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmid navn</td>
			<td>Importør/permease</td>
			<td>Markør</td>
			<td>Kommentar</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td rowspan="2">Fui1 importerer uracil og Uridine, hvilket gør den ideel til puls/Chase eksperimenter.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>LEU2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui-ΔPEST</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td>SKADEDYRS motivet i Fui1 er blevet deaktiveret, så permeasen nedbrydes ikke, når der er tilstrækkelig intracellulær uracil til cellens behov. Fungerer godt i mærkningen eksperimenter og forbedrer puls/Chase præstation.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fur</td>
			<td>
S. cerevisiae Fur4</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Uracil permease</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">YEpEBI311</td>
			<td>H. sapiens ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2</td>
			<td rowspan="2">Miller et al.11. Indeholder også et HSV thymidinkinase-gen.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(equilibrative nukleosid-transporter)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Alle plasmider er 2 μm baseret. Alle P4 plasmider og pAT er baseret på pRS16 -serien af plasmid'er. FUI1 og FUR4 udtrykkes fra deres egne, endogene initiativtagere.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Plasmid'er, der anvendes med denne protokol.

Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Brugen af lerede uracil til sensitivt og specifikt rense nyligt transkriberet RNA fra gær Saccharomyces cerevisiae.

Ekstremt hurtig og specifik metabolisk mærkning af RNA in vivo med 4-thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Denne metode er signifikant, fordi ingen anden protokol tillader nysyntet RNA, der skal analyseres på så kort tid, og tillade puls-chase eksperimenter med sådan en kort puls. Denne protokol fungerer godt med protein udtynding, såsom Best AID 4U protokol. Den største fordel er, at baggrunden er lav.Dette giver mulighed for korte mærkningstider ved at fjerne næsten alle de ikke-toilaterede RNA. Den skriftlige protokol beskriver også mange forskellige typer af eksperimenter, der kunne udføres, og hvordan man integrerer dem i denne teknik. For at begynde denne procedure, vokse gær i YMM medium til en OD 600 mellem 0,6 og 0,8.I en røghætte tilsættes en methanol svarende til 30 til 50% af det tilsigtede prøvevolumen til et 50 milliliterrør. Luk rørene stramt, mærke dem, og læg dem på tøris til chill. Dernæst mærke to milliliter rør til langsigtet opbevaring af prøverne og sted på is til afkøling.Tilføj zirkonia perler til de to milliliter rør. Mindst en milliliter vand afkøles pr. prøve på is. Hvis en S.pombe spike skal føjes til kulturen, skal du placere en aliquot af thiolated S.pombe celler på is til at tø op.Vortex den optøede aliquot og tilføje det til kulturen. Derefter tilsættes 4tU til kulturen til en koncentration på 10 mikromolar og bland kraftigt. Thio-label i en periode mellem 15 sekunder og fem minutter.Tag prøver af kulturen med jævne mellemrum til afslutningen af tidsforløbet. Hver prøve tilsættes til et af de forberedte centrifugerør indeholdende methanol. Forsegle hvert rør, ryst for at blande grundigt, og sted på tøris.Når alle prøverne er taget, skal de alle på is. Sørg for, at ingen af prøverne er frosset. Hvis nogen har frosset, varme dem forsigtigt i hånden, mens invertere konstant.Centrifuge cellerne ved 3, 000 gange g og ved fire grader Celsius i to minutter for at pellet cellerne. Hæld væsken af, og resuspend pellet i mindst en milliliter iskoldt vand ved kraftigt pipettering op og ned. Overfør suspensionen til det forberedte skruedæksrør, og rørret på is.Centrifuge prøverne kortvarigt med en hastighed på over 13,000 gange g for at pille cellerne igen. Derefter placere dem tilbage på is, og fjern væsken. Først tilsættes i 400 mikroliter af AE buffer, 40 mikroliter af SDS, og 800 mikroliter af fenol ved en lav pH.Resuspend af vortexing i 10 sekunder. Derefter lyse cellerne i en homogenisator i tre to minutter brister på den laveste effektindstilling. Lad prøverne blive på is i to minutter mellem homogeniseringsimpulserne.Læg de lysede celler på tøris i fem minutter, indtil det størkner. Brug derefter en mikrocentrifuge til at dreje cellerne med en hastighed over 13.000 gange g i fem minutter ved stuetemperatur. Derefter udføres phenolchloroformekstraktion og chloroformekstrakt som beskrevet i tekstprotokollen.Der tilsættes mellem 1/3 til 1/2 af volumenet på 10 molar lithiumchlorid og blandes for at udfælde RNA'et. Centrifuge med en hastighed over 13,000 gange g i fem minutter. Fjern væsken, og drej kortvarigt prøven igen for at fjerne dregs.Vask derefter pellet med 300 til 500 mikroliter på 70% ethanol. Centrifuge den vaskede pellet kort, og fjerne eventuelle resterende ethanol. RNA-pelletet opløses igen i 90 mikroliter TE ved en pH 7.0 ved opvarmning ved 65 grader Celsius, mens den rystes.Efter kontrol for fuld RNA opløselighed, overføre suspensionen til en 0,2 milliliter rør. Til at begynde med biotinylaterer ved at tilsætte 10 mikroliter HPDP-biotinopløsning til RNA'et og blandes grundigt. Inkuberes i mørke ved 65 grader Celsius i 15 til 30 minutter.Derefter forberede en lille harpiks volumen, størrelse udelukkelse kolonne for at udelukke den personlige biotin. Fjern kolonnens nederste mærke, løsn hætten, og placer kolonnen i et centrifugerør med to milliliter. Centrifuge ved 1, 500 gange g i et minut for at skylle bufferen ud og kassere flow-through.Derefter forsigtigt tilføje 0,3 milliliter TE til toppen af kolonnen og spin igen ved hjælp af de samme betingelser. Den vaskede søjle overføres til et friskt 1,5 milliliterrør. Når prøveinkubationen er færdig, skal prøven føjes til toppen af kolonnen.Centrifuge ved 1, 500 gange g i to minutter, hvilket efterlader den biotinylede RNA-prøve i bunden af røret. Kassér kolonnen. Der tilsættes 1/3 til 1/2 volumen af 10 molar lithiumchlorid til det rør, der indeholder prøven.Bland for at fremskynde RNA'et igen. Først opløses RNA'et igen i 200 mikroliter DEPC-behandlet vand. Mål RNA-koncentrationen, og beregn mængderne for hver prøve, der giver lige store mængder RNA for alle prøver.Tilsæt denne mængde RNA til et frisk rør, og tilsæt DEPC-behandlet vand tilbage op til et samlet volumen på 200 mikroliter. Når en prøve er ved stuetemperatur, tilsættes 25 mikroliter på 10 x NaTM buffer, 25 mikroliter af en molar natriumphosphat og 2,5 mikroliter på 10% SDS. Bland grundigt, og centrifuge forsigtigt ved ca 100 gange g i mindre end 30 sekunder.Der forbered to milliliter perlebuffer for hver prøve med en x NaTM-buffer, 0,1 molarnatriumphosphat og 0,1 % SDS. Tilføj 50 mikroliter af streptavidin perler til en lav fastholdelse 1,5 milliliter rør. Placer røret på den magnetiske rack og vente på perlerne til at bosætte sig.Fjern derefter væsken ved aspiration. For at vaske perlerne tilsættes 200 milliliter perlebuffer og vortex, indtil perlepilletlen er fuldt resuspenderet. Centrifuge røret ved ca. 100 gange g i højst fem sekunder.Placer røret i den magnetiske rack for at tillade perlerne at blive fanget af magneten. Fjern væsken ved aspiration, hvis der er et lille antal prøver. Hæld væsken og derefter aspirere, hvis der er mange prøver.Blok med 200 mikroliter perle buffer, 10 mikroliter af glykogen, og 2,5 mikroliter af tRNA. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter, mens den roterende ende over ende ved moderat hastighed. Derefter skal du fjerne væsken og vaske den igen, som beskrevet i tekstprotokollen.Opsalt perlerne i prøven, og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter, mens du roterer. Under denne inkubation klargøres et friskt 1,5 milliliterrør til hver prøve. Der tilsættes 1/10 volumen af tre molarnatriumacetat ved pH 5.3 og 20 mikrogram glykogen.Centrifuge ved ca. 100 gange g i tre sekunder. Fjern det ubundne RNA fra perlerne, og vask dem som beskrevet i tekstprotokollen. For at fremkalde RNA' et tilsættes 50 mikroliter frisklavet 0,7 molar beta mercaptoethanol til perlerne.Efter vortexing og centrifugering, placere gyllen i den magnetiske rack. Pipette RNA'et indeholdende opløsning i de forberedte 1,5 milliliter centrifugerør. Elute endnu en gang som tidligere beskrevet.Derefter anbringes prøven tilbage i den magnetiske rist for at fjerne restperler fra det eluterede RNA og overføre væsken til et frisk, lavt bindingsglas på 0,5 millilitercentrifugerør. Bland prøven. Og derefter tilsættes 2,5 mængder ethanol til at udfælde nsRNA.Efter blanding og inkubering, centrifuge med en hastighed på mindst 13, 000 gange g og ved fire grader Celsius i 20 minutter. Typiske udbytter for snRNA inddrives ved hjælp af denne protokol er vist her. Bemærk, at RNA-genoprettelse på tidspunktet nul er en meget lille del af det, der genvundets fra længere tidspunkter, hvor kun 0,3 mikrogram RNA blev inddrevet fra ca. 30 milliarder celler.Efter blot 30 sekunders mærkning indsamles der dog over dobbelt så meget RNA fra det samme antal celler. I bioanalyseresporingen kan vores RNA-prækursorer ses som et højdepunkt nær 1.000 nukleotider og en doublet toppe ved 1, 700 til 1.800 nukleotider. Den overflod af disse mellemprodukter stiger som thiolation fortsætter.Thiolation udføres derefter med prøver, der udtages med 15 sekunders mellemrum fra starten af thio-mærkning og behandlingen af ACT1 RNA udskrift overvåges. Som det kan ses pre-mRNA og lariater genereres selv efter blot 15 sekunder af mærkning. Efter ca. 45 sekunder til et minut når mængden af lariater og præ-mRNA ligevægt med så meget af disse RNA-arter, der skabes ved transskription, som behandles væk ved splejsning.De sværeste trin er dem, der involverer perler, vask og blokering. Pas på ikke at miste perlerne eller lade dem tørre ud. Når du har renset nyligt syntetiseret RNA, kan du bruge enhver traditionel RNA-analyseprocedure.Det anbefales, at du kører RNA på en bioanalyzer eller lignende. Derefter bruger vi normalt QPCR og RNA-Seq til at analysere RNA. Denne metode viste sig ideel til at analysere kinetik af RNA-behandling.De farligste trin er dem, der bruger fenol og chloroform i RNA-ekstraktionen. Hver gang du bruger disse kemikalier i en uforseglet beholder, så gør det i en røghætte, og bære passende beskyttende tøj, en laboratoriekittel, og handsker. Vær især opmærksom på, at der ikke er nogen zirconia perler i tråden af skruen cap rør, da det vil føre til en lækage.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Meget følsomme og Rapid Fluorescens Detection med en bærbar FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiseret Akustisk Udlevering til seriel fortynding af peptid agonister i Potens Bestemmelse assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Hurtig fluorescens-baserede karakterisering af enkelt ekstracellulære vesikler i humant blod med nanopartikler-tracking analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed mutagenese for In Vitro og i Vivo eksperimenter eksemplificeret med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversættelse af Ribosome affinitets rensning (TRAP) for RNA-isolation fra endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvågning af protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo ved høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Hurtig og omkostningseffektiv RNA udvinding af rotte pancreas væv

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinitetsrensning kombineret med RNA-sekventering i gram-positive bakterier

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mærkning og visualisering af mitokondriegenomudtryksprodukter i Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...