Name: extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00
Duration: 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door Wellcome-financiering aan JB [104648]. Het werk in het Wellcome Center for Cell Biology wordt ondersteund door Wellcome kernfinanciering [092076]. De auteurs erkennen leden van het lab voor hun hulp: Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna de Lucas-Arias en shiney George. De schrijvers willen ook Patrick Cramer bedanken voor de plasmide YEpEBI31111.

<ol>
	<li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine.">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513 (2018).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li><li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity.">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li><li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast.">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li><li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion.">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA's+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression.">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li><li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).</li><li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li><li>R&#228;dle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis,+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture.">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).</li><li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics.">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li><li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system.">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li><li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboSys,+a+high-resolution,+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3&#8242;-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3&#8242;-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li><li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+fast+and+incredibly+close:+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast.">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li><li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters.">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li><li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast.">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li><li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimeLapse-seq:+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding.">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel presenteert een protocol voor zeer snelle en specifieke 4tU-etikettering, voor herstel van ontluikende, nieuw gesynthetiseerde RNA van S. cerevisiae na slechts 15 S van de etikettering, met zeer lage verontreiniging door niet-gelabelde RNA.
De gebruiker moet altijd zorg dragen voor het behoud van de integriteit van het RNA door het gebruik van koude temperaturen en DEPC-behandelde reagentia. Streptavidin kraal zuivering is over het algemeen betrouwbaar; echter, de kraal buffer is moeilijk te hanteren; het moet vers worden gemaakt, met de onderdelen toegevoegd in de juiste volgorde, en niet gekoeld of autoclaved. Veelvoorkomende tekortkomingen zijn dat het RNA niet volledig is opgelost na de neerslag stappen, en dus ofwel niet biotinyated of anderszins verloren is gegaan tijdens de verwerkingsstappen. Er is uitgebreide hulp bij het oplossen van problemen in het aanvullende materiaal.
Er zijn enkele beperkingen om op te letten in ers4tU. Een reeds genoemde is dat 4tU de groei van de gist vertraagt (Figuur 1a). Naast endogeen gethioleerd RNAs9kunnen alleen rna's die tijdens de etiketterings periode zijn getranscribeerd, met deze methode worden gezuiverd. Polymerasen die tijdens de thiolatie tijd op genen zijn onderbroken, produceren geen gethioleerde transcripten die kunnen worden gezuiverd, hoewel transcripten die gedeeltelijk zijn gelabeld als gevolg van polymerasen die tijdens het thiolatie een onderbroken toestand binnenkomen of verlaten, kunnen worden hersteld. Stammen die slecht transcriberen, hetzij vanwege mutatie-of groeiomstandigheden, produceren weinig nsRNA, hoewel de hier gebruikte technieken niettemin het herstel van nsRNA in vergelijking met andere methoden zullen verbeteren. In deze stammen en omstandigheden kan het nodig zijn langere tijden en meer kweek volumes te hebben. Merk op dat uracil een goede bron van stikstof is en dus deze methode moet worden proefgedraaid voordat het wordt gebruikt voor studies waarbij stikstof verhongering.
Het ers4tU-protocol is vooral nuttig voor de analyse van kortstondige Rna's, waarvan er vele zo snel zijn aangetast dat ze niet kunnen worden geïdentificeerd zonder de afbraak machines te verlammen. Voorbeelden zijn cryptische instabiele transcripten (CUTs)4en korte transcripten die worden geproduceerd door vroegtijdige beëindiging of Promoter proximale onderbreken18 en antisense transcriptie "upstream" van een organisator (PROMPTs)19. De tussen producten die worden geproduceerd tijdens de verwerking van stabiele RNA-soorten zijn ook van voorbijgaande aard, maar kunnen worden verrijkt met ers4tU transcriptie4. Het ers4tU-protocol is daarom uitzonderlijk in het toestaan van zeer voorbijgaande RNA-soorten die moeten worden geanalyseerd en gevangen onder in de buurt van fysiologische omstandigheden, wat een enorm voordeel is ten opzichte van andere methoden. Deze techniek is gebruikt om transcriptie en downstream RNA-verwerkings kinetiek te bestuderen in RNA-polymerase mutanten die sneller of langzamer dan normaal20verlengen.
Thiolation is ook compatibel met RNA-SEQ en SLAM-SEQ21, waardoor alle RNA geproduceerd binnen een zeer korte tijdvenster om te worden gekenmerkt in exquise details.

RNA heeft een dynamisch karakter; kort na de productie wordt veel RNA snel verwerkt en afgebroken. Momenteel analyseren de meeste onderzoeken naar RNA metabolisme het totale cellulaire RNA, dat meestal volledig is verwerkt en op steady state niveau. Dit niveau is afhankelijk van het evenwicht tussen de percentages van transcriptie, post-transcriptionele rijping en afbraak. Analyse van de processen die leiden tot het steady state evenwicht vereist gespecialiseerde technieken om zeer kortstondige RNA-soorten vast te leggen.
Metabole etikettering van RNA met nucleotide-analogen zoals 4-thiouracil (4tU) of 4-thiouridine (4sU) (Zie Duffy et al.1 voor een uitstekende beoordeling), biedt de mogelijkheid om thio-gelabelde ontluikende rna's en hun verwerking tussen producten te isoleren. Gepubliceerde protocollen hebben echter betrekking op de etiketterings tijden van een aantal minuten2,3, wat traag is ten opzichte van de productiesnelheid van veel transcripties. Het duurt in de orde van één minuut om het gemiddelde gist-gen te transcriberen, dus het labelen van gist RNA voor minder dan een minuut kan als extreem kort worden beschouwd. Het extreem snelle en specifieke 4 thiouracil Protocol (ers4tU) maximaliseert de signaal-ruis verhouding door het maximaliseren van de 4tU-opname en het minimaliseren van het herstel van ongegelabelde, reeds bestaande RNA, waardoor zeer korte etiketterings tijden mogelijk zijn4.
De thio-gemodificeerde basis moet snel en in voldoende hoeveelheden in de cellen worden geïmporteerd om het nieuw gesynthetiseerde RNA (nsRNA) efficiënt te labelen. Om dit te bevorderen, worden cellen gekweekt in uracil-vrij medium, en expressie van een geschikte permease helpt om 4tU of 4sU opname te stimuleren (Zie tabel 1 voor een lijst van plasmiden die geschikte permease genen en aanvullende figuur 1dragen). 4tU's oplosbaarheid in natriumhydroxide vermijdt de noodzaak van toxische organische oplosmiddelen die nodig zijn voor andere nucleotide-analogen. Helaas is het kweken van culturen voor lange perioden met thio-gemodificeerde nucleosiden in concentraties groter dan 50 μM waargenomen om ribosomen5te verstoren. Echter, de concentratie (10 μM) hier gebruikt, en de extreem korte etiketterings tijden, minimaliseren van schadelijke effecten5 (Figuur 1a), terwijl nog steeds voldoende RNA voor analyse.
Deze techniek kan worden gecombineerd met een snelle en specifieke door auxine gemedieerde depletie van een doelwit proteïne6,7 (Figuur 2), aangeduid als het "β-est Aid 4U"-protocol, waarin de β-Estradiol gereguleerde expressie van de auxine induceerbare cytochromen degron (hulp) systeem wordt gecombineerd met 4tu-labeling. Met de β-est AID 4U-benadering kan een doel proteïne worden uitgeput en het effect op het RNA-metabolisme nauwlettend worden gemonitord (Figuur 2). De timing is van cruciaal belang; het is raadzaam om de begeleidende video te bekijken en aandacht te besteden aan Figuur 2 en zijn geanimeerde vorm (Zie aanvullende figuur 2).
De verwerking en afbraak van RNA moeten extreem snel worden gestopt voor een nauwkeurige tijdresolutie. Dit wordt bereikt met methanol op lage temperatuur, dat de celinhoud zeer snel oplost en het celmembraan degradeert met behoud van het nucleïnezuur gehalte8. De RNA-extractie moet efficiënt zijn en het RNA niet beschadigen. Mechanische lysis is effectief in de afwezigheid van chaotrope agenten (vaak deze bevatten thio groepen, dus moet worden vermeden). Lithium chloride precipitatie van RNA heeft de voorkeur, omdat Trna's minder efficiënt worden neergeprecipiteerd. Trna's worden snel getranscribeerd en natuurlijk gethioleerd9, dus het verwijderen van trnas vermindert de concurrentie voor het biotinylation reagens. Als kleine, sterk gestructureerde Rna's van belang zijn, worden op alcohol gebaseerde RNA-precipitatie methoden aanbevolen.
Om het thiolated RNA te herstellen, wordt Biotine met 4tU covalent bevestigd via de thio-groepen die in het RNA zijn opgenomen. Het gebruik van gemodificeerde biotine, die hecht via een splijtbaar bisulfide binding (bijv. hpdp-Biotine (N-[6-(biotinamido)hexyl]-3 ́-(2 ́-pyridyldithio)propionamide) of MTS-Biotine (methaan thiosulfonaat)) wordt aanbevolen omdat het de vrijlating van het RNA mogelijk maakt door toevoeging van een reduceermiddel. De biotinyleerd RNA is affiniteit gezuiverd op streptavidine gekoppeld aan magnetische kralen. Dit protocol is vergelijkbaar met anderen die eerder zijn vermeld10 , maar is intensief geoptimaliseerd om de achtergrond te verminderen.
Er zijn twee soorten thiol-etiketterings experimenten die kunnen worden uitgevoerd, continue en niet-doorlopende etikettering. Elk heeft zijn eigen voordelen. Bij continue etikettering wordt de 4tU toegevoegd aan de cultuur en monsters genomen met regelmatige tussenpozen. Dit type experiment laat zien hoe het RNA wordt verwerkt en hoe de niveaus in de loop van de tijd veranderen. Voorbeelden hiervan zijn de vergelijking van mutant met wild-type experimenten en een Pulse-Chase experiment. De experimenten getoond in Figuur 3b, c zijn van dit type. Voor niet-continue etikettering wordt een verandering in het systeem geïnduceerd en het RNA bewaakt. Zodra de verandering is teweeggebracht, moet de cultuur worden opgesplitst in verschillende subculturen, en op bepaalde tijdstippen wordt elk voor een korte periode een thio-label genoemd. Een voorbeeld is β-est AID 4U, zoals weergegeven in Figuur 27. Dit type experiment is vooral handig voor het monitoren van het effect van een metabole verandering op RNA-verwerking (Zie figuur 3D).
Een grafische weergave van een thio-labeling-experiment wordt weergegeven in Figuur 4 en Figuur 5, en een werkblad dat de prestaties van het protocol aanzienlijk vereenvoudigt, is beschikbaar (Zie 4tu-experiment sjabloon. xlsx). Naast deze bevat de aanvullende informatie een uitgebreide probleemoplossingsgids. Zie Figuur 2 en aanvullend figuur 2voor het β-est Aid 4U-protocol dat 4tu-etikettering integreert met de auxin Surgery-depletie-protocol. Zie Barrass et al.7 voor het gedetailleerde hulp-depletie-protocol.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#946;-mercaptoethanol (&#946;ME)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M3148</td>
			<td >CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25668</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMF (N,N-dimethylformamide)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td >Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EZ-link HPDP Biotin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21341</td>
			<td >Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark &#38; at -20 &#176;C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 &#176;C to resuspend.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Fisher Scientific&#160;</td>
			<td >G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen [20 mg/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10901393001</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>77712</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793620</td>
			<td >10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >63033</td>
			<td >1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >M/4000/PC17</td>
			<td >CAUTION Toxic and flammable</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td rowspan="2">Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-M</td>
			<td>5 M solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol, low pH.&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce Spin Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69702</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SCSM single drop-out &#8211;ura</td>
			<td >Formedium&#160;</td>
			<td >DSCS101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32318-M</td>
			<td>Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td>CAUTION corrosive</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >436143</td>
			<td>CAUTION irritant, do not inhale</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>NEB</td>
			<td>1420S</td>
			<td>Store at 4&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUPERase-In, RNase inhibitor</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See section 1.7 of the protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-thiouracil (4tU)&#160;</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>359930010</td>
			<td>Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >93362</td>
			<td>1 M solutions at various pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>5mg/ml, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base without amino acids&#160; with amonium sulphate</td>
			<td >Formedium</td>
			<td >CYN0410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeba Columns 0.5ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zirconia beads</td>
			<td>Thistle Scientific</td>
			<td>110791052</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beadbeater</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>112011EUR</td>
			<td >Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 &#176;C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="3" >Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H179467N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 50 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td rowspan="2" >Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, 2 mL, screw cap</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>723361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids</td>
			<td>Brand</td>
			<td >781332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)

Het nucleotide-analogon, 4-thiouracil (4tU), wordt gemakkelijk overgenomen door cellen en opgenomen in RNA zoals het in vivo wordt getranscribeerd, waardoor isolatie van het RNA tijdens een korte periode van etikettering mogelijk is. Dit wordt gedaan door het bevestigen van een Biotine deel van de geïncorporeerde thio groep en affiniteit zuiverende, met behulp van streptavidine gecoate kralen. Het bereiken van een goede opbrengst van zuiver, nieuw gesynthetiseerd RNA dat vrij is van reeds bestaand RNA maakt kortere etiketterings tijden mogelijk en zorgt voor een verhoogde temporele resolutie in kinetische studies. Dit is een protocol voor zeer specifieke, hoge opbrengst zuivering van nieuw gesynthetiseerd RNA. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft hoe RNA wordt geëxtraheerd uit de gist Saccharomyces cerevisiae. Het protocol voor de zuivering van thiolated RNA uit totaal RNA moet echter effectief zijn met behulp van RNA uit elk organisme zodra het uit de cellen is geëxtraheerd. Het gezuiverde RNA is geschikt voor analyse door vele veelgebruikte technieken, zoals reverse transcriptase-qPCR, RNA-SEQ en SLAM-SEQ. De specificiteit, gevoeligheid en flexibiliteit van deze techniek maken ongeëvenaarde inzichten in RNA metabolisme mogelijk.

Typische opbrengsten voor nsRNA hersteld met behulp van dit ers4tU protocol worden weergegeven in afbeelding 1B, dit is geproduceerd door een bioanalyzer en de trace toont rendement van RNA versus grootte (nucleotiden [NT]). Opmerking, in zowel de trace bioanalyzer en de inzet grafiek, dat RNA herstel van tijdpunt 0 is een zeer klein deel van die hersteld van langere tijdpunten-ongeveer 0,3 μg RNA hersteld van ongeveer 109 cellen in vergelijking met meer dan twee keer zo veel na slechts 30 s van etikettering (0,8 μg nsRNA) uit hetzelfde aantal cellen. RNA-herstel bij 15 s is variabeler omdat kleine verschillen in het uitvoeren van de bemonstering een proportioneel groter effect hebben op RNA-herstel. In de bioanalyzer Trace, rRNA precursoren kunnen worden gezien als een piek in de buurt van 1000 NT en een Doublet van pieken om 1700 − 1800 NT. De overvloed van deze tussen producten neemt toe naarmate de thiolatie doorgaat.
Thio-labelling werd gebruikt om splicing van de ACT1 transcriptie te kwantificeren (Figuur 3). Thiolatie werd uitgevoerd en monsters genomen op 15 s intervallen vanaf het begin van thio-labeling en de verwerking van ACT1 RNA bewaakt (Figuur 3a, b). Zoals kan worden gezien, wordt Pre-mRNA gegenereerd (door transcriptie), en lariats (door de eerste stap van het splitsen van Pre-mRNA), zelfs na slechts 15 s van de etikettering. Na ongeveer 45 s tot 1 minuut komen de hoeveelheden lariats en Pre-mRNA in evenwicht met zoveel van deze RNA-soorten die door transcriptie worden gemaakt en worden verwerkt door splicing.
Om de in figuur 3c getoonde gegevens te produceren, werd de stam gepulseerd met 4tu voor 25 sec. en vervolgens achtervolgd met Uridine. De generatie van Pre-mRNA en lariats bereikt een maximum van 1 minuut. Dit vergelijkt goed met Figuur 3b; het maximum wordt bereikt na 45 s om evenwicht te bereiken plus de 25 s van de etikettering. Na de piek dalen de niveaus af naarmate de thio-gelabelde Rna's door het splicing-proces worden achtervolgd.
Figuur 3D toont uitputting van een eiwit-splicings factor en het effect ervan op het RNA-metabolisme, met behulp van het β-est Aid 4U-systeem6,7. Hier, Prp16p wordt verlaagd van de nabije fysiologische niveaus tot 5% van dit niveau na 25 min van uitputting. Prp16p is een essentiële splicing factor voor de tweede stap van splicing15. Lariats worden verwijderd tijdens de tweede stap van splicing (Figuur 3a), maar hier stijgen ze boven het niveau van Pre-mRNA als Prp16 wordt beperkt. Bij latere depletie tijden, andere factoren worden beperkt als gevolg van secundaire effecten, zodat de niveaus van Lariat verminderen, en Pre-mRNA niveaus stijgen. Het niveau van spliced mRNA daalt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> Figuur 1: groei in 4tU en RNA herstel. a) 4-thiouracil beïnvloedt de groei. Verhoging van de concentratie van 4tU in YMM drop-out groeimedium zonder uracil verhoogt de verdubbelingstijd van S. cerevisiae (BY4741) het dragen van de p4FuiΔPEST plasmide. De groei van vier replicaatculturen werd gecontroleerd bij 30 °C in een Tecan Infinite Pro 200. Alle culturen waren in log fase, met OD600 tussen 0,1 en 0,6. Mock is een controlecultuur met een gelijkwaardige hoeveelheid NaOH toegevoegd, wat niet vanzelf de groeisnelheid verandert. Uit deze grafiek blijkt dat thio-labelling een compromis is tussen snelle etikettering en beschadiging van de cel. Foutbalken zijn standaardfout van 4 replicaties. (b) de nsrna-opbrengst stijgt lineair van ongeveer 15 s etikettering. De hoofdfiguur toont de bioanalysesporen van gezuiverd, nsRNA van 0 (niet-thioated) tot 2 min na toevoeging van 4tU op 15 s intervallen. Houd er rekening mee dat het monster van 15 s niet wordt weergegeven, omdat het niet te onderscheiden is van het niet-gelabelde monster. De twee grote pieken corresponderen met ribosomale Rna's (rRNAs). De voorlopers en tussen producten van rRNA zijn zichtbaar als verschillende pieken met een groter molecuulgewicht dan volwassen rrna's. Het herstel van deze precursoren en tussen producten neemt met de tijd toe. Resultaten van één representatief experiment worden weergegeven. De inzet grafiek toont het herstel van nsrna met toenemende incubatie met 4tu. De opbrengst van nsRNA neemt toe met een toenemende groeitijd met 4tU. Het herstel is opmerkelijk lineair (R2 = 0,934) gedurende de tijdschaal van dit experiment en toont een lichte stijging over de achtergrond zelfs bij 15 s etikettering met 4tu hoewel niet te onderscheiden van het ongemerkte monster met oog van de bioanalyzer Trace. Foutbalken tonen standaardfout voor drie biologische replicaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> Figuur 2: het grafische protocol β-est Aid 4U β-est Aid 4U. Een grafische samenvatting van het Protocol van het β-est AID 4U-protocol. β-Estradiol (β-EST) bevordert de uitdrukking van het auxin Surgery-induceerbaar degron (steun) systeem dat op zijn beurt een hulp * gelabeld doeleiwit uitput, zie Barrass et al.7 voor een gedetailleerd protocol. In dit geval wordt de expressie van het degron-systeem gestart 25 minuten voordat de eiwitafbraak begint en de thiolatie op elk tijdstip 1 min. monsters worden genomen vóór inductie en elke 2 minuten tijdens uitputting. Een geanimeerde versie verschijnt in de aanvullende figuur 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> Figuur 3: precursoren en tussen producten van ACT1 RNA splicing. Het splitsen van ACT1 Pre-mRNA transcripten werd gemonitord door kwantitatieve reverse transcriptie PCR16. De niveaus van ACT1 precursor (Pre-mRNA), tussenliggende Lariat-Exon2 (Lariat) en spliced product (mRNA) zijn genormaliseerd tegen het niveau van ACT1 exon2 en steady state niveaus van deze rna's. (a) locatie van qPCR-producten op de ACT1 transcriptie. Schematische voorstelling van de locaties van de qPCR-producten die worden gebruikt voor het testen van de niveaus van precursoren, tussen producten en producten van de splicing-reactie van de ACT1 transcripten16. Exonen worden vertegenwoordigd door dozen, intron als een lijn en de qPCR-producten als lijnen met diamanten aan beide uiteinden, de kleur komt overeen met de kleuren die in de grafieken worden gebruikt. De Pre-mRNA-PCR is specifiek voor Pre-mRNA en geen tussen producten van splicing omdat dit product het vertakkingspunt overschrijdt dat wordt verstoord na de eerste stap van het splitsen. Lariat PCR detecteert het product van de eerste stap van splicing en de uitgesneden Lariat die na de tweede wordt geproduceerd. De mRNA-PCR is specifiek voor het product van splicing, mRNA. De resultaten van de Exon PCR (aanwezig in alle precursoren, tussen producten en producten, behalve de uitgesneden Lariat) worden niet weergegeven in de grafieken omdat dit werd gebruikt om de gegevens te normaliseren en is daarom altijd gelijk aan 1. b) doorlopende thiolabeling. De hoeveelheid Pre-mRNA stijgt met de tijd als 4tU is opgenomen door transcriptie en, na een korte vertraging, het splitsen converteert het naar Lariat-exon2 Intermediate en spliced producten. De niveaus van deze Pre-mRNA en Lariat soorten zijn detecteerbaar boven achtergrond na zo weinig als 15 s van groei met 4tU en bereiken een maximum na ongeveer 45 s van continue etikettering met 4tU, op welk punt hun productie wordt gebalanceerd door conversie naar spliced mRNA en/of afbraak. Waarden worden genormaliseerd naar hun Steady State (links-meest punt van de grafiek), en Exon 2 niveaus om hun verschijning en verwerking te tonen in vergelijking met transcriptie van Exon 2. Aangezien RNA splicing van ACT1 grotendeels co-transcriptional4,17 spliced mRNA snel wordt de meest voorkomende soorten, het niveau is vergelijkbaar met die van Exon 2. Standaardfout van drie biologische replicaten, elk onderzocht in drievat. (c) puls/Chase. Thiolation puls van 25 seconden gevolgd door achtervolging met Uridine. Vergeleken met de steady state niveaus van deze Rna's (linker punt), ze zijn in eerste instantie zeer overvloedig in de nieuw gesynthetiseerde pool. De niveaus dalen geleidelijk als ze worden verwerkt tot mRNA (of afgebroken), naderen van niveaus zeer vergelijkbaar met steady state niveaus door 5 min. standaardfout van drie biologische replicaten, elk in drievand. d) de uitputting van nsrna en eiwitten. Splitsen van ACT1 Pre-mRNA transcripten gecontroleerd door kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR als in panel (a) bij uitputting van het Prp16 eiwit met behulp van het auxin Surgery degron-systeem zoals beschreven in Figuur 2. De Prp16 eiwit niveaus worden ook weergegeven in de grafiek uitgezet tegen de tweede Y-as als percentage van de niveaus vóór de depletie van auxine. Prp16 is een essentieel onderdeel van de spliceosome, vooral belangrijk voor de tweede stap van splicing getoond in panel (a), waarna lariats gedegradeerd zijn. Wanneer deze stap wordt beperkt lariats accumuleren in eerste instantie. Op latere tijdstippen gaat splicing volledig door, lariats worden niet meer geproduceerd en de Pre-mRNA-niveaus stijgen. Foutbalken zijn standaardfout van drie biologische replicaten, elk in drievand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> Figuur 4: grafische samenvatting van het Protocol van de afdelingen 1 tot en met 3. De cellen zijn met 4tU samengevoegd en mogen groeien om de gemodificeerde nucleotide in het RNA op te nemen. Een thiolated S. pombe spike kan worden toegevoegd om normalisering tussentijd punten en experimenten mogelijk te maken. De puls van 4tU kan worden achtervolgd met behulp van un-thiolated Uridine. Etikettering kan worden uitgevoerd continu van 4tU optellen of van een verandering in de groeiomstandigheden, de cultuur Split en 4tU toegevoegd aan culturen in toenemende mate van de groei conditie verandering, maar elke etikettering slechts voor een korte tijd. De cellen worden verzameld, en RNA bereid uit de cellen, bij voorkeur met behulp van een homogenisator en fenol gebaseerde methoden. Het RNA is biotinyleerd en vervolgens de biotinyleerd RNA gezuiverd van het onzuivere Biotine met behulp van een grootte uitsluitings kolom. Het nsRNA is nu klaar voor zuivering met streptavidine kralen (rubriek 4, Figuur 5). Getallen in rood komen overeen met de Stapnummers in het protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> Figuur 5: grafische samenvatting van het protocol sectie 4. Na de secties 1 tot en met 3 (Figuur 4) worden de streptavidine-parels geblokkeerd en wordt het biotinyleerd RNA-monster toegevoegd aan de bereide kralen. De biotinyleerd RNA bindt aan de streptavidine kralen en de un-biotinyleerd RNA verwijderd en gewassen. De biotinyleerd RNA wordt uit de parels geeleerd met behulp van βme en neergeprecipiteerd klaar voor verder onderzoek. Getallen in rood komen overeen met de Stapnummers in het protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullend figuur 1: verbetering van het nsRNA-herstel van gistcellen met en zonder extra kopieën van de importeur op 1 en 3 minuten van thio-labelling. Merk op dat Fui1 de eigen promotor van de gist is, uitgedrukt in een plasmide van 2 μm. De genomische kopie van dit gen is aanwezig in beide stammen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend figuur 2: geanimeerde versie van het grafische protocol β-est Aid 4U β-est Aid 4U. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1:4tU_experiment_template. xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmide naam</td>
			<td>Importeur/permease</td>
			<td>Markering</td>
			<td>Commentaar</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td rowspan="2">Fui1 importeert uracil en Uridine, waardoor het ideaal is voor pulserende/Chase-experimenten.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>LEU2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui-ΔPEST</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Het PLAAG motief van Fui1 is gedeactiveerd, zodat de permease niet wordt afgebroken wanneer er voldoende intracellulaire uracil is voor de behoeften van de cel. Werkt goed in etiketterings experimenten en verbetert de puls/Chase-prestaties.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fur</td>
			<td>
S. cerevisiae Fur4</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Uracil permease</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">YEpEBI311</td>
			<td>H. sapiens ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2</td>
			<td rowspan="2">Miller et al.11. Bevat ook een HSV thymidine kinase-gen.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(equilibratieve nucleoside Transporter)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Alle plasmiden zijn 2 μm gebaseerd. Alle P4 plasmiden en pAT zijn gebaseerd op de pRS16 serie plasmiden. FUI1 en FUR4 worden uitgedrukt uit hun eigen, endogene promotors.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: plasmiden die met dit protocol worden gebruikt.

Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Het gebruik van gethioleerd uracil om gevoelig en specifiek zuivert nieuw Getranscribeerd RNA van de gist Saccharomyces cerevisiae.

Zeer snelle en specifieke metabolische etikettering van RNA in vivo met 4-thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Deze methode is belangrijk omdat geen enkel ander protocol het mogelijk maakt nieuw gesynthetiseerd RNA te analyseren in zo'n korte tijdschaal, en laat puls-chase experimenten met zo'n korte puls. Dit protocol werkt goed met eiwituitputting, zoals het Best AID 4U protocol. Het belangrijkste voordeel is dat de achtergrond laag is.Dit maakt de korte etikettering tijden, door het verwijderen van bijna alle niet-geïsoleerde RNA. Het geschreven protocol beschrijft ook veel verschillende soorten experimenten die kunnen worden uitgevoerd en hoe ze te integreren in deze techniek. Om te beginnen met deze procedure, groeien gist in YMM medium tot een OD 600 tussen 0,6 en 0,8.Voeg in een rookkap een methanol toe die gelijk is aan 30 tot 50% van het beoogde monstervolume aan een buis van 50 milliliter. Sluit de buizen goed, label ze en leg ze op droogijs om te koelen. Vervolgens label twee milliliter buizen voor langdurige opslag van de monsters en plaats op ijs om af te koelen.Voeg zirconia kralen aan de twee milliliter buizen. Koel ten minste een milliliter water per monster op ijs. Als een S.pombe spike moet worden toegevoegd aan de cultuur, plaats een aliquot van thiolated S.pombe cellen op ijs te ontdooien.Vortex de ontdooide aliquot en voeg het toe aan de cultuur. Voeg vervolgens 4tU toe aan de cultuur aan een concentratie van 10 micromolar en meng krachtig. Thio-label voor een tijdsduur tussen 15 seconden en vijf minuten.Neem monsters van de cultuur op regelmatige tijdstippen tot het einde van de tijd cursus. Voeg elk monster toe aan een van de bereide centrifugebuizen met methanol. Verzegel elke buis, schud om grondig te mengen, en plaats op droog ijs.Zodra alle monsters zijn genomen, plaats ze allemaal op ijs. Zorg ervoor dat geen van de monsters bevroren is. Als er een hebben bevroren, verwarm ze zachtjes in de hand, terwijl voortdurend omkeren.Centrifugeren de cellen op 3,000 keer g en op vier graden Celsius gedurende twee minuten om de cellen pellet. Giet de vloeistof, en resuspend de pellet in ten minste een milliliter ijskoud water door krachtig pipetten op en neer. Breng de suspensie over op de voorbereide schroefdopbuis en leg de buis op ijs.Centrifugeren de monsters kort met een snelheid van meer dan 13.000 keer g om de cellen opnieuw te pelleteren. Plaats ze dan terug op ijs, en verwijder de vloeistof. Voeg eerst 400 microliter AE-buffer, 40 microliter SDS en 800 microliter fenol toe bij een lage pH.Resuspend door vortexing voor 10 seconden. Vervolgens lyse de cellen in een homogenisator gedurende drie twee minuten barst op de laagste macht instelling. Laat de monsters twee minuten op ijs liggen tussen homogenisatiepulsen.Plaats de gelyseerde cellen vijf minuten op droogijs totdat het stolt. Gebruik vervolgens een microcentrifuge om de cellen vijf minuten lang met een snelheid van meer dan 13.000 keer g te draaien bij kamertemperatuur. Voer hierna fenolchloroforme extractie en chloroforme extractie uit, zoals beschreven in het tekstprotocol.Voeg tussen 1/3 tot 1/2 van het volume van 10 molaire lithiumchloride toe en meng om het RNA neer te hevelen. Centrifuge met een snelheid van meer dan 13.000 keer g gedurende vijf minuten. Verwijder de vloeistof en draai het monster kort opnieuw om de dregs te verwijderen.Was vervolgens de pellet met 300 tot 500 microliter van 70% ethanol. Centrifugeren de gewassen pellet kort, en verwijder de resterende ethanol. Los de RNA-pellet opnieuw op in 90 microliter van TE bij een pH 7.0 door tijdens het schudden bij 65 graden Celsius te verwarmen.Na controle op volledige RNA-oplosing, breng de suspensie over naar een buis van 0,2 milliliter. Om te beginnen, biotinylaat door het toevoegen van 10 microliters van HPDP-biotine oplossing aan het RNA en meng grondig. Incubeer in het donker op 65 graden Celsius gedurende 15 tot 30 minuten.Bereid vervolgens een klein harsvolume voor, de uitsluitingskolom van de grootte om de biotine zonder rechtspersoonlijkheid uit te sluiten. Verwijder de onderste tag van de kolom, maak de dop los en plaats de kolom in een twee milliliter centrifugebuis. Centrifuge op 1,500 keer g gedurende een minuut om de buffer weg te spoelen en de doorstroom weg te gooien.Voeg vervolgens voorzichtig 0,3 milliliter TE toe aan de bovenkant van de kolom en draai opnieuw met dezelfde voorwaarden. Breng de gewassen kolom over in een verse buis van 1,5 milliliter. Wanneer de incubatie van het monster is voltooid, voegt u het monster toe aan de bovenkant van de kolom.Centrifuge op 1,500 keer g gedurende twee minuten, waardoor het biotinylated RNA monster op de bodem van de buis. Gooi de kolom weg. En voeg 1/3 tot 1/2 volume van 10 molaire lithiumchloride toe aan de buis die het monster bevat.Meng om het RNA opnieuw neer te halen. Los eerst het RNA opnieuw op in 200 microliter van DEPC-behandeld water. Meet de RNA-concentratie en bereken de volumes voor elk monster dat voor alle monsters gelijke hoeveelheden RNA geeft.Voeg deze hoeveelheid RNA toe aan een verse buis en voeg de DEPC-behandelde water weer toe tot een totaal volume van 200 microliter. Wanneer een monster op kamertemperatuur is, voegt u 25 microliter van 10 x NaTM-buffer, 25 microliter van één molair natriumfosfaat en 2,5 microliter van 10% SDS toe. Meng grondig, en centrifugeer zachtjes op ongeveer 100 keer g gedurende minder dan 30 seconden.Bereid twee milliliter kraalbuffer voor elk monster met één x NaTM-buffer, 0,1 molair natriumfosfaat en 0,1%SDS. Voeg 50 microliter streptavidin kralen toe aan een lage retentie 1,5 milliliter buis. Plaats de buis op het magnetische rek en wacht tot de kralen zich nestelen.Verwijder vervolgens de vloeistof door aspiratie. Om de kralen te wassen, voeg 200 milliliter kraalbuffer en vortex toe totdat de kraalpel is volledig opnieuw opgebouwd. Centrifugeren de buis op ongeveer 100 keer g gedurende een maximum van vijf seconden.Plaats de buis in het magnetische rek zodat de kralen door de magneet kunnen worden opgevangen. Verwijder de vloeistof door aspiratie als er een klein aantal monsters. Giet de vloeistof en vervolgens aanzuigen als er veel monsters.Blok met 200 microliter kraalbuffer, 10 microliter glycogeen en 2,5 microliter tRNA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, terwijl draaien einde over einde op matige snelheid. Verwijder hierna de vloeistof en was opnieuw, zoals beschreven in het tekstprotocol.Resuspend de kralen in het monster, en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tijdens het draaien. Bereid tijdens deze incubatie een verse buis van 1,5 milliliter voor elk monster. Voeg 1/10 volume van drie molaire natriumacetaat toe bij pH 5,3 en 20 microgram glycogeen.Centrifuge op ongeveer 100 keer g gedurende drie seconden. Verwijder het niet-gebonden RNA uit de kralen en was ze zoals beschreven in het tekstprotocol. Om het RNA te elute, voeg 50 microliters van vers bereide 0,7 molaire beta mercaptoethanol aan de kralen.Na vortexen en centrifugeren, plaats de drijfmest in het magnetische rek. Pipette de RNA met oplossing in de voorbereide 1,5 milliliter centrifugebuizen. Elute nogmaals zoals eerder beschreven.Plaats vervolgens het monster terug in het magnetische rek om restkralen uit het geëderde RNA te verwijderen en breng de vloeistof over naar een verse, lage binding van 0,5 milliliter centrifugebuis. Meng het monster. En voeg dan 2,5 volumes ethanol toe om nsRNA neer te nemen.Na het mengen en uitbroeden, centrifugeren met een snelheid van ten minste 13,000 keer g en op vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Typische opbrengsten voor snRNA hersteld met behulp van dit protocol worden hier weergegeven. Merk op dat RNA herstel op tijd punt nul is een zeer klein deel van dat hersteld van langere tijd punten met slechts 0,3 microgram RNA wordt teruggewonnen uit ongeveer 30 miljard cellen.Na slechts 30 seconden van etikettering, echter, meer dan twee keer zoveel RNA wordt verzameld uit hetzelfde aantal cellen. In de bioanalyzer spoor, onze RNA precursoren kunnen worden gezien als een piek in de buurt van 1,000 nucleotiden en een doublet van pieken op 1, 700 tot 1, 800 nucleotiden. De overvloed van deze tussenproducten neemt toe naarmate thiolatie doorgaat.Thiolatie wordt vervolgens uitgevoerd met monsters die worden genomen met intervallen van 15 seconden vanaf het begin van thio-labeling en de verwerking van ACT1 RNA transcriptie wordt gecontroleerd. Zoals te zien is worden pre-mRNA en lariats gegenereerd, zelfs na slechts 15 seconden van etikettering. Na ongeveer 45 seconden tot een minuut, de hoeveelheid lariats en pre-mRNA bereiken evenwicht met zo veel van deze RNA soorten worden gemaakt door transcriptie als worden verwerkt weg door splicing.De moeilijkste stappen zijn die waarbij de kralen, wassen, en blokkeren. Wees voorzichtig niet te verliezen van de kralen, of om ze te laten uitdrogen. Zodra u nieuw gesynthetiseerd RNA hebt gezuiverd, u elke traditionele RNA-analyseprocedure gebruiken.Het wordt aanbevolen dat u het RNA op een bioanalyzer of iets dergelijks uitvoert. Daarna gebruiken we normaal gesproken QPCR en RNA-Seq om het RNA te analyseren. Deze methode bleek ideaal voor het analyseren van de kinetiek van RNA verwerking.De gevaarlijkste stappen zijn die met fenol en chloroform in de RNA-extractie. Elke keer dat u deze chemische stoffen in een onverzegelde container, doe dit in een rookkap, en draag passende beschermende kleding, een lab jas, en handschoenen. Wees er met name op toe dat er geen zirconia kralen in de draad van de schroefdop buis, want dat zal leiden tot een lek.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Uiterst gevoelige en Rapid fluorescentiedetectie met een Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Snelle fluorescentie gebaseerde karakterisering van één extracellulaire blaasjes in menselijk bloed met Nanoparticle-tracking analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Het vertalen van ribosome Affiniteits zuivering (TRAP) voor RNA-isolatie van endotheel cellen in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Snelle en kosteneffectieve RNA-extractie van rattenlelfum

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinity Zuivering in combinatie met RNA Sequencing in Gram-Positieve Bacteriën

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...