Name: extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00
Duration: 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le financement de Wellcome à JB [104648]. Les travaux du Wellcome Centre for Cell Biology sont appuyés par le financement de base de Wellcome [092076]. Les auteurs reconnaissent les membres du laboratoire pour leur aide : Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna De Lucas-Arias et Shiney George. Les auteurs souhaitent également remercier Patrick Cramer pour le plasmien YEpEBI31111.

<ol>
	<li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine.">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513 (2018).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li><li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity.">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li><li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast.">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li><li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion.">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA's+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression.">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li><li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).</li><li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li><li>R&#228;dle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis,+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture.">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).</li><li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics.">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li><li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system.">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li><li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboSys,+a+high-resolution,+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3&#8242;-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3&#8242;-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li><li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+fast+and+incredibly+close:+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast.">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li><li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters.">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li><li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast.">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li><li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimeLapse-seq:+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding.">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li></ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Cet article présente un protocole pour l'étiquetage 4tU extrêmement rapide et spécifique, pour la récupération de l'ARN naissant et nouvellement synthétisé de S. cerevisiae après aussi peu que 15 s d'étiquetage, avec la contamination très faible par l'ARN non étiqueté.
L'utilisateur doit toujours prendre soin de maintenir l'intégrité de l'ARN par l'utilisation de températures froides et de réactifs traités par LE DEPC. La purification de perle de Streptavidin est généralement fiable ; cependant, le tampon de perles est difficile à manipuler; il doit être fait fraîchement, avec ses composants ajoutés dans le bon ordre, et non réfrigéré ou autoclaved. Les défaillances courantes comprennent l'ARN étant incomplètement dissous après les étapes de précipitation, et donc n'étant pas biotinylated ou autrement perdu pendant les étapes de traitement. Il y a une aide importante de dépannage dans le matériel supplémentaire.
Il y a quelques limites à connaître dans ers4tU. Un déjà mentionné est que 4tU ralentit la croissance de la levure (Figure 1a). En dehors des ARN endogènement thiolés9, seuls les ARN qui ont été transcrits pendant la période d'étiquetage peuvent être purifiés par cette méthode. Les polymères en pause sur les gènes tout au long du temps de thiolation ne produiront pas de transcriptions thiolées qui peuvent être purifiées, bien que les transcriptions qui sont partiellement étiquetées en raison de polymères entrant ou sortant d'un état de pause pendant la thiolation peuvent être récupérées. Les souches qui transcrivent mal, soit en raison de mutations ou de conditions de croissance, produisent peu de nsARN, bien que les techniques utilisées ici permettra néanmoins d'améliorer la récupération de l'ARNN par rapport à d'autres méthodes. Des temps plus longs et des volumes de culture accrus peuvent être nécessaires dans ces souches et conditions. Notez que l'uracil est une bonne source d'azote et donc cette méthode doit être testé avant d'être utilisé pour des études impliquant la famine d'azote.
Le protocole ers4tU est particulièrement utile pour l'analyse des ARN de courte durée, dont beaucoup sont si rapidement dégradés qu'ils ne peuvent pas être identifiés sans paralyser la machinerie de dégradation. Les exemples incluent les transcriptions instables cryptiques (CUTs)4, et les transcriptions courtes produites par la terminaison prématurée ou la rupture proximale de promoteur18 et la transcription antisens « en amont » d'un promoteur (PROMPTs)19. Les intermédiaires produits lors du traitement des espèces d'ARN stables sont également transitoires mais peuvent être enrichis à l'aide de la transcription ers4tU4. Le protocole ers4tU est donc exceptionnel en permettant l'analyse et la capture d'espèces d'ARN très transitoires dans des conditions physiologiques proches, ce qui est un énorme avantage par rapport aux autres méthodes. Cette technique a été utilisée pour étudier la transcription et la cinétique de traitement de l'ARN en aval chez les mutants de polymérase d'ARN qui s'allongent plus rapidement ou plus lentement que la normale20.
La thiolation est également compatible avec L'ARN-seq et SLAM-seq21, permettant à tous les ARN produits dans une fenêtre de temps très courte d'être caractérisés dans le détail exquis.

L'ARN a une nature dynamique; peu de temps après sa production, beaucoup d'ARN est rapidement traité et dégradé. Actuellement, la plupart des études du métabolisme de l'ARN analysent l'ARN cellulaire total, qui est la plupart du temps entièrement traité et à un niveau d'état stable. Ce niveau dépend de l'équilibre entre les taux de transcription, de maturation post-transcriptionnelle et de dégradation. L'analyse des processus qui mènent à l'équilibre régulier de l'état nécessite des techniques spécialisées pour capturer des espèces d'ARN de très courte durée.
L'étiquetage métabolique de l'ARN avec des analogues nucléotides tels que 4-thiouracil (4tU) ou 4-thiouridine (4sU) (voir Duffy et al.1 pour un excellent examen), offre la capacité d'isoler les ARN naissants thio-étiquetés et leurs intermédiaires de traitement. Cependant, les protocoles publiés impliquent des temps d'étiquetage de plusieurs minutes2,3, ce qui est lent par rapport au taux de production de nombreuses transcriptions. Il faut de l'ordre d'une minute pour transcrire le gène de levure moyen, de sorte que l'étiquetage de l'ARN de levure pour moins d'une minute peut être considéré comme extrêmement court. Le protocole 4 thiouracil extrêmement rapide et spécifique (ers4tU) maximise le rapport signal/bruit en maximisant l'incorporation 4tU et en minimisant la récupération de l'ARN préexistant non étiqueté, ce qui rend les temps d'étiquetage très courts possibles4.
La base thio-modifiée doit être importée dans les cellules rapidement et en quantité suffisante pour étiqueter efficacement l'ARN nouvellement synthétisé (nsRNA). Pour promouvoir cela, les cellules sont cultivées dans un milieu sans uracil, et l'expression d'une permease appropriée aide à stimuler l'utilisation de 4tU ou 4sU (voir le tableau 1 pour une liste de plasmides qui portent des gènes de permease appropriés et la figure supplémentaire 1). La solubilité de 4tU dans l'hydroxyde de sodium évite le besoin de solvants organiques toxiques requis par d'autres analogues de nucléotide. Malheureusement, on a observé des cultures de plus en plus fortes pendant de longues périodes avecdes nucléosides modifiés à des concentrations supérieures à 50 M. pour perturber les ribosomes 5. Cependant, la concentration (10 m) utilisée ici, et les temps d'étiquetage extrêmement courts, minimisent les effets délétères5 (figure 1a), tout en produisant suffisamment d'ARN pour l'analyse.
Cette technique peut être combinée à un appauvrissement rapide et spécifique d'une protéine cible6,7 ( figure2), appelé le protocole « AID 4U » ( ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' système de dégron inductible (AID) est combiné avec l'étiquetage 4tU. Avec l'approche DE l'AID 4U, une protéine cible peut être épuisée et l'effet sur le métabolisme de l'ARN est étroitement surveillé (Figure 2). Le moment est crucial; il est conseillé de visionner la vidéo d'accompagnement et de porter une attention particulière à la figure 2 et à sa forme animée (voir la figure supplémentaire 2).
Le traitement et la dégradation de l'ARN doivent être arrêtés extrêmement rapidement pour une résolution précise du temps. Ceci est réalisé en utilisant le méthanol à basse température, qui fixe le contenu cellulaire très rapidement et dégrade la membrane cellulaire tout en préservant la teneur en acide nucléique8. L'extraction de l'ARN doit être efficace et ne pas endommager l'ARN. La lyse mécanique est efficace en l'absence d'agents chaotropes (souvent ceux-ci contiennent des groupes de thio, donc doivent être évités). La précipitation de chlorure de lithium de l'ARN est préférée, car les ARNt sont moins efficacement précipités. Les ARNt sont rapidement transcrits et naturellement thiolés9, de sorte que l'élimination des ARNt réduit la concurrence pour le réactif de biotinylation. Si de petites ARN hautement structurées sont intéressantes, des méthodes de précipitation à base d'alcool sont recommandées.
Pour récupérer l'ARN thiolé, la biotine est covalently attachée par l'intermédiaire des groupes de thio incorporés dans l'ARN avec 4tU. L'utilisation de la biotine modifiée, qui se fixe par l'intermédiaire d'une liaison de disulfure clevabable (par exemple, HPDP-biotine (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3 --(2 pyridyldithio)propionamide, ) ou MTS-biotine (Méthane thiosulfonate) est recommandée car il permet la libération de l'ARN par l'ajout d'un agent réducter. L'ARN biotinylated est affinité purifiée sur le streptavidin couplé aux perles magnétiques. Ce protocole est similaire à d'autres énumérés précédemment10, mais a été intensivement optimisé pour réduire l'arrière-plan.
Il existe deux types d'expériences d'étiquetage thiol qui peuvent être effectuées, l'étiquetage continu et discontinu. Chacun a ses propres avantages. Dans l'étiquetage continu, le 4tU est ajouté à la culture et les échantillons prélevés à intervalles réguliers. Ce type d'expérience montre comment l'ARN est traité et comment les niveaux changent au fil du temps. Par exemple, la comparaison de mutants avec des expériences de type sauvage et une expérience de chasse aux impulsions. Les expériences présentées dans Figure 3b,c sont de ce type. Pour l'étiquetage discontinu, un changement est induit dans le système et l'ARN surveillé. Une fois que le changement a été induit, la culture doit être divisée en plusieurs sous-cultures, et à des moments précis, chacune est ensuite thio-étiquetée pendant une brève période. Un exemple est l'AID 4U de l'est montré à la figure 27. Ce type d'expérience est particulièrement utile pour surveiller l'effet d'un changement métabolique sur le traitement de l'ARN (voir La figure 3d).
Une représentation graphique d'une expérience de thio-étiquetage est présentée dans la figure 4 et la figure 5, et une feuille de calcul qui simplifie considérablement les performances du protocole est disponible (voir 4tU experiment template.xlsx). En outre, l'information supplémentaire contient un guide de dépannage complet. Pour le protocole AID 4U qui intègre l'étiquetage 4tU au protocole d'épuisement des émadés, voir Figure 2 et Figure 2 supplémentaire. Voir Barrass et coll.7 pour le protocole détaillé d'épuisement de l'AID.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#946;-mercaptoethanol (&#946;ME)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M3148</td>
			<td >CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25668</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMF (N,N-dimethylformamide)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td >Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EZ-link HPDP Biotin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21341</td>
			<td >Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark &#38; at -20 &#176;C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 &#176;C to resuspend.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Fisher Scientific&#160;</td>
			<td >G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen [20 mg/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10901393001</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>77712</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793620</td>
			<td >10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >63033</td>
			<td >1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >M/4000/PC17</td>
			<td >CAUTION Toxic and flammable</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td rowspan="2">Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-M</td>
			<td>5 M solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol, low pH.&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce Spin Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69702</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SCSM single drop-out &#8211;ura</td>
			<td >Formedium&#160;</td>
			<td >DSCS101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32318-M</td>
			<td>Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td>CAUTION corrosive</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >436143</td>
			<td>CAUTION irritant, do not inhale</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>NEB</td>
			<td>1420S</td>
			<td>Store at 4&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUPERase-In, RNase inhibitor</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See section 1.7 of the protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-thiouracil (4tU)&#160;</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>359930010</td>
			<td>Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >93362</td>
			<td>1 M solutions at various pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>5mg/ml, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base without amino acids&#160; with amonium sulphate</td>
			<td >Formedium</td>
			<td >CYN0410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeba Columns 0.5ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zirconia beads</td>
			<td>Thistle Scientific</td>
			<td>110791052</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beadbeater</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>112011EUR</td>
			<td >Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 &#176;C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="3" >Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H179467N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 50 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td rowspan="2" >Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, 2 mL, screw cap</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>723361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids</td>
			<td>Brand</td>
			<td >781332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)

L'analogue nucléotide, 4-thiouracil (4tU), est facilement pris en charge par les cellules et incorporé dans l'ARN car il est transcrit in vivo, permettant l'isolement de l'ARN produit au cours d'une brève période d'étiquetage. Ceci est fait en attachant un moiety de biotine au groupe incorporé de thio et à la purification d'affinité, utilisant des perles enduites de streptavidin. L'obtention d'un bon rendement de l'ARN pur et nouvellement synthétisé qui est exempt de l'ARN préexistant permet des temps d'étiquetage plus courts et permet une résolution temporelle accrue dans les études cinétiques. Il s'agit d'un protocole pour la purification très spécifique et à haut rendement de l'ARN nouvellement synthétisé. Le protocole présenté ici décrit comment l'ARN est extrait de la levure Saccharomyces cerevisiae. Cependant, le protocole pour la purification de l'ARN thiolé de l'ARN total devrait être efficace en utilisant l'ARN de n'importe quel organisme une fois qu'il a été extrait des cellules. L'ARN purifié est approprié pour l'analyse par beaucoup de techniques largement utilisées, telles que transcriptase-qPCR inversé, RNA-seq et SLAM-seq. La spécificité, la sensibilité et la flexibilité de cette technique permettent des connaissances inégalées sur le métabolisme de l'ARN.

Les rendements typiques de l'ARNN récupéré à l'aide de ce protocole ers4tU sont affichés dans la figure 1b,ceci a été produit par un bioanalyseur et la trace montre le rendement de l'ARN par rapport à la taille (nucléotides [nt]). Notez, à la fois dans la trace bioanalyseur et le graphique enset, que la récupération de l'ARN à partir du point de temps 0 est une très petite partie de celle récupérée à partir de points de temps plus longs - environ 0,3 g d'ARN récupéré à partir d'environ 109 cellules par rapport à plus de deux fois plus après seulement 30 s d'étiquetage (0,8 g de nsARN) à partir du même nombre de cellules. La récupération de l'ARN à 15 s est plus variable car de petites différences dans l'exécution de l'échantillonnage ont un effet proportionnellement plus grand sur la récupération de l'ARN. Dans la trace de bioanalyseur, les précurseurs de l'ARNr peuvent être considérés comme un pic proche de 1000 nt et un doublet de pics à 1700-1800 nt. L'abondance de ces intermédiaires augmente à mesure que la thiolation se poursuit.
Thio-étiquetage a été utilisé pour quantifier l'épissage de la transcription ACT1 (figure 3). La thiolation a été effectuée et des échantillons prélevés à intervalles de 15 s depuis le début du thio-étiquetage et le traitement de l'ARN ACT1 surveillés (Figure 3a,b). Comme on peut le voir, le pré-ARNm est généré (par transcription), et les lariats (par la première étape de l'épissage à partir de pré-ARNm), même après seulement 15 s d'étiquetage. Après environ 45 s à 1 min, les quantités de lariats et de pré-ARNm atteignent l'équilibre avec autant de ces espèces d'ARN étant créées par transcription que sont traitées loin par épissage.
Pour produire les données indiquées dans la figure 3c, la souche a été pulsée avec 4tU pendant 25 s, puis chassée avec de l'uridine. La génération de pré-ARNm et de lariats atteint un maximum à 1 minute. Cela se compare bien à la figure 3b; le maximum atteint après 45 s pour atteindre l'équilibre plus les 25 s de l'étiquetage. Après le pic, les niveaux diminuent à mesure que les ARN étiquetés thio sont poursuivis à travers le processus d'épissage.
La figure 3d montre l'épuisement d'un facteur d'épissage des protéines et son effet sur le métabolisme de l'ARN, à l'aide du système AID 4U6,7. Ici, Prp16p est réduit de niveaux physiologiques proches à 5% de ce niveau après 25 min d'épuisement. Prp16p est un facteur d'épissage essentiel pour la deuxième étape de l'épissage15. Les lariats sont enlevés au cours de la deuxième étape de l'épissage (Figure 3a), mais ici ils augmentent au-dessus du niveau de pré-ARNm que Prp16 devient limitant. Aux périodes d'épuisement plus tard, d'autres facteurs deviennent limitants en raison des effets secondaires, de sorte que les niveaux de diminution de lariat, et les niveaux de pré-arnas augmentent. Le niveau d'ARNm épissé diminue.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> Figure 1 : Croissance de la récupération de l'INM 4tU et de l'ARN. (a) 4-thiouracil affecte la croissance. L'augmentation de la concentration de 4tU dans le milieu de croissance de décrochage de YMM sans uracil augmente le temps de doublement de S. cerevisiae (BY4741) portant le plasmide p4Fui-PEST. La croissance de quatre cultures répliquées a été surveillée à 30 oC dans un Tecan Infinite Pro 200. Toutes les cultures étaient en phase de journal tout au long, avec OD600 entre 0,1 et 0,6. Mock est une culture de contrôle avec une quantité équivalente de NaOH ajouté, qui ne change pas en soi le taux de croissance. Ce graphique démontre que le thio-étiquetage est un compromis entre l'étiquetage rapide et les dommages à la cellule. Les barres d'erreur sont des erreurs standard de 4 répliques. (b) le rendement de l'ARNn augmente linéairement d'environ 15 s d'étiquetage. La figure principale montre les traces bio-analyseurs de purifié, nsRNA de 0 (non thiolé) à 2 min après l'ajout de 4tU à 15 s intervalles. Notez que l'échantillon de 15 s n'est pas montré, car il était indiscernable de l'échantillon non étiqueté. Les deux grands pics correspondent à des ARN ribosomal (RARN). Les précurseurs et les intermédiaires de l'ARNr sont visibles à mesure que plusieurs pics ont un poids moléculaire plus élevé que les RARN matures. La récupération de ces précurseurs et intermédiaires augmente avec le temps. Les résultats d'une expérience représentative sont présentés. Le graphique enset montre la récupération de nsRNA avec l'incubation croissante avec 4tU. Le rendement de nsRNA augmente avec l'augmentation du temps de croissance avec 4tU. La récupération est remarquablement linéaire (R2 - 0,934) tout au long de la durée de cette expérience et montre une légère augmentation sur le fond, même à 15 s étiquetage avec 4tU, même si elle n'est pas distinguable de l'échantillon non étiqueté à l'œil du bioanalyseur retrouver. Les barres d'erreur affichent l'erreur standard pour trois répliques biologiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> Figure 2 : protocole graphique AID 4U et est AID 4U. Un résumé graphique du protocole du protocole AID 4U. Le système de dégron inductible auxine (AID) qui, à son tour, épuise une protéine cible étiquetée AIDMD, se réfère à Barrass et al.7 pour un protocole détaillé. Dans ce cas, l'expression du système de dégron est initiée 25 min avant le début de la dégradation des protéines et la thiolation à chaque moment est de 1 min. Les échantillons sont prélevés avant l'induction et toutes les 2 minutes pendant l'épuisement. Une version animée apparaît dans la figure supplémentaire 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> Figure 3 : Précurseurs et intermédiaires de l'épissage de l'ARN ACT1. L'épissage des transcriptions pré-ARNm ACT1 a été surveillé par la transcription inverse quantitative PCR16. Les niveaux de précurseur d'ACT1 (pré-ARNm), de lariat-exon2 intermédiaire (Lariat) et de produit épissé (ARNM) sont montrés normalisés par rapport au niveau d'ACT1 Exon2 et aux niveaux d'état stables de ces ARN. (a) Emplacement des produits qPCR sur la transcription ACT1. Schéma des emplacements des produits qPCR utilisés pour évaluer les niveaux de précurseurs, intermédiaires et produits de la réaction épissage des transcriptions ACT1 16. Exons sont représentés par des boîtes, intron comme une ligne et les produits qPCR comme des lignes avec des diamants à chaque extrémité, la couleur correspond à ceux utilisés dans les graphiques. Le PCR pré-ARNm est spécifique pour pré-ARNm et non pas tous les intermédiaires de l'épissage que ce produit traverse le point de branche qui est perturbé après la première étape de l'épissage. Lariat PCR détectera le produit de la première étape de l'épissage et le lariat excisé produit après la seconde. L'ARNm PCR est spécifique pour le produit de l'épissage, l'ARNm. Les résultats de l'exon PCR (présent dans tous les précurseurs, intermédiaires et produits, à l'exception du lariat excisé) ne sont pas indiqués dans les graphiques car cela a été utilisé pour normaliser les données et est donc toujours égal à 1. (b) Thiolabelling continu. La quantité de pré-ARNm augmente avec le temps que 4tU est incorporé par transcription et, après un court délai, l'épissage convertit en lariat-exon2 produits intermédiaires et épissés. Les niveaux de ces espèces pré-ARNm et lariat sont détectables au-dessus de l'arrière-plan après aussi peu que 15 s de croissance avec 4tU et atteignent un maximum après environ 45 s d'étiquetage continu avec 4tU, à quel point leur production est équilibrée par la conversion à épissage l'ARNm et/ou la dégradation. Les valeurs sont normalisées à leur état stable (point le plus à gauche du graphique), et exon 2 niveaux pour montrer leur apparence et le traitement par rapport à la transcription de l'exon 2. Comme l'épissage de l'ARN d'ACT1 est en grande partie co-transcriptionnel4,17 ARNm épissé devient rapidement l'espèce la plus abondante, son niveau est similaire à celui de l'exon 2. Erreur standard de trois répliques biologiques, chacune a été admis en triple. (c) Pulse/chase. Pulsation de thiolation de 25 secondes suivie d'une poursuite avec uridine. Par rapport aux niveaux d'état stables de ces ARN (point le plus à gauche), ils sont initialement très abondants dans le pool nouvellement synthétisé. Les niveaux diminuent graduellement au fur et à mesure qu'ils sont transformés en ARNm (ou dégradés), ce qui se rapproche de niveaux très semblables aux niveaux d'état stables de 5 min. Erreur standard de trois répliques biologiques, chacune a été mise en état dans le triple. d) nsRNA et épuisement des protéines. Épissage des transcriptions pré-ARNM ACT1 surveillées par la transcription inverse quantitative PCR comme dans le panneau (a) lors de l'épuisement de la protéine Prp16 à l'aide du système de degron auxine tel que décrit dans la figure 2. Les niveaux de protéines Prp16 sont également affichés dans le graphique tracé par rapport au deuxième axe Y en pourcentage des niveaux antérieurs à l'épuisement des émadés. Prp16 est un composant vital de l'épiscédsome, particulièrement important pour la deuxième étape de l'épissage montré dans le panneau (a), après quoi les lariats sont dégradés. Lorsque cette étape devient limitante, les lariats s'accumulent initialement. Plus tard, les points d'épissage échouent complètement, les lariats ne sont plus produits et les niveaux de pré-ARNm augmentent. Les barres d'erreur sont l'erreur standard de trois répliques biologiques, chacune a été admis en triple. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> Figure 4 : Résumé graphique des sections de protocole 1 à 3. Les cellules sont thiolées avec 4tU et ont permis de se développer pour incorporer le nucléotide modifié dans l'ARN. Un pic de S. pombe thiolated peut être ajouté pour permettre la normalisation à travers les points de temps et les expériences. Le pouls du 4tU peut être chassé à l'aide d'uridine non thiolée. L'étiquetage peut être effectué en continu à partir de l'ajout de 4tU ou d'un changement aux conditions de croissance, la culture divisée et 4tU ajouté aux cultures à des moments croissants à partir du changement de condition de croissance, mais chaque étiquetage seulement pour une courte période. Les cellules sont recueillies, et l'ARN préparé à partir des cellules, de préférence à l'aide d'un homogénéisateur et des méthodes à base de phénol. L'ARN est biotinylated puis l'ARN biotinylated purifié de la biotine non incorporée utilisant une colonne d'exclusion de taille. Le nsRNA est maintenant prêt pour la purification avec des perles de streptavidin (section 4, Figure 5). Les nombres en rouge correspondent aux nombres d'étapes du protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> Figure 5 : Résumé graphique de la section 4 du protocole. À la suite des sections 1 à 3 (figure4),les perles de streptavidin sont bloquées et l'échantillon d'ARN biotinylated ajouté aux perles préparées. L'ARN biotinylated se lie aux perles de streptavidin et à l'ARN non biotinylated enlevé et lavé. L'ARN biotinylated est éludé des perles à l'aide de ME et précipité prêt pour la recherche plus approfondie. Les nombres en rouge correspondent aux nombres d'étapes du protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Figure supplémentaire 1 : Amélioration de la récupération de nsARN des cellules de levure avec et sans copies supplémentaires de l'importateur à 1 et 3 minutes de thio-étiquetage. Notez que Fui1 est le promoteur de la levure propre exprimé à partir d'un plasmide de 2 m. La copie génomique de ce gène est présente dans ces deux souches. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Version animée du protocole graphique AID 4U de l'AID 4U. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 1: 4tU-experiment-template.xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nom Plasmid</td>
			<td>Importateur/permease</td>
			<td>marqueur</td>
			<td>commentaire</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3 (URA3)</td>
			<td rowspan="2">Fui1 importe Uracil et Uridine, ce qui le rend idéal pour les expériences pulse/chase.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2 (en)</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>LEU2 (En)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui-PEST</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3 (URA3)</td>
			<td>Le motif PEST de Fui1 a été désactivé, de sorte que la permease n'est pas dégradée lorsqu'il y a suffisamment d'uracil intracellulaire pour les besoins de la cellule. Fonctionne bien dans les expériences d'étiquetage et améliore les performances de pouls/chasse.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fourrure</td>
			<td>
S. cerevisiae Fur4</td>
			<td>URA3 (URA3)</td>
			<td>Ouracil permease</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">YEpEBI311 (yepEBI311)</td>
			<td>H. Sapiens ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2 (En)</td>
			<td rowspan="2">Miller et coll.11. Contient également un gène HSV thymidine kinase.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(transporteur nucléoside équilibrat)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Tous les plasmides sont de 2 m à base. Tous les plasmides p4 et pAT sont basés sur la série pRS16 de plasmides. FUI1 et FUR4 sont exprimés à partir de leurs propres promoteurs endogènes.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Plasmides utilisés avec ce protocole.

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Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

L'utilisation de l'uracil thiolated pour purifier avec sensibilité et spécifiquement l'ARN nouvellement transcrit de la levure Saccharomyces cerevisiae.

Étiquetage métabolique extrêmement rapide et spécifique de l'ARN In Vivo avec 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Cette méthode est significative parce qu’aucun autre protocole ne permet d’analyser l’ARN nouvellement synthétisé en si peu de temps, et de permettre des expériences de chasse aux impulsions avec une impulsion aussi courte. Ce protocole fonctionne bien avec l’épuisement des protéines, comme le protocole Best AID 4U. Le principal avantage est que l’arrière-plan est faible.Cela permet les courts délais d’étiquetage, en enlevant presque tout l’ARN non thethiolated. Le protocole écrit détaille également de nombreux types d’expériences qui pourraient être effectuées et comment les intégrer dans cette technique. Pour commencer cette procédure, faire pousser la levure dans le milieu YMM à un OD 600 entre 0,6 et 0,8.Dans une hotte de fumée, ajouter un méthanol équivalent à 30 à 50 % du volume prévu de l’échantillon à un tube de 50 millilitres. Fermez bien les tubes, étiquetez-les et placez-les sur de la glace sèche pour les refroidir. Ensuite, étiquetez deux tubes millilitres pour le stockage à long terme des échantillons et placez-les sur la glace pour refroidir.Ajouter les perles de zirconia aux deux tubes millilitres. Refroidir au moins un millilitre d’eau par échantillon sur la glace. Si un pic de S.pombe doit être ajouté à la culture, placez un aliquot de cellules thiolées de S.pombe sur la glace pour décongeler.Vortex l’aliquot décongelé et l’ajouter à la culture. Ajouter ensuite 4tU à la culture à une concentration de 10 micromolaires et mélanger vigoureusement. Thio-label pour une durée comprise entre 15 secondes et cinq minutes.Prélevez des échantillons de la culture à intervalles réguliers jusqu’à la fin du cours du temps. Ajouter chaque échantillon à l’un des tubes de centrifugeuse préparés contenant du méthanol. Sceller chaque tube, secouer pour bien mélanger et placer sur la glace sèche.Une fois que tous les échantillons ont été prélevés, placez-les tous sur la glace. Assurez-vous qu’aucun des échantillons n’a gelé. S’il y en a congelés, réchauffez-les doucement dans la main tout en les inversant constamment.Centrifuger les cellules à 3000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant deux minutes pour pelleter les cellules. Versez le liquide et réutilisez la pastille dans au moins un millilitre d’eau glacée en coulant vigoureusement de haut en bas. Transférer la suspension dans le tube de bouchon à vis préparé et placer le tube sur la glace.Centrifugez brièvement les échantillons à une vitesse supérieure à 13 000 fois g pour re-pelleter les cellules. Ensuite, placez-les de nouveau sur la glace, et retirez le liquide. Tout d’abord, ajoutez 400 microlitres de tampon AE, 40 microlitres de SDS et 800 microlitres de phénol à faible pH.Resuspendez en tourbillonnant pendant 10 secondes. Puis lyse les cellules dans un homogénéiseur pendant trois éclats de deux minutes au réglage de puissance le plus bas. Laissez les échantillons sur la glace pendant deux minutes entre les impulsions d’homogénéisation.Placer les cellules lysées sur la glace sèche pendant cinq minutes jusqu’à ce qu’elles se solidifient. Ensuite, utilisez une microcentrifugeuse pour faire tourner les cellules à une vitesse supérieure à 13 000 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Après cela, effectuer l’extraction du chloroforme phénol et l’extraction du chloroforme tel que décrit dans le protocole de texte.Ajouter entre 1/3 et 1/2 du volume de 10 chlorure de lithium molaire et mélanger pour précipiter l’ARN. Centrifugeuse à une vitesse supérieure à 13 000 fois g pendant cinq minutes. Retirez le liquide et re-faites tourner brièvement l’échantillon pour enlever la lie.Ensuite, lavez la pastille avec 300 à 500 microlitres de 70% d’éthanol. Centrifugez brièvement la pastille lavée et retirez le reste de l’éthanol. Dissoudre à nouveau la pastille d’ARN dans 90 microlitres de TE à un pH 7.0 en chauffant à 65 degrés Celsius tout en secouant.Après vérification de la solubilisation complète de l’ARN, transférez la suspension dans un tube de 0,2 millilitre. Pour commencer, biotinylate en ajoutant 10 microlitres de solution HPDP-biotine à l’ARN et mélanger soigneusement. Incuber dans l’obscurité à 65 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes.Ensuite, préparez un petit volume de résine, colonne d’exclusion de taille pour exclure la biotine non incorporée. Retirez l’étiquette inférieure de la colonne, desserrez le bouchon et placez la colonne dans un tube de centrifugeuse de deux millilitres. Centrifugeuse à 1500 fois g pendant une minute pour vider le tampon et jeter le flux à travers.Ajouter ensuite délicatement 0,3 millilitres de TE au sommet de la colonne et tourner à nouveau en utilisant les mêmes conditions. Transférer la colonne lavée dans un tube frais de 1,5 millilitre. Lorsque l’incubation de l’échantillon est terminée, ajouter l’échantillon en haut de la colonne.Centrifugeuse à 1500 fois g pendant deux minutes, laissant l’échantillon d’ARN biotinylated au fond du tube. Jetez la colonne. Et ajouter 1/3 à 1/2 volume de chlorure de lithium molaire de 10 molaire au tube contenant l’échantillon.Mélanger pour précipiter à nouveau l’ARN. Tout d’abord, dissoudre l’ARN dans 200 microlitres d’eau traitée par le DEPC. Mesurez la concentration d’ARN et calculez les volumes pour chaque échantillon qui donneront des quantités égales d’ARN pour tous les échantillons.Ajoutez cette quantité d’ARN à un tube frais et ajoutez de l’eau traitée par DEPC jusqu’à un volume total de 200 microlitres. Lorsqu’un échantillon est à température ambiante, ajouter 25 microlitres de tampon de 10 x NaMC, 25 microlitres d’un phosphate de sodium molaire et 2,5 microlitres de 10 % de SDS. Bien mélanger et centrifugeuser doucement à environ 100 fois g pendant moins de 30 secondes.Préparez deux millilitres de tampon de perles pour chaque échantillon avec un tampon x NaTM, 0,1 phosphate de sodium molaire et 0,1 %SDS. Ajouter 50 microlitres de perles de streptavidine à un tube de 1,5 millilitre à faible rétention. Placez le tube sur la grille magnétique et attendez que les perles se déposent.Ensuite, retirez le fluide par aspiration. Pour laver les perles, ajouter 200 millilitres de tampon de perles et de vortex jusqu’à ce que la pastille de perles soit entièrement résuspendue. Centrifuger le tube à environ 100 fois g pendant un maximum de cinq secondes.Placez le tube dans la grille magnétique pour permettre aux perles d’être capturées par l’aimant. Retirez le liquide par aspiration s’il y a un petit nombre d’échantillons. Verser le liquide, puis aspirer s’il y a beaucoup d’échantillons.Bloc avec 200 microlitres de tampon de perles, 10 microlitres de glycogène, et 2,5 microlitres d’ARN. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes tout en tournant fin sur fin à vitesse modérée. Après cela, retirez le liquide et lavez-le à nouveau, comme indiqué dans le protocole de texte.Resuspendez les perles dans l’échantillon et incubez à température ambiante pendant 30 minutes pendant la rotation. Pendant cette incubation, préparer un tube frais de 1,5 millilitre pour chaque échantillon. Ajouter 1/10 volume de trois acétate de sodium molaire au pH 5,3 et 20 microgrammes de glycogène.Centrifugeuse à environ 100 fois g pendant trois secondes. Retirez l’ARN non lié des perles et lavez-les comme indiqué dans le protocole texte. Pour élucider l’ARN, ajouter 50 microlitres de mercaptoéthanol bêta molaire fraîchement préparé 0,7 molaire aux perles.Après le vortex et la centrifugation, placez la boue dans la grille magnétique. Pipette l’ARN contenant la solution dans les tubes préparés de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Elute une fois de plus comme décrit précédemment.Ensuite, placez l’échantillon dans la grille magnétique pour enlever les perles résiduelles de l’ARN éduqué et transférer le liquide dans un tube de centrifugeuse frais et bas de 0,5 millilitre. Mélanger l’échantillon. Et puis ajouter 2,5 volumes d’éthanol pour précipiter nsRNA.Après le mélange et l’incubation, centrifugeuse à une vitesse d’au moins 13 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Les rendements typiques du snRNA récupéré à l’aide de ce protocole sont indiqués ici. Notez que la récupération de l’ARN au point zéro est une très petite partie de celle récupérée à partir de points de temps plus longs avec seulement 0,3 microgrammes d’ARN récupérés à partir d’environ 30 milliards de cellules.Après seulement 30 secondes d’étiquetage, cependant, plus de deux fois plus d’ARN est recueilli à partir du même nombre de cellules. Dans la trace de bioanalyse, nos précurseurs d’ARN peuvent être considérés comme un pic proche de 1000 nucléotides et un doublet de pics à 1700 à 1800 nucléotides. L’abondance de ces intermédiaires augmente à mesure que la thiolation se poursuit.La thiolation est ensuite effectuée avec des échantillons prélevés à intervalles de 15 secondes à partir du début de l’étiquetage thio et le traitement de la transcription de l’ARN ACT1 est surveillé. Comme on peut le voir avant l’ARNm et les lariats sont générés même après seulement 15 secondes d’étiquetage. Après environ 45 secondes à une minute, la quantité de lariats et de pré-ARNm atteint l’équilibre avec autant de ces espèces d’ARN créées par transcription que sont traitées par épissage.Les étapes les plus difficiles sont celles impliquant les perles, le lavage et le blocage. Veillez à ne pas perdre les perles ou à les laisser sécher. Une fois que vous avez purifié l’ARN nouvellement synthétisé, vous pouvez utiliser n’importe quelle procédure traditionnelle d’analyse d’ARN.Il est recommandé d’exécuter l’ARN sur un bioanalyseur ou similaire. Après cela, nous utilisons normalement QPCR et RNA-Seq pour analyser l’ARN. Cette méthode s’est avérée idéale pour analyser la cinétique du traitement de l’ARN.Les étapes les plus dangereuses sont celles utilisant le phénol et le chloroforme dans l’extraction de l’ARN. Chaque fois que vous utilisez ces produits chimiques dans un contenant non scellé, faites-le dans une hotte fumigène et portez des vêtements de protection appropriés, un manteau de laboratoire et des gants. Faites particulièrement attention qu’il n’y a pas de perles de zirconia dans le fil du tube de bouchon de vis, car cela conduira à une fuite.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Hautement sensible et rapide avec détection par fluorescence avec un analyseur FRET Portable

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Recherche

Biochimie

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automated acoustique de distribution pour la Dilution série de Peptide Agonistes dans Potency Détermination Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Préparation de l’échantillon d’Identification basé sur la spectrométrie de masse des régions de liaison à l’ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Caractérisation de basés sur la Fluorescence rapide unique vésicules extracellulaire dans le sang humain avec analyse de suivi des nanoparticules

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagenèse dirigée pour In Vitro et In Vivo des expériences illustrées avec Interactions ARN chez Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduire Ribosome Affinity Purification (TRAP) pour l'isolement de l'ARN des cellules endothéliales in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Surveillance de la dynamique d’interaction protéine-ARN in vivo à haute résolution temporelle à l’aide de χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Extraction rapide et rentable de l’ARN du tissu pancréatique rat

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN dans les bactéries à Gram positif

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Étiquetage et visualisation des produits d&apos;expression du génome mitochondrial dans Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...