Name: extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00
Duration: 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Wellcome-Mittel an JB [104648] unterstützt. Die Arbeit im Wellcome Centre for Cell Biology wird durch Wellcome-Kernförderung unterstützt [092076]. Die Autoren würdigen mitglieder des Labors für ihre Hilfe: Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna De Lucas-Arias und Shiney George. Die Autoren danken auch Patrick Cramer für das Plasmid YEpEBI31111.

<ol>
	<li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine.">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513 (2018).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li><li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity.">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li><li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast.">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li><li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion.">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li><li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters.">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li><li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast.">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li><li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimeLapse-seq:+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding.">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für eine extrem schnelle und spezifische 4tU-Kennzeichnung zur Rückgewinnung von aufkeimender, neu synthetisierter RNA aus S. cerevisiae nach nur 15 s Etikettierung dar, mit sehr geringer Kontamination durch unbeschriftete RNA.
Der Anwender sollte immer darauf achten, die Integrität der RNA durch die Verwendung von kalten Temperaturen und DEPC-behandelten Reagenzien zu erhalten. Streptavidin Perle Reinigung ist in der Regel zuverlässig; Der Perlenpuffer ist jedoch schwer zu handhaben. es muss frisch gemacht werden, mit seinen Komponenten in der richtigen Reihenfolge hinzugefügt, und nicht gekühlt oder autoklaviert. Häufige Mängel sind die unvollständige Auflösung der RNA nach den Fällungsschritten und daher entweder nicht biotinyliert oder anderweitig während der Verarbeitungsschritte verloren. Im Ergänzungsmaterial gibt es umfangreiche Hilfe zur Fehlerbehebung.
Es gibt einige Einschränkungen, die in ers4tU zu beachten sind. Eine bereits erwähnte ist, dass 4tU verlangsamt das Wachstum der Hefe (Abbildung 1a). Abgesehen von endogen thiolierten RNAs9können mit diesem Verfahren nur RNAs gereinigt werden, die während des Etikettierungszeitraums transkribiert wurden. Polymerasen, die während der Thiolationszeit an Genen angehalten wurden, erzeugen keine thiolierten Transkripte, die gereinigt werden können, obwohl Transkripte, die teilweise aufgrund von Polymerasen gekennzeichnet sind, die während der Thiolation in einen angehaltenen Zustand eintreten oder einen angehaltenen Zustand verlassen, wiederhergestellt werden können. Stämme, die schlecht transkribieren, entweder aufgrund von Mutation oder Wachstumsbedingungen, produzieren wenig nsRNA, obwohl die hier verwendeten Techniken dennoch die Erholung von nsRNA im Vergleich zu anderen Methoden verbessern werden. Längere Zeiten und erhöhte Kulturvolumina können in diesen Stämmen und Bedingungen notwendig sein. Beachten Sie, dass Uracil eine gute Stickstoffquelle ist und daher diese Methode vor der Verwendung für Studien mit Stickstoffhunger erprobt werden sollte.
Das ers4tU-Protokoll ist besonders nützlich für die Analyse kurzlebiger RNAs, von denen viele so schnell abgebaut werden, dass sie nicht identifiziert werden können, ohne die Abbaumaschinerie zu lähmen. Beispiele sind kryptische unstable Transkripte (CUTs)4, und kurze Transkripte durch vorzeitige Beendigung oder Promoter proximal Pausierung18 und Antisense Transkription "upstream" von einem Promoter (PROMPTs)19. Die bei der Verarbeitung stabiler RNA-Arten produzierten Zwischenprodukte sind ebenfalls vorübergehend, können aber mit ers4tU-Transkription4angereichert werden. Das ers4tU-Protokoll ist daher außergewöhnlich, wenn es darum geht, hochtransiente RNA-Arten unter nahezu physiologischen Bedingungen zu analysieren und zu erfassen, was einen großen Vorteil gegenüber anderen Methoden darstellt. Diese Technik wurde verwendet, um Transkription und nachgeschaltete RNA-Verarbeitung Kinetik in RNA-Polymerase-Mutanten zu studieren, die schneller oder langsamer als normale20erlälten.
Thiolation ist auch kompatibel mit RNA-seq und SLAM-seq21, so dass alle RNA produziert innerhalb eines sehr kurzen Zeitfensters in exquisiten Details charakterisiert werden.

RNA hat eine dynamische Natur; kurz nach der Produktion wird viel RNA schnell verarbeitet und abgebaut. Derzeit analysieren die meisten Studien des RNA-Stoffwechsels die gesamte zelluläre RNA, die meist vollständig verarbeitet ist und auf stationärer Ebene ist. Diese Höhe hängt vom Gleichgewicht zwischen den Transkriptionsraten, der posttranskriptionellen Reifung und dem Abbau ab. Die Analyse der Prozesse, die zum stabilen Zustandsgleichgewicht führen, erfordert spezielle Techniken, um sehr kurzlebige RNA-Arten zu erfassen.
Die metabolische Kennzeichnung von RNA mit Nukleotid-Analoga wie 4-Thiouracil (4tU) oder 4-Thiouridin (4sU) (siehe Duffy et al.1 für eine ausgezeichnete Bewertung) bietet die Möglichkeit, thio-markierte nascente RNAs und ihre Verarbeitungszwischenprodukte zu isolieren. Die veröffentlichten Protokolle beinhalten jedoch Kennzeichnungszeiten von mehreren Minuten2,3, was im Verhältnis zur Produktionsrate vieler Transkripte langsam ist. Es dauert in der Größenordnung von einer Minute, um das durchschnittliche Hefegen zu transkribieren, so dass die Kennzeichnung von Hefe-RNA für weniger als eine Minute als extrem kurz angesehen werden kann. Das extrem schnelle und spezifische 4 Thiouracil-Protokoll (ers4tU) maximiert das Signal-Rausch-Verhältnis, indem es die 4tU-Integration maximiert und die Rückgewinnung von unbeschrifteter, bereits vorhandener RNA minimiert, was sehr kurze Kennzeichnungszeiten ermöglicht4.
Die thiomodifizierte Basis muss schnell und in ausreichender Menge in die Zellen importiert werden, um die neu synthetisierte RNA (nsRNA) effizient zu kennzeichnen. Um dies zu fördern, werden Zellen in urcil-freiem Medium angebaut, und die Expression einer geeigneten Permease trägt dazu bei, die Aufnahme von 4tU oder 4sU zu steigern (siehe Tabelle 1 für eine Liste von Plasmiden, die geeignete Permeasegene und ergänzende Abbildung 1tragen). Die Löslichkeit von 4tU in Natriumhydroxid vermeidet die Notwendigkeit toxischer organischer Lösungsmittel, die von anderen Nukleotidanaloga benötigt werden. Leider wurden Wachstumskulturen über lange Zeiträume mit thiomodifizierten Nukleosiden bei Konzentrationen von mehr als 50 m beobachtet, um Ribosomen zu stören5. Die hier verwendete Konzentration (10 m) und die extrem kurzen Etikettierzeiten minimieren jedoch schädliche Effekte5 (Abbildung 1a), während dennoch genügend RNA für die Analyse zur Folge erhalten wird.
Diese Technik kann mit einer schnellen und spezifischen auxin-vermittelten Erschöpfung eines Zielproteins6,7 ( Abbildung2) kombiniert werden, das als "-est AID 4U"-Protokoll bezeichnet wird, in dem die induzierbares Degron-System (AID) wird mit 4tU-Kennzeichnung kombiniert. Mit dem Ansatz des '-est AID 4U kann ein Zielprotein aufgebraucht und die Wirkung auf den RNA-Stoffwechsel genau überwacht werden (Abbildung 2). Das Timing ist entscheidend; Es ist ratsam, das begleitende Video anzusehen und auf Abbildung 2 und seine animierte Form aufmerksam zu sein (siehe Ergänzende Abbildung 2).
Die Verarbeitung und Degradation von RNA muss extrem schnell gestoppt werden, um eine genaue Zeitauflösung zu ermöglichen. Dies wird mit Methanol bei niedriger Temperatur erreicht, das den Zellinhalt sehr schnell fixiert und die Zellmembran herabsetzt, während der Nukleinsäuregehalt8erhalten bleibt. Die RNA-Extraktion sollte effizient sein und die RNA nicht beschädigen. Mechanische Lyse ist wirksam in Abwesenheit von chaotropen Mitteln (oft enthalten diese Thio-Gruppen, so sollte vermieden werden). Lithiumchlorid-Ausfällung von RNA wird bevorzugt, da tRNAs weniger effizient gefällt werden. tRNAs werden schnell transkribiert und natürlich thioliert9, so dass die Entfernung von tRNAs die Konkurrenz um das Biotinylierungsreagenz reduziert. Wenn kleine, stark strukturierte RNAs von Interesse sind, werden alkoholbasierte RNA-Fällmethoden empfohlen.
Um die thiolierte RNA wiederherzustellen, wird Biotin kovalent über die Thio-Gruppen, die in die RNA mit 4tU integriert sind, angehängt. Die Verwendung von modifiziertem Biotin, das über eine skleavable Disulfidbindung (z.B. HPDP-Biotin (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3 -(2'pyridyldithio)propionamid) oder MTS-Biotin (Methan thiosulfonat)) anheftet, wird empfohlen. da es die Freisetzung der RNA durch Zugabe eines Reduktionsmittels ermöglicht. Die biotinylierte RNA ist Affinität gereinigt auf Streptavidin gekoppelt mit magnetischen Perlen. Dieses Protokoll ähnelt anderen zuvor10 aufgeführten, wurde aber intensiv optimiert, um den Hintergrund zu reduzieren.
Es gibt zwei Arten von Thiol-Etikettierungsexperimenten, die durchgeführt werden können, kontinuierliche und diskontinuierliche Etikettierung. Jeder hat seine eigenen Vorteile. Bei der kontinuierlichen Etikettierung wird der 4tU der Kultur zugesetzt und in regelmäßigen Abständen entnommene Proben entnommen. Diese Art von Experiment zeigt, wie die RNA verarbeitet wird und wie sich die Pegel im Laufe der Zeit ändern. Beispiele hierfür sind der Vergleich von Mutanten mit Wildtypexperimenten und ein Puls-Chase-Experiment. Die in Abbildung 3b,c gezeigten Experimente sind von diesem Typ. Für die diskontinuierliche Kennzeichnung wird eine Veränderung in das System induziert und die RNA überwacht. Sobald die Veränderung induziert wurde, muss die Kultur in mehrere Subkulturen aufgeteilt werden, und zu bestimmten Zeiten wird jede kulturisch für einen kurzen Zeitraum mit Thio-Label versehen. Ein Beispiel ist die in Abbildung 27dargestellte '-est AID 4U . Diese Art von Experiment ist besonders nützlich, um die Auswirkungen einer metabolischen Veränderung auf die RNA-Verarbeitung zu überwachen (siehe Abbildung 3d).
Eine grafische Darstellung eines Thio-Label-Experiments ist in Abbildung 4 und Abbildung 5dargestellt, und eine Tabelle, die die Leistung des Protokolls erheblich vereinfacht, ist verfügbar (siehe 4tU experiment template.xlsx). Darüber hinaus enthält die ergänzende Information einen umfangreichen Leitfaden zur Fehlerbehebung. Für das Protokoll "'-est AID 4U', das die 4tU-Kennzeichnung mit dem Auxin-Depletion-Protokoll integriert, siehe Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 2. Siehe Barrass et al.7 für das detaillierte AID-Erschöpfungsprotokoll.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#946;-mercaptoethanol (&#946;ME)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M3148</td>
			<td >CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25668</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMF (N,N-dimethylformamide)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td >Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EZ-link HPDP Biotin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21341</td>
			<td >Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark &#38; at -20 &#176;C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 &#176;C to resuspend.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Fisher Scientific&#160;</td>
			<td >G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen [20 mg/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10901393001</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>77712</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793620</td>
			<td >10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >63033</td>
			<td >1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >M/4000/PC17</td>
			<td >CAUTION Toxic and flammable</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td rowspan="2">Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-M</td>
			<td>5 M solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol, low pH.&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce Spin Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69702</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SCSM single drop-out &#8211;ura</td>
			<td >Formedium&#160;</td>
			<td >DSCS101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32318-M</td>
			<td>Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td>CAUTION corrosive</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >436143</td>
			<td>CAUTION irritant, do not inhale</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>NEB</td>
			<td>1420S</td>
			<td>Store at 4&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUPERase-In, RNase inhibitor</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See section 1.7 of the protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-thiouracil (4tU)&#160;</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>359930010</td>
			<td>Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >93362</td>
			<td>1 M solutions at various pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>5mg/ml, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base without amino acids&#160; with amonium sulphate</td>
			<td >Formedium</td>
			<td >CYN0410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeba Columns 0.5ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zirconia beads</td>
			<td>Thistle Scientific</td>
			<td>110791052</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beadbeater</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>112011EUR</td>
			<td >Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 &#176;C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="3" >Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H179467N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 50 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td rowspan="2" >Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, 2 mL, screw cap</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>723361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids</td>
			<td>Brand</td>
			<td >781332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)

Das Nukleotid-Analogon 4-Thiouracil (4tU) wird leicht von Zellen aufgenommen und in die RNA aufgenommen, da es in vivo transkribiert wird, was die Isolierung der RNA ermöglicht, die während einer kurzen Phase der Etikettierung produziert wird. Dies geschieht durch Anbringen eines Biotin-Moiety summieren an der eingebauten Thio-Gruppe und Affinität reinigung, mit Streptavidin beschichteten Perlen. Das Erreichen einer guten Ausbeute an reiner, neu synthetisierter RNA, die frei von bereits vorhandener RNA ist, ermöglicht kürzere Etikettierzeiten und ermöglicht eine erhöhte zeitliche Auflösung in kinetischen Studien. Dies ist ein Protokoll zur sehr spezifischen, hochtragreichen Reinigung neu synthetisierter RNA. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt, wie RNA aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae extrahiert wird. Das Protokoll zur Reinigung der thiolierten RNA aus der gesamten RNA sollte jedoch mit HILFE von RNA aus jedem Organismus wirksam sein, sobald sie aus den Zellen extrahiert wurde. Die gereinigte RNA eignet sich für die Analyse durch viele weit verbreitete Techniken, wie Reverse Transcriptase-qPCR, RNA-seq und SLAM-seq. Die Spezifität, Empfindlichkeit und Flexibilität dieser Technik ermöglichen unvergleichliche Einblicke in den RNA-Stoffwechsel.

Typische Erträge für nsRNA, die mit diesem ers4tU-Protokoll zurückgewonnen werden, sind in Abbildung 1bdargestellt, dies wurde von einem Bioanalyzer erzeugt und die Spur zeigt die Ausbeute von RNA versus Größe (Nukleotide [nt]). Beachten Sie sowohl in der Bioanalyse-Spur als auch im Einfügediagramm, dass die RNA-Wiederherstellung vom Zeitpunkt 0 ein sehr kleiner Teil dessen ist, der sich aus längeren Zeitpunkten erholt hat - etwa 0,3 g RNA, die aus etwa 109 Zellen zurückgewonnen wurde, verglichen mit mehr als doppelt so viel nach nur 30 s Etikettierung (0,8 g nsRNA) aus der gleichen Anzahl von Zellen. Die RNA-Wiederherstellung bei 15 s ist variabler, da kleine Unterschiede bei der Durchführung der Probenahme einen proportional größeren Effekt auf die RNA-Wiederherstellung haben. In der Bioanalyse-Spur können rRNA-Vorläufer als ein Peak nahe 1000 nt und ein Doublet von Spitzen bei 1700-1800 nt gesehen werden. Die Fülle dieser Zwischenprodukte nimmt zu, wenn die Thiolation anhält.
Thio-Kennzeichnung wurde verwendet, um die Spleißung des ACT1-Transkripts zu quantifizieren (Abbildung 3). Die Thiolation wurde durchgeführt und Proben in 15 s Abständen ab Beginn der Thio-Kennzeichnung und der Verarbeitung von ACT1-RNA überwacht (Abbildung 3a,b). Wie man sieht, wird Pre-mRNA (durch Transkription) und Lariate (durch den ersten Schritt des Spleißens von pre-mRNA) erzeugt, auch nach nur 15 s Etikettierung. Nach ca. 45 s bis 1 min erreichen die Mengen an Lariaten und Pre-mRNA das Gleichgewicht, wobei so viele dieser RNA-Arten durch Transkription erzeugt werden, wie durch Spleißen verarbeitet werden.
Um die in Abbildung 3c dargestellten Daten zu erzeugen, wurde die Sorte mit 4tU für 25 s gepulst und dann mit Uridin gejagt. Die Erzeugung von Pre-mRNA und Lariats erreicht maximal 1 Minute. Dies ist im Vergleich zu Abbildung 3bgut vergleichbar; das Maximum, das nach 45 s erreicht wird, um das Gleichgewicht zu erreichen, zuzüglich der 25 s der Etikettierung. Nach dem Höhepunkt sinken die Pegel, wenn die thio-markierten RNAs durch den Spleißprozess gejagt werden.
Abbildung 3d zeigt die Erschöpfung eines Proteinsplegierfaktors und seine Wirkung auf den RNA-Stoffwechsel, mit dem System6,7. Hier wird Prp16p nach 25 min Erschöpfung von nahezu physiologischen Werten auf 5% dieses Niveaus reduziert. Prp16p ist ein wesentlicher Spleißfaktor für den zweiten Schritt des Spleißens15. Lariate werden während des zweiten Schritts des Spleißens entfernt (Abbildung 3a), aber hier erhöhen sie sich über das Niveau der Pre-mRNA, wenn Prp16 begrenzt wird. In späteren Erschöpfungszeiten werden andere Faktoren aufgrund von Sekundäreffekten begrenzt, so dass der Lariatspiegel abnimmt und der Pre-mRNA-Spiegel steigt. Der Gehalt an gespleißter mRNA sinkt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> Abbildung 1: Wachstum bei der 4tU- und RNA-Wiederherstellung. (a) 4-Thiouracil wirkt sich auf das Wachstum aus. Die Erhöhung der Konzentration von 4tU im YMM-Drop-out-Wachstumsmedium ohne Uracil erhöht die Verdoppelungszeit von S. cerevisiae (BY4741) mit dem p4Fui-PEST-Plasmid. Das Wachstum von vier Replizienkulturen wurde bei 30 °C in einem Tecan Infinite Pro 200 überwacht. Alle Kulturen befanden sich durchweg in der Protokollphase, wobei OD600 zwischen 0,1 und 0,6 lagen. Mock ist eine Kontrollkultur mit einer entsprechenden Menge an NaOH hinzugefügt, die an sich nicht die Wachstumsrate ändert. Diese Grafik zeigt, dass die Kennzeichnung zwischen schneller Kennzeichnung und Beschädigung der Zelle einen Kompromiss ist. Fehlerleisten sind Standardfehler von 4 Replikationen. (b) die nsRNA-Ausbeute steigt linear ab etwa 15 s der Etikettierung. Die Hauptfigur zeigt die Bioanalysespuren von gereinigten, nsRNA von 0 (nicht thioliert) bis 2 min nach Zugabe von 4tU in 15 s Intervallen. Beachten Sie, dass die 15 s-Probe nicht angezeigt wird, da sie nicht von der nicht gekennzeichneten Probe zu unterscheiden war. Die beiden großen Spitzen entsprechen ribosomalen RNAs (rRNAs). Die rRNA-Vorstufen und Zwischenprodukte sind als mehrere Spitzen mit einem höheren Molekulargewicht als reife rRNAs sichtbar. Die Wiederherstellung dieser Vorstufen und Zwischenprodukte nimmt mit der Zeit zu. Gezeigt werden Ergebnisse aus einem repräsentativen Experiment. Das Einsetdiagramm zeigt die Erholung von nsRNA mit zunehmender Inkubation mit 4tU. Die Ausbeute von nsRNA steigt mit zunehmender Wachstumszeit mit 4tU. Die Erholung ist während des gesamten Zeitrahmens dieses Experiments bemerkenswert linear (R2 = 0,934) und zeigt einen leichten Anstieg gegenüber dem Hintergrund, selbst bei 15 s Etikettierung mit 4tU, obwohl sie nicht von der nicht gekennzeichneten Probe per Auge vom Bioanalyzer unterschieden werden kann. Spur. Fehlerbalken zeigen Standardfehler für drei biologische Replikationen an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> Abbildung 2: grafisches Protokoll von é-est AID 4U . Eine grafische Zusammenfassung des Protokolls des Protokolls von '-est AID 4U. Die Expression des auxin induzierbaren Degron-Systems (AID), das wiederum ein AID*-markiertes Zielprotein ausschöpft, fördert die Expression des auxin induzierbaren Degron-Systems (AID), das wiederum ein AID*-markiertes Zielprotein aush. In diesem Fall wird die Degron-Systemexpression 25 min eingeleitet, bevor der Proteinabbau beginnt und die Thiolation zu jedem Zeitpunkt 1 min. ist. Proben werden vor der Induktion und alle 2 Minuten während der Erschöpfung entnommen. Eine animierte Version wird in der Ergänzenden Abbildung 2angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Vorläufer und Zwischenprodukte der ACT1-RNA-Spleißung. Das Spleißen von ACT1 Pre-mRNA-Transkripten wurde durch quantitative Reverse-Transkription PCR16überwacht. Die Konzentrationen von ACT1-Vorläufer (pre-mRNA), Zwischenlariat-Exon2 (Lariat) und spliciertem Produkt (mRNA) werden normalisiert gegen das Niveau von ACT1 Exon2 und den stationären Zustand dieser RNAs dargestellt. (a) Position der qPCR-Produkte auf dem ACT1-Transkript. Schematische Lage der qPCR-Produkte, die verwendet werden, um die Gehalte an Vorprodukten, Zwischenprodukten und Produkten der Spleißreaktion der ACT1-Transkripte16zu asseraten. Exons werden durch Felder, Intron als Linie und die qPCR-Produkte als Linien mit Diamanten an beiden Enden dargestellt, wobei die Farbe mit der farbe übereinstimmt, die in den Diagrammen verwendet wird. Die Pre-mRNA PCR ist spezifisch für pre-mRNA und keine Zwischenprodukte des Spleißens, da dieses Produkt den Astpunkt kreuzt, der nach dem ersten Schritt des Spleißens gestört wird. Lariat PCR erkennt das Produkt des ersten Schritts des Spleißens und das verbrauchsteuerne Lariat, das nach dem zweiten hergestellt wird. Die mRNA PCR ist spezifisch für das Produkt spleißen, mRNA. Die Ergebnisse der Exon-PCR (in allen Vorstufen, Zwischenprodukten und Erzeugnissen, mit Ausnahme des ausgeschnittenen Lariats) sind in den Schaubildern nicht dargestellt, da diese zur Normalisierung der Daten verwendet wurde und daher immer gleich 1 ist. (b) Kontinuierliche Thiolabelling. Die Menge der Pre-mRNA erhöht sich mit der Zeit, da 4tU durch Transkription aufgenommen wird und nach einer kurzen Verzögerung in Lariat-Exon2-Zwischenprodukte und Spleißprodukte umgewandelt wird. Die Konzentrationen dieser Prä-mRNA- und Lariat-Arten sind über dem Hintergrund nach nur 15 s Wachstum mit 4tU nachweisbar und erreichen ein Maximum nach etwa 45 s kontinuierlicher Kennzeichnung mit 4tU, wobei ihre Produktion durch Umwandlung in gespleißte mRNA und/oder Abbau. Die Werte werden auf ihren stabilen Zustand normalisiert (links-der Punkt des Graphen), und exon 2 Ebenen, um ihr Aussehen und ihre Verarbeitung im Vergleich zur Transkription von Exon 2 anzuzeigen. Da die RNA-Spleißung von ACT1 weitgehend ko-transkriptionsiv4ist, wird17 spleißte mRNA schnell zur am häufigsten vorkommenden Art, ihr Gehalt ähnelt dem von Exon 2. Standardfehler von drei biologischen Repliken, die jeweils in Dreifachausführung geprüft werden. (c) Puls/Jagd. Thiolationspuls von 25 Sekunden gefolgt von Verfolgungsjagd mit Uridin. Im Vergleich zu den stationären Niveaus dieser RNAs (links-punkt), Sie sind zunächst sehr reichlich in der neu synthetisierten Pool. Die Werte sinken allmählich, wenn sie zu mRNA verarbeitet (oder degradiert) werden, und nähern sich dem stationären Niveau um 5 min. Standardfehler von drei biologischen Replikationen, die jeweils in Dreifacharbeit untersucht werden. (d) nsRNA und Proteinmangel. Spleißen von ACT1 Pre-mRNA-Transkripten, die durch quantitative Reverse-Transkription PCR wie im Panel (a) nach Erschöpfung des Prp16-Proteins unter Verwendung des Auxin-Degron-Systems überwacht werden, wie in Abbildung 2beschrieben. Die Prp16-Proteinspiegel werden auch in der Grafik angezeigt, die gegen die zweite Y-Achse als Prozentsatz der Werte vor der Auxin-Erschöpfung dargestellt wird. Prp16 ist ein wichtiger Bestandteil des Spleceooms, besonders wichtig für den zweiten Schritt der Spleißung in Panel (a), nach dem Lariate abgebaut werden. Wenn dieser Schritt wird begrenzende Lariate anhäufen sich zunächst. Zu späteren Zeiten fällt das Spleißen vollständig aus, Lariate werden nicht mehr produziert und die Pre-mRNA-Spiegel steigen. Fehlerbalken sind Standardfehler von drei biologischen Replikationen, die jeweils in Dreifachausführung untersucht werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> Abbildung 4: Grafische Zusammenfassung der Protokollabschnitte 1 bis 3. Die Zellen werden mit 4tU thioliert und dürfen wachsen, um das modifizierte Nukleotid in die RNA zu integrieren. Eine thiolierte S. Pombe-Spitze kann hinzugefügt werden, um eine Normalisierung über Zeitpunkte und Experimente zu ermöglichen. Der Puls von 4tU kann mit unthioliertem Uridin gejagt werden. Die Etikettierung kann entweder kontinuierlich von 4tU-Zugabe oder von einer Änderung zu Wachstumsbedingungen durchgeführt werden, die Kultur spaltet und 4tU zu Beginn der Wachstumsbedingung ändern, aber jede Kennzeichnung nur für eine kurze Zeit. Die Zellen werden gesammelt und RNA aus den Zellen hergestellt, vorzugsweise mit einem Homogenisator und phenolbasierten Methoden. Die RNA wird biotinyliert und dann die biotinylierte RNA aus nicht inkorporiertem Biotin mit einer Größenausschlussspalte gereinigt. Die nsRNA ist nun bereit für die Reinigung mit Streptavidinperlen (Abschnitt 4, Abbildung 5). Zahlen in Rot entsprechen den Schrittnummern im Protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> Abbildung 5: Grafische Zusammenfassung des Protokollabschnitts 4. Nach den Abschnitten 1 bis 3 (Abbildung4) werden die Streptavidinperlen blockiert und die biotinylierte RNA-Probe den vorbereiteten Perlen zugesetzt. Die biotinylierte RNA bindet an die Streptavidinperlen und die un-biotinylierte RNA entfernt und gewaschen. Die biotinylierte RNA wird aus den Perlen mit Hilfe von "ME" eluiert und für weitere Forschungsarbeiten ausgefällt. Zahlen in Rot entsprechen den Schrittnummern im Protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Verbesserung der nsRNA-Rückgewinnung aus Hefezellen mit und ohne zusätzliche Kopien des Importeurs bei 1 und 3 Minuten Thio-Kennzeichnung. Beachten Sie, dass Fui1 der eigene Promotor der Hefe ist, der aus einem 2 m Plasmid ausgedrückt wird. Die genomische Kopie dieses Gens ist in beiden Stämmen vorhanden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Animierte Version des grafischen Protokolls von '-est AID 4U '-est AID 4U. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: 4tU_experiment_template.xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PlasmidName</td>
			<td>Importeur/Permease</td>
			<td>anschreiber</td>
			<td>bemerkung</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td rowspan="2">Fui1 importiert Uracil und Uridin, was es ideal für Puls-/Chase-Experimente macht.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>LEU2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui-PEST</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Das PEST-Motiv von Fui1 wurde deaktiviert, so dass die Permease nicht abgebaut wird, wenn es genügend intrazelluläre Uracil für die Bedürfnisse der Zelle gibt. Funktioniert gut bei der Kennzeichnung von Experimenten und verbessert die Puls-/Chase-Leistung.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fur</td>
			<td>
S. cerevisiae Fur4</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Uracil permease</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">YEpEBI311</td>
			<td>H. Sapiens ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2</td>
			<td rowspan="2">Miller et al.11. Enthält auch ein HSV-Thymidin-Kinase-Gen.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(gleichgewichtiver Nukleosidtransporter)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Alle Plasmide sind 2 m basiert. Alle p4-Plasmide und pAT basieren auf der Serie pRS16 von Plasmiden. FUI1 und FUR4 werden von ihren eigenen, endogenen Projektträgern ausgedrückt.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Plasmide, die mit diesem Protokoll verwendet werden.

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Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Die Verwendung von thioliertem Uracil zur empfindlichen und gezielten Reinigung neu transkribierter RNA aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae.

Extrem schnelle und spezifische metabolische Kennzeichnung von RNA In Vivo mit 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Diese Methode ist wichtig, da kein anderes Protokoll es erlaubt, neu synthetisierte RNA in einer so kurzen Zeitskala zu analysieren und Puls-Chase-Experimente mit einem so kurzen Puls zu ermöglichen. Dieses Protokoll funktioniert gut mit Proteinmangel, wie dem Best AID 4U-Protokoll. Der Hauptvorteil ist, dass der Hintergrund niedrig ist.Dies ermöglicht die kurzen Etikettierungszeiten, indem fast die gesamte nichtthiolierte RNA entfernt wird. Das geschriebene Protokoll beschreibt auch viele verschiedene Arten von Experimenten, die durchgeführt werden könnten und wie sie in diese Technik integriert werden können. Um dieses Verfahren zu beginnen, wachsen Hefe in YMM Medium auf eine OD 600 zwischen 0,6 und 0,8.In einer Dunstabzugshaube ein Methanol, das 30 bis 50 % des vorgesehenen Probenvolumens entspricht, einem 50-Milliliter-Rohr hinzufügen. Schließen Sie die Rohre fest, beschriften Sie sie und legen Sie sie auf Trockeneis, um sie abzukühlen. Als nächstes zwei Milliliter-Rohre für die langfristige Lagerung der Proben beschriften und zum Abkühlen auf Eis legen.Zirkonia-Perlen zu den beiden Milliliter-Röhren hinzufügen. Mindestens einen Milliliter Wasser pro Probe auf Eis abkühlen lassen. Wenn eine S.pombe Spitze der Kultur hinzugefügt werden soll, legen Sie ein Aliquot von thiolierten S.pombe Zellen auf Eis zum Tauen.Wirbel das aufgetaut aliquot und fügen Sie es der Kultur. Dann 4tU in die Kultur zu einer Konzentration von 10 Mikromolar hinzufügen und kräftig mischen. Thio-Label für eine Zeitzwischen 15 Sekunden und fünf Minuten.Nehmen Sie in regelmäßigen Abständen Muster der Kultur bis zum Ende des Zeitkurses. Jede Probe in einen der vorbereiteten Zentrifugenröhrchen geben, die Methanol enthalten. Versiegeln Sie jedes Rohr, schütteln Sie gründlich zu mischen, und legen Sie auf Trockeneis.Sobald alle Proben genommen sind, legen Sie sie alle auf Eis. Stellen Sie sicher, dass keine der Proben eingefroren ist. Wenn irgendwelche eingefroren haben, wärmen Sie sie sanft in der Hand, während Sie ständig invertieren.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 3 000 mal g und bei vier Grad Celsius für zwei Minuten, um die Zellen zu pellet. Gießen Sie die Flüssigkeit ab und setzen Sie das Pellet in mindestens einem Milliliter eiskaltem Wasser wieder auf, indem Sie kräftig nach oben und unten pfeifen. Übertragen Sie die Suspension auf das vorbereitete Schraubverschlussrohr und legen Sie das Rohr auf Eis.Zentrifugieren Sie die Proben kurz mit einer Geschwindigkeit von mehr als 13.000 mal g, um die Zellen neu zu pellet. Legen Sie sie dann wieder auf Eis und entfernen Sie die Flüssigkeit. Fügen Sie zunächst 400 Mikroliter AE-Puffer, 40 Mikroliter SDS und 800 Mikroliter Phenol bei einem niedrigen pH-Wert hinzu.Resuspend durch Wirbeln für 10 Sekunden. Dann lysieren Sie die Zellen in einem Homogenisator für drei zwei Minuten Bursts bei der niedrigsten Leistungseinstellung. Lassen Sie die Proben zwischen homogenisierungsimpulsen zwei Minuten auf Eis.Legen Sie die lysierten Zellen für fünf Minuten auf Trockeneis, bis sie sich verfestigt. Als nächstes verwenden Sie eine Mikrozentrifuge, um die Zellen mit einer Geschwindigkeit von mehr als 13.000 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zu drehen. Führen Sie danach die Phenolchloroformextraktion und die Chloroformextraktion wie im Textprotokoll beschrieben durch.Fügen Sie zwischen 1/3 bis 1/2 des Volumens von 10 Mollithiumchlorid und mischen, um die RNA zu fällen. Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit über 13.000 mal g für fünf Minuten. Entfernen Sie die Flüssigkeit, und drehen Sie die Probe kurz neu, um die Dregs zu entfernen.Dann waschen Sie das Pellet mit 300 bis 500 Mikroliter 70% Ethanol. Zentrifugieren Sie das gewaschene Pellet kurz, und entfernen Sie alle verbleibenden Ethanol. Lösen Sie das RNA-Pellet in 90 Mikroliter TE bei einem pH-Wert von 7,0 wieder auf, indem Sie beim Schütteln bei 65 Grad Celsius erhitzen.Nach Prüfung auf vollständige RNA-Löslichkeit, übertragen Sie die Suspension auf eine 0,2 Milliliter-Röhre. Zunächst biotinylat durch Zugabe von 10 MikroliterHPDP-Biotinlösung in die RNA und gründlich mischen. Inkubieren Sie im Dunkeln bei 65 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten.Als nächstes bereiten Sie eine kleine Harzvolumen, Größe Ausschluss Spalte, um die nicht inkorporierte Biotin auszuschließen. Entfernen Sie das untere Tag der Spalte, lösen Sie die Kappe, und legen Sie die Spalte in ein Zentrifugenrohr mit zwei Millilitern. Zentrifuge bei 1, 500 mal g für eine Minute, um den Puffer auszuspülen und den Durchfluss zu verwerfen.Fügen Sie dann vorsichtig 0,3 Milliliter TE an den oberen Rand der Säule und drehen Sie wieder unter den gleichen Bedingungen. Übertragen Sie die gewaschene Säule in ein frisches 1,5-Milliliter-Rohr. Wenn die Beispielinkubation abgeschlossen ist, fügen Sie das Beispiel am oberen Rand der Spalte hinzu.Zentrifuge bei 1,500 mal g für zwei Minuten, so dass die biotinylierte RNA-Probe am Boden der Röhre. Verwerfen Sie die Spalte. Und fügen Sie 1/3 bis 1/2 Volumen von 10 Mol Lithiumchlorid in das Rohr mit der Probe.Mischen, um die RNA neu zu fällen. Lösen Sie zunächst die RNA in 200 Mikroliter DEPC-behandeltem Wasser wieder auf. Messen Sie die RNA-Konzentration und berechnen Sie Volumen für jede Probe, die für alle Proben die gleichen RNA-Mengen ergeben.Fügen Sie diese Menge an RNA in ein frisches Rohr und fügen Sie DEPC-behandeltes Wasser wieder bis zu einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern hinzu. Wenn eine Probe bei Raumtemperatur ist, fügen Sie 25 Mikroliter 10 x NaTM Puffer, 25 Mikroliter eines Molaren-Natriumphosphats und 2,5 Mikroliter 10%SDS hinzu. Mischen Sie gründlich, und Zentrifuge sanft bei etwa 100 mal g für weniger als 30 Sekunden.Bereiten Sie zwei Milliliter Perlenpuffer für jede Probe mit einem x NaTM Puffer, 0,1 Mol-Natriumphosphat und 0,1%SDS vor. Fügen Sie 50 Mikroliter Streptavidin Perlen zu einem niedrigen Retention 1,5 Milliliter Rohr. Legen Sie das Rohr auf das Magnetgestell und warten Sie, bis sich die Perlen absetzen.Entfernen Sie dann die Flüssigkeit durch Aspiration. Um die Perlen zu waschen, fügen Sie 200 Milliliter Perlenpuffer und Wirbel hinzu, bis das Perlenpellet vollständig resuspendiert ist. Zentrifugieren Sie das Rohr maximal fünf Sekunden lang bei ca. 100 mal g.Legen Sie das Rohr in das magnetische Rack, damit die Perlen vom Magneten erfasst werden können. Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Aspiration, wenn es eine kleine Anzahl von Proben gibt. Gießen Sie die Flüssigkeit ab und dann aspirieren, wenn es viele Proben gibt.Block mit 200 Mikroliter Nadenpuffer, 10 Mikroliter Glykogen und 2,5 Mikroliter tRNA. Inkubieren Bei Raumtemperatur für 20 Minuten, während rotierende Ende über Ende mit moderater Geschwindigkeit. Danach entfernen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie sie erneut, wie im Textprotokoll beschrieben.Setzen Sie die Perlen in der Probe wieder auf und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 30 Minuten, während Sie sich drehen. Bereiten Sie während dieser Inkubation für jede Probe eine frische 1,5-Milliliter-Röhre zu. Fügen Sie 1/10 Volumen von drei Molaren-Natriumacetat bei pH 5,3 und 20 Mikrogramm Glykogen hinzu.Zentrifuge bei ca. 100 mal g für drei Sekunden. Entfernen Sie die ungebundene RNA aus den Perlen und waschen Sie sie wie im Textprotokoll beschrieben. Um die RNA zu entlarven, fügen Sie den Perlen 50 Mikroliter frisch zubereitetes 0,7 Molaren-Beta-Mercaptoethanol hinzu.Nach Wirbeln und Zentrifugieren die Gülle in das magnetische Rack legen. Die RNA-haltige Lösung in die vorbereiteten 1,5 Milliliter Zentrifugenröhren pipette. Elute noch einmal wie zuvor beschrieben.Legen Sie die Probe dann wieder in das magnetische Rack, um Restperlen aus der eluierten RNA zu entfernen und die Flüssigkeit in ein frisches, niedrig bindendes 0,5-Milliliter-Zentrifugenrohr zu übertragen. Mischen Sie die Probe. Und dann fügen Sie 2,5 Volumen Ethanol, um nsRNA zu niederschlagen.Nach dem Mischen und Inkubieren zentrieren Sie mit einer Geschwindigkeit von mindestens 13.000 mal g und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Typische Erträge für snRNA, die mit diesem Protokoll wiederhergestellt werden, werden hier gezeigt. Beachten Sie, dass die RNA-Wiederherstellung zum Zeitpunkt Null ein sehr kleiner Teil davon ist, der sich aus längeren Zeitpunkten erholt hat, wobei nur 0,3 Mikrogramm RNA aus etwa 30 Milliarden Zellen zurückgewonnen werden.Nach nur 30 Sekunden Etikettierung wird jedoch mehr als doppelt so viel RNA aus der gleichen Anzahl von Zellen gesammelt. In der Bioanalyse-Spur können unsere RNA-Vorläufer als EinSpitzen in der Nähe von 1 000 Nukleotiden und als Doublet von Peaks bei 1, 700 bis 1 800 Nukleotiden gesehen werden. Die Fülle dieser Zwischenprodukte nimmt zu, wenn die Thiolation anhält.Die Thiolation wird dann mit Proben durchgeführt, die in 15-Sekunden-Intervallen ab Beginn der Thio-Etikettierung entnommen werden, und die Verarbeitung des ACT1-RNA-Transkripts wird überwacht. Wie man sieht, werden Pre-mRNA und Lariate auch nach nur 15 Sekunden Etikettierung erzeugt. Nach etwa 45 Sekunden bis zu einer Minute erreicht die Menge an Lariaten und Pre-mRNA das Gleichgewicht, wobei so viele dieser RNA-Arten durch Transkription erzeugt werden, wie durch Spleißen verarbeitet werden.Die schwierigsten Schritte sind die, die die Perlen, Waschen und Blockieren. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu verlieren oder sie austrocknen zu lassen. Sobald Sie neu synthetisierte RNA gereinigt haben, können Sie jedes traditionelle RNA-Analyseverfahren verwenden.Es wird empfohlen, die RNA auf einem Bioanalyzer oder ähnlichem auszuführen. Danach verwenden wir normalerweise QPCR und RNA-Seq, um die RNA zu analysieren. Diese Methode erwies sich als ideal für die Analyse der Kinetik der RNA-Verarbeitung.Die gefährlichsten Schritte sind diejenigen, die Phenol und Chloroform in der RNA-Extraktion verwenden. Jedes Mal, wenn Sie diese Chemikalien in einem nicht versiegelten Behälter verwenden, tun Sie dies in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie geeignete Schutzkleidung, einen Labormantel und Handschuhe. Achten Sie besonders darauf, dass sich im Gewinde des Schraubverschlussrohrs keine Zirkonia-Perlen befinden, da dies zu einem Leck führt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Hochempfindliche und schnelle Fluoreszenzdetektion mit einem tragbaren FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Forschung

Biochemie

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Rasche Fluoreszenz basierende Charakterisierung der einzelnen extrazelluläre Vesikel im menschlichen Blut mit Nanopartikel-Tracking Analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-verwiesene Mutagenese für In Vitro und In Vivo Experimente veranschaulicht mit RNA-Interaktionen in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Überwachung der Protein-RNA-Interaktionsdynamik in vivo mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Schnelle und kostengünstige RNA-Extraktion von Ratten-Pankreasgewebe

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...