Name: extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00
Duration: 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מימון ברוך הבא ל-JB [104648]. העבודה במרכז ברוך הבא לביולוגיה סלולרית נתמכת על ידי מימון ברוכים המרכזיים [092076]. המחברים מכירים בחברי המעבדה על עזרתם: בלה מאולין, עמנואלה סאני, סוזנה דה לוקאס-אריאס ושייני ג'ורג '. המחברים גם רוצה להודות פטריק קרמר עבור פלYEpEBI31111.

<ol>
	<li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine.">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513 (2018).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li><li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity.">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li><li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast.">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li><li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion.">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA's+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression.">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li><li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).</li><li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li><li>R&#228;dle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis,+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture.">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).</li><li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics.">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li><li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system.">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li><li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboSys,+a+high-resolution,+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3&#8242;-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3&#8242;-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li><li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+fast+and+incredibly+close:+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast.">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li><li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters.">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li><li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast.">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li><li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimeLapse-seq:+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding.">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

מאמר זה מציג פרוטוקול עבור התוויות 4tU מהירה ביותר וספציפי, להתאוששות של המתהווה, RNA מסונתז לאחרונה מ -S. cerevisiae ס לאחר כמה שפחות 15 S של תוויות, עם זיהום נמוך מאוד על ידי RNA ללא תווית.
המשתמש צריך תמיד לדאוג לשמור על היושרה של ה-RNA על ידי שימוש בטמפרטורות קרות ו-DEPC מטופלים ריאגנטים. טיהור Streptavidin חרוז הוא אמין בדרך כלל; עם זאת, מאגר חרוז קשה לטפל; זה חייב להיות טרי, עם המרכיבים שלה הוסיף בסדר הנכון, ולא מקורר או באוטוקלבד. הכישלונות הנפוצים כוללים את ה-RNA שאינו מומס לחלוטין לאחר צעדי המשקעים, ולכן לא ביולוגית או אבודה באופן אחר במהלך שלבי העיבוד. קיימת עזרה נרחבת לפתרון בעיות בחומר המשלים.
יש כמה מגבלות להיות מודעים ב ers4tU. אחד כבר הזכיר כי 4tU מאט את הצמיחה של שמרים (איור 1a). פרט ל-RNAs9, רק rnas ששועתק במהלך תקופת התיוג יכול להיות מטוהר על ידי שיטה זו. הפלסים הושהה בגנים לאורך הזמן המלא לא יפיק תעתיקים של התמלילים שניתן לטהר, למרות שהתעתיקים הינם מתויג חלקית בשל הזנת המצב או היציאה מהמצב המושהה במהלך התהליך הניתן לשחזור. זנים כי לתעאם גרוע, או בגלל תנאי מוטציה או צמיחה, לייצר nsRNA קטן, למרות הטכניקות המשמשות כאן יהיה בכל זאת לשפר את ההתאוששות של nsRNA לעומת שיטות אחרות. פעמים ארוכות יותר וכרכים תרבותיים מוגברת עשויים להיות נחוצים בזנים ובתנאים אלה. שימו לב כי אורציל הוא מקור טוב של חנקן ולכן שיטה זו צריכה להיות מלאה לפני השימוש למחקרים מעורבים רעב חנקן.
הפרוטוקול ers4tU שימושי במיוחד לניתוח של RNAs קצרי-חיים, שרבים מהם מושפל כל כך במהירות, כי הם לא יכולים להיות מזוהים מבלי לשתק את מכונות השפלה. דוגמאות כוללות תעתיקים לא יציב מוזר (חתכים)4, ותעתיקים קצרים המיוצרים על ידי סיום מוקדם או יזם הקרוב משהה18 ו-antisense שעתוק "במעלה" מיזם (הנחיות)19. Intermediates המיוצר במהלך העיבוד של מינים יציבים RNA הם גם ארעי אבל יכול להיות מועשר באמצעות ers4tU תמלול4. הפרוטוקול ers4tU ולכן הוא יוצא דופן במתיר מינים זמניים מאוד ארעי להיות מנותח ונלכד תחת התנאים הפיזיולוגיים הסמוכים, אשר הוא יתרון עצום על פני שיטות אחרות. טכניקה זו שימש לחקר תמלול והזרם RNA לעיבוד קינטיקה ב RNA מוטציות פולימראז שהאריך מהר יותר או איטי יותר מאשר20נורמלי.
Thiolation תואם גם עם RNA-seq ו סלאם-seq21, המאפשר כל RNA המיוצר בתוך חלון זמן קצר מאוד כדי להיות מאופיין בפירוט מעולה.

RNA יש אופי דינאמי; זמן קצר לאחר מכן מופק הרבה RNA הוא מעובד במהירות ומושפל. כיום, רוב המחקרים של מטבוליזם RNA לנתח את ה-RNA הסלולר הכולל, אשר ברובו מעובד באופן מלא ברמת המצב יציב. רמה זו תלויה באיזון שבין שיעורי התמלול, התבגרות והשפלה שלאחר ההמרה. ניתוח התהליכים המובילים לאיזון המצב היציב דורש טכניקות מיוחדות ללכידת מינים של RNA מאוד קצר.
התיוג המטבולית של RNA עם נוקלאוטיד מקבילים כגון 4-thiouracil (4tU) או 4-תיורידין (4Tu) (לראות דאפי ואח '1 לקבלת סקירה מצוינת), מציע את היכולת לבודד את ה-rnas המתהווה מתויג ועיבוד intermediates. עם זאת, פרוטוקולים שפורסמו כוללים זמני תוויות של מספר דקות2,3, שהוא איטי יחסית לקצב הייצור של תעתיקים רבים. זה לוקח את הסדר של דקה אחת לתעתור את הגן שמרים הממוצע, כך שמרים התוויות RNA עבור פחות מדקה אחת יכול להיחשב קצר מאוד. הפרוטוקול המהיר והספציפי ביותר 4 תיואורציל (ers4tU) מגדיל את האות ליחס הרעש על ידי הגדלת 4tu התאגדות ולמזער את ההתאוששות של ללא תווית, RNA הקיימים מראש עושה פעמים מאוד קצר תוויות אפשרי4.
הבסיס thio שונה חייב להיות מיובא לתוך התאים במהירות בכמות מספקת כדי לתייג ביעילות את ה-RNA החדש מסונתז (nsRNA). כדי לקדם את זה, התאים גדלים במדיום uracil, וביטוי של חדירות המתאים מסייע להגביר את ספיגת 4tU או 4Tu (לראות את שולחן 1 עבור רשימה של פלמידים הנושאים הגנים חדירות מתאים ואיור המשלים 1). מסיסות 4tU's ב הידרוקסיד הנתרן מונעת את הצורך ממיסים אורגניים רעילים הנדרשים על ידי נוקלאוטיד אחרים מקבילים. למרבה הצער, גידול תרבויות לתקופות ארוכות עם thio שונה נוקלאוטידים בריכוזים גדול יותר מ-50 μM נצפתה לשבש את הריבוזומים5. עם זאת, את הריכוז (10 μM) משמש כאן, ואת פעמים התוויות קצר מאוד, למזער את ההשפעות למחיקה5 (איור 1a), ואילו עדיין מניב RNA מספיק לניתוח.
טכניקה זו יכולה להיות משולבת עם הדילול מהירה וספציפית מתווך של חלבון היעד6,7 (איור 2), המכונה "β-est סיוע 4u" פרוטוקול, שבו β-estradiol מוסדר ביטוי של האוקאין inducible degron (סיוע) מערכת משולב עם התוויות 4tU. עם β-est סיוע 4U הגישה, חלבון היעד יכול להיות מרוקן את ההשפעה על מטבוליזם של RNA במעקב צמוד (איור 2). העיתוי הוא קריטי; רצוי לצפות בסרטון הנלווה ולשים לב לאיור 2 ולצורתו המונפשת (ראו איור משלים 2).
עיבוד והשפלה של RNA חייב להיעצר במהירות רבה לפתרון זמן מדויק. זה מושגת באמצעות מתנול בטמפרטורה נמוכה, אשר מתקן את תוכן התא במהירות רבה ומבזה את קרום התא תוך שמירה על התוכן חומצות גרעין8. החילוץ RNA צריך להיות יעיל ולא לפגוע RNA. הפירוק המכני יעיל בהעדר סוכני chaotropic (לעתים קרובות אלה מכילים קבוצות thio, כך יש להימנע). ליתיום כלוריד משקעים של RNA הוא המועדף, כמו tRNAs הם פחות מזירז ביעילות. tRNAs מועתק במהירות, באופן טבעי מאוד9, ולכן הסרת trnas מפחית את התחרות עבור מגיב biotinylation. אם RNAs קטנים ומובנים מאוד, מומלץ לעשות שיטות משקעים מבוססות-RNA לאלכוהול.
כדי לשחזר את RNA thiolated, ביוטין מצורף באמצעות קבוצות thio שולבו RNA עם 4tu. השימוש בביוטין שונה, המתחבר באמצעות בונד דיגופרתי (למשל, HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3 השני-(2 זה-pyridyldithio)propionamide,) או MTS-biotin (מתאן thioate)) מומלץ כפי שהיא מאפשרת שחרור של ה-RNA בתוספת של סוכן מפחית. רנ א biotinylated הוא אהדה מטוהרים על streptavidin מצמידים לחרוזים מגנטיים. פרוטוקול זה דומה לאחרים המפורטים בעבר10 אבל כבר ממוטב באופן אינטנסיבי כדי להפחית את הרקע.
ישנם שני סוגים של ניסוי thiol-התוויות שניתן לבצע, רציפה ולא רציפה תוויות. לכל אחד יש יתרונות משלו. בתוויות רצופות, 4tU מתווסף לתרבות ולדגימות שצולמו במרווחי זמן קבועים. סוג זה של ניסוי מראה כיצד RNA מעובד וכיצד רמות משתנות לאורך זמן. הדוגמאות כוללות השוואה בין המוטציות לבין ניסויים פראיים וניסוי מרדף דופק. הניסויים המוצגים באיור 3b, c הם מסוג זה. עבור תוויות בלתי רציפה שינוי מושרה למערכת ו-RNA מנוטרים. לאחר שנוצר השינוי, יש לפצל את התרבות לכמה תתי-תרבויות, ובזמנים מסוימים, כל אחד מהם מתויג לתקופה קצרה. אחת הדוגמאות היא β הסיוע 4U המוצג באיור 27. סוג זה של ניסוי שימושי במיוחד עבור ניטור ההשפעה של שינוי מטבולית על עיבוד RNA (ראה איור 3d).
ייצוג גרפי של ניסוי thio-התוויות מוצג באיור 4 ובאיור 5, וגיליון אלקטרוני המפשט מאוד את ביצועי הפרוטוקול זמין (ראה 4tu הניסוי תבנית. xlsx). בנוסף לכך, המידע המשלים מכיל מדריך מקיף לפתרון בעיות. עבור פרוטוקול 4U β-est המשלב תיוג 4U עם הכלי העזר בפרוטוקול המחסור, ראה איור 2 ומשלים איור 2. ר' ברז ואח '7 עבור פרוטוקול מחסור בסיוע מפורט.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#946;-mercaptoethanol (&#946;ME)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M3148</td>
			<td >CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25668</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMF (N,N-dimethylformamide)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td >Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EZ-link HPDP Biotin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21341</td>
			<td >Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark &#38; at -20 &#176;C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 &#176;C to resuspend.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Fisher Scientific&#160;</td>
			<td >G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen [20 mg/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10901393001</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>77712</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793620</td>
			<td >10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >63033</td>
			<td >1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >M/4000/PC17</td>
			<td >CAUTION Toxic and flammable</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td rowspan="2">Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-M</td>
			<td>5 M solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol, low pH.&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce Spin Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69702</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SCSM single drop-out &#8211;ura</td>
			<td >Formedium&#160;</td>
			<td >DSCS101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32318-M</td>
			<td>Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td>CAUTION corrosive</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >436143</td>
			<td>CAUTION irritant, do not inhale</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>NEB</td>
			<td>1420S</td>
			<td>Store at 4&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUPERase-In, RNase inhibitor</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See section 1.7 of the protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-thiouracil (4tU)&#160;</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>359930010</td>
			<td>Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >93362</td>
			<td>1 M solutions at various pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>5mg/ml, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base without amino acids&#160; with amonium sulphate</td>
			<td >Formedium</td>
			<td >CYN0410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeba Columns 0.5ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zirconia beads</td>
			<td>Thistle Scientific</td>
			<td>110791052</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beadbeater</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>112011EUR</td>
			<td >Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 &#176;C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="3" >Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H179467N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 50 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td rowspan="2" >Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, 2 mL, screw cap</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>723361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids</td>
			<td>Brand</td>
			<td >781332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)

נוקלאוטיד אנלוגי, 4-thiouracil (4tU), הוא נלקח בקלות על ידי תאים שולבו ל-RNA כפי שהוא מופק ב vivo, המאפשר בידוד של RNA המיוצר בתקופה קצרה של תיוג. הדבר נעשה על-ידי הצמדת ביוטין moiety לקבוצת thio המשולבת ולטיהור אהדה, תוך שימוש בחרוזים streptavidin מצופים. השגת תשואה טובה של רנ א טהור, מסונתז לאחרונה, כי הוא ללא מקדם RNA קיים מבצע התוויות קצר יותר פעמים האפשרי והיתרים מוגברת ברזולוציה הטמפורלית במחקרים קינטית. זהו פרוטוקול עבור מאוד ספציפי, תשואה גבוהה לטיהור של RNA מסונתז לאחרונה. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר כיצד ה-RNA מופק מתוך שמרים סרביסים cerevisiae. עם זאת, את הפרוטוקול לטיהור של RNA thiolated מ-RNA הכולל צריך להיות יעיל באמצעות RNA מכל אורגניזם ברגע שהוא חולץ מן התאים. רנ א מטוהרים מתאים לניתוח על ידי טכניקות רבות בשימוש נרחב, כגון הפוכה transcriptase-qPCR, RNA-seq ו סלאם-seq. הספציפיות, הרגישות והגמישות של טכניקה זו מאפשרים תובנות ללא תחרות לחילוף החומרים של RNA.

תשואה אופיינית עבור nsRNA התאושש באמצעות פרוטוקול ers4tU זה מוצגים באיור 1b, זה כבר הופק על ידי bioanalyzer ומעקב מראה התשואה של RNA לעומת גודל (נוקלאוטידים [nt]). הערה, הן במעקב bioanalyzer ואת הגרף הכניסה, כי התאוששות RNA מנקודת זמן 0 הוא חלק קטן מאוד מאשר התאושש מנקודות זמן ארוכות יותר-כ 0.3 μg של RNA התאושש כ 109 תאים לעומת יותר פי שניים לאחר רק 30 s של תוויות (0.8 μg של nsRNA) ממספר זהה של תאים. התאוששות RNA ב 15 s הוא משתנה יותר כמו הבדלים קטנים בביצוע הדגימה יש השפעה גדולה יחסית על התאוששות RNA. ב-bioanalyzer מעקב, rRNA מראש ניתן לראות כשיא ליד 1000 nt ו בספק של פסגות בשנת 1700-1800 nt. השפע של הintermediates האלה גדל כמו המשיכה.
תיוו-תוויות שימשו לכמת שחבור של התמליל ACT1 (איור 3). Thiolation התבצע ודגימות שנלקחו במרווחי 15 s מתחילתו של thio-התוויות ועיבוד של ACT1 RNA במעקב (איור 3a, b). כפי שניתן לראות, pre-mRNA נוצר (על ידי תמלול), ו לאריטים (על ידי הצעד הראשון של החדרת pre-mRNA), גם לאחר רק 15 s של תיוג. לאחר כ 45 s עד 1 דקות, כמויות של לאריטס ו-mRNA להגיע לשיווי משקל עם הרבה מינים אלה RNA שנוצר על ידי שעתוק כמו מעובד משם על ידי שחבור.
כדי להפיק את הנתונים המוצגים באיור 3 ג המתח היה פעמו עם 4tu עבור 25 s ולאחר מכן רדפו עם uridine. הדור של טרום mRNA ולאריטס מגיע למקסימום בדקה אחת. זה משתווה היטב עם איור 3b; מקסימום להיות מושגת לאחר 45 s להגיע לשיווי משקל בתוספת 25 s של התוויות. לאחר השיא, הירידה ברמות כאשר RNAs המסומנת מתויג הם רדפו בתהליך החדרת.
איור 3d מראה דלדול של גורם החדרת חלבון והשפעתו על מטבוליזם RNA, באמצעות מערכת הסיוע β-est 4u6,7. כאן, Prp16p מופחת מרמות פיזיולוגיות הסמוך ל 5% ברמה זו לאחר 25 דקות של דלדול. Prp16p הוא גורם החדרת מהותי לשלב השני של החדרת15. לאריטס יוסרו במהלך השלב השני של שחבור (איור 3a), אבל כאן הם מגבירים מעל רמה של Pre-Mrna כמו Prp16 הופך הגבלת. במועד מאוחר יותר דלדול פעמים, גורמים אחרים הופכים הגבלה בשל השפעות משניות, כך רמות של לאריב ירידה, ו-mRNA רמות עלייה. רמת הסדר של מחלקת משולבים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> איור 1: צמיחה ב-4tU ו-RNA התאוששות. (a) 4-thiouracil משפיע על הצמיחה. הגדלת הריכוז של 4tu in מדיום הירידה ymm הצמיחה ללא אורציל מגביר את זמן ההכפלה של S. cerevisiae ס (BY4741) נושאת את p4FuiΔPEST פלמיד. צמיחה של ארבע תרבויות שכפול היה תחת פיקוח 30 ° צ' ב Tecan אינסוף Pro 200. כל התרבויות היו בשלב היומן ברחבי, עם OD600 בין 0.1 ו 0.6. ללעוג היא תרבות שליטה עם כמות שוות ערך של NaOH הוסיף, אשר לא על ידי עצמו לשנות את קצב הצמיחה. גרף זה מדגים כי התוויות הוא פשרה בין תוויות מהירות ונזק לתא. קווי שגיאה הם שגיאה סטנדרטית של 4 שכפול. (ב) התפוקה של המאה ה-rna מגדילה ליניארי מ-15 שנות תוויות. הדמות העיקרית מראה את העקבות הביומנתח של מטוהרים, nsRNA מ -0 (לא thiolated) כדי 2 דקות לאחר התוספת של 4tU במרווחי זמן של 15. שים לב שדגימת 15 הs אינה מוצגת, מאחר שהיא לא היתה זהה למדגם שאינו מתויג. שתי הפסגות הגדולות מתאימות לריבוזומאלה RNAs (rRNAs). הסמנים הפרדיים והintermediates של rRNA גלויים כמספר פסגות במשקל מולקולרי גדול יותר מאשר Rrna בוגרת. ההתאוששות של אלה מintermediates ומגדיל עם הזמן. תוצאות מניסוי מייצג אחד מוצגות. גרף הכניסה מראה את ההתאוששות של nsRNA עם דגירה הגוברת עם 4tU. התשואה של nsRNA גדל עם הגדלת זמן הצמיחה עם 4tU. ההחלמה היא לינארית במידה ניכרת (R2 = 0.934) לאורך ציר הזמן של הניסוי הזה ומראה עלייה קלה על הרקע אפילו על התוויות 15 s עם 4tu גם אם לא להבדיל מן המדגם בלתי מתויג על ידי עין מן הביומנתח עקב. קווי שגיאה מציגים שגיאה סטנדרטית עבור שלושה משכפל ביולוגי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> איור 2: β-Est 4U סיוע β-EST עזר הפרוטוקול הגרפי 4u. סיכום גרפי של הפרוטוקול של פרוטוקול 4U הβ ביותר לסיוע. β-estradiol (β-est) מקדם את הביטוי של המכשיר inducible degron (סיוע) מערכת אשר בתורו מרוקן את הסיוע * מתויג מטרה חלבון, מתייחסים ברז ואח '7 עבור פרוטוקול מפורט. במקרה זה, ביטוי מערכת degron הוא יזם 25 דקות לפני השפלה החלבון מתחיל ו-thiolation בכל נקודת זמן היא עבור 1 דקות. דגימות נלקחים לפני האינדוקציה כל 2 דקות במהלך דלדול. גירסה מונפשת מופיעה באיור המשלים 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> איור 3: סמנים מוקדמים וintermediates של שחבור ACT1 RNA. שחבור של ACT1 Pre-mrna התעתיקים היה מפוקח על ידי שעתוק הפוכה כמותית PCR16. רמות של ACT1 קודמן (Pre-mrna), ביניים לאריב-exon2 (לאריב) מוצר משולבים (mrna) מוצגים מנורמל נגד רמת ACT1 exon2 ורמות המצב יציב של rnas אלה. (א) מיקום מוצרי qpcr בתעתיק ACT1. סכמטית של המיקומים של מוצרי qPCR המשמשים כדי לטפל ברמות של טרום סמנים, intermediates ומוצרים של התגובה החדרת של התעתיקים ACT1 16. Exons מיוצגים על ידי תיבות, אינטרון כמו קו ואת מוצרי qpcr כקווים עם יהלומים בכל קצה, הצבע תואם אלה המשמשים את הגרפים. הPCR pre-mRNA הוא ספציפי עבור pre-mRNA ולא כל intermediates של שחבור כמוצר זה חוצה את נקודת ההסתעפות אשר מופרת לאחר השלב הראשון של החדרת. לאריב ה-PCR יזהה את התוצר של השלב הראשון של החבור ושל האריאריוס המגורש שהופק לאחר השניה. המרכז לייצור מוצרים מיוחדים. תוצאות ה-PCR (הקיים בכל הסמנים, הintermediates והמוצרים, למעט הארילון) אינו מוצג בגרפים, משום שנעשה שימוש בכדי לנרמל את הנתונים ולכן הוא שווה תמיד ל -1. (ב) רצף שוטף. כמות pre-mRNA עולה עם הזמן כמו 4tU משולב על ידי תמלול, לאחר עיכוב קצר, החדרת ממיר אותו לתוך מוצרים ביניים משולבים exon2. רמות אלה pre-mRNA ו-לאריב מינים מזיהוי מעל הרקע לאחר כמה שפחות 15 s של צמיחה עם 4tU ולהגיע מקסימום לאחר כ 45 s של תיוג רציף עם 4tU, שבו הייצור שלהם מאוזנת על ידי המרה כדי משולבים mRNA ו/או השפלה. הערכים מנורמלות למצב הקבוע שלהם (הנקודה השמאלית ביותר של הגרף), ו-2 רמות להציג את המראה והעיבוד שלהם בהשוואה לתמלול של אקסון 2. כמו שחבור RNA של ACT1 הוא בעיקר co-transcript4,17 משולבים mrna במהירות הופך מינים שופע ביותר, הרמה שלה דומה לזה של אקסון 2. , שגיאה סטנדרטית של שלושה משכפל ביולוגי. כל אחד נכנס לטריפליאט (ג) דופק/צ'ייס. . דופק של 25 שניות ואחריו צ'ייס עם אורידיין לעומת רמות המצב היציב של RNAs אלה (שמאל ביותר הנקודה), הם בתחילה בשפע מאוד בבריכה החדשה מסונתז. רמות הירידה בהדרגה כאשר הם מעובדים ב-mRNA (או מושפל), רמות מתקרבות דומה מאוד רמות המצב יציב על ידי 5 דקות. שגיאה סטנדרטית של שלושה משכפל ביולוגי, כל אחד מגיע בטרילקאט. (ד) nsrna ומחסור בחלבון. שחבור של ACT1 Pre-mrna התעתיקים בפיקוח על ידי שעתוק הפוכה כמותית PCR כמו פאנל (א) על דלדול של חלבון Prp16 באמצעות המערכת degron מערכת כמתואר באיור 2. רמות החלבון Prp16 מוצגות גם בגרף המותוות כנגד ציר Y השני כאחוז של רמות לפני הדילול. Prp16 הוא מרכיב חיוני של הספאריאוחלק, חשוב במיוחד לשלב השני של החדרת הלוח (א), לאחר שלאריטים מושפל. כאשר צעד זה הופך להיות הגבלת לאריטס להצטבר בתחילה. בשלב מאוחר יותר נקודות החבור נכשלת לחלוטין, לאריטים אינם מיוצרים עוד ורמות pre-mRNA עלייה. קווי שגיאה הם שגיאה סטנדרטית של שלושה משכפל ביולוגי, כל אחד ממנו בטרילקאט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> איור 4: סיכום גרפי של מקטעי הפרוטוקול 1 עד 3. התאים הם thiolated עם 4tU ומותר לגדול כדי לשלב את נוקלאוטיד שונה לתוך RNA. ניתן להוסיף מיכל שחור של משחת שתיה כדי לאפשר נורמליזציה ברחבי נקודות זמן וניסויים. הדופק של 4tU יכול להיות נרדף באמצעות לא-thiolated uridine. ניתן לבצע את התיוג ברציפות מתוספת של 4tU או משינוי לתנאי הגדילה, התרבות ספליט ו-4tU הוסיף לתרבויות בתקופות הגדלות משינוי מצב הגדילה, אבל כל התוויות רק לזמן קצר. התאים נאספים, ו-RNA המוכנים מהתאים, רצוי להשתמש בשיטות הומוגניטוגרפיות והמבוססות על פנול. רנ א הוא biotinylated ולאחר מכן rna biotinylated מטוהרים מתוך ביוטין משולב באמצעות עמודה הדרה גודל. NsRNA הוא כעת מוכן לטיהור עם חרוזים streptavidin (סעיף 4, איור 5). מספרים באדום מקבילים למספרי השלבים בפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> איור 5: סיכום גרפי של מקטע הפרוטוקול 4. בהמשך מסעיפים 1 עד 3 (איור 4), החרוזים הstreptavidin חסומים ומדגם ה-RNA הביוטיליס שנוסף לחרוזים המוכנים. רנ א biotinylated נקשר החרוזים הstreptavidin ו RNA בלתי biotinylated הוסר ושטף. רנ א biotinylated הוא חומק מן החרוזים באמצעות βME וזירז מוכן למחקר נוסף. מספרים באדום מקבילים למספרי השלבים בפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: שיפור של התאוששות nsRNA מתאי שמרים עם וללא עותקים נוספים של היבואן בשעה 1 ו 3 דקות של התוויות thio-. שים לב כי Fui1 הוא היזם העצמי של שמרים מתבטאת 2 יקרומטר פלמיד. העותק גנומית של הגן הזה קיים בשני זנים אלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 2: גרסה מונפשת של β-Est 4U סיוע β-est הפרוטוקול הגרפי 4u. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1:4X_ ניסויים בתבנית. xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שם פלמיד</td>
			<td>יבואן/פרמאז</td>
			<td>סמן</td>
			<td>תגובה</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui</td>
			<td>
ס. cerevisiae ס Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td rowspan="2">Fui1 יבוא Uracil ו Uridine, מה שהופך אותו אידיאלי עבור ניסויים הדופק/מרדף.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2</td>
			<td>
ס. cerevisiae ס Fui1</td>
			<td>LEU2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui-ΔPEST</td>
			<td>
ס. cerevisiae ס Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td>מוטיב המזיק של Fui1 כבר בוטלה, כך חדירות אינו מושפל כאשר יש מספיק מתאיים אורציל עבור הצרכים של התא. עובד היטב בניסויים בתוויות ומשפר את ביצועי הדופק/מרדף.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fur</td>
			<td>
ס. cerevisiae ס Fur4</td>
			<td>URA3</td>
			<td>קואכאיל פרמאז</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">YEpEBI311</td>
			<td>ה. ספיינס ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2</td>
			<td rowspan="2">מילר ואח '11. מכיל גם גן HSV מידנין קינאז.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>. אני מבין</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">כל הפלמידים הם 2 יקרומטר מבוסס. כל p4 פלמידים ו פאט מבוססים על pRS16 סדרה של פלמידים. FUI1 ו FUR4 מבוטא מן היזמים האנדוגניים שלהם.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1: פלמידים המשמשים את הפרוטוקול הזה.

Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

השימוש העצמי אורציל לטיהור ברגישות ובמיוחד לטהר את ה-RNA החדש שהועתק מן השמרים סכביסיטאה.

מהירה מאוד וספציפית תיוג מטבולי של RNA ב Vivo עם 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

שיטה זו היא משמעותית מכיוון ששום פרוטוקול אחר אינו מאפשר לנתח RNA מסונתז חדש בסולם זמן כה קצר, ולאפשר ניסויים במרדף אחר דופק עם דופק כה קצר. פרוטוקול זה פועל היטב עם דלדול חלבונים, כגון פרוטוקול BEST AID 4U. היתרון העיקרי הוא שהרקע נמוך.זה מאפשר את זמני התיוג הקצרים, על ידי הסרת כמעט כל RNA nonthiolated. הפרוטוקול הכתוב מפרט גם סוגים רבים ושונים של ניסויים שניתן לבצע וכיצד לשלב אותם בטכניקה זו. כדי להתחיל בהליך זה, לגדל שמרים בינוני YMM ל OD 600 בין 0.6 ו 0.8.במכסה המנוע של האדים, הוסיפו מתנול השווה ל-30 עד 50% מנפח הדגימה המיועד לצינור של 50 מיליליטר. סוגרים את הצינורות בחוזקה, מתייגים אותם ומ מניחים אותם על קרח יבש כדי לצנן. לאחר מכן, סמן שני צינורות מיליליטר לאחסון לטווח ארוך של הדגימות והנח על קרח כדי להתקרר.מוסיפים גם גם זירקוניה לשני צינורות המיליליטר. מצננים לפחות מיליליטר מים לדגימה על קרח. אם יש להוסיף ספייק S.pombe לתרבות, מניחים aliquot של תאי S.pombe thiolated על קרח להפשיר.וורטקס ההפשרה והוסיף אותה לתרבות. לאחר מכן מוסיפים 4tU לתרבות לריכוז של 10 מיקרומולרים ומערבבים במרץ. Thio-label לאורך זמן בין 15 שניות לחמש דקות.קח דגימות של התרבות במרווחי זמן קבועים לסוף קורס הזמן. מוסיפים כל דגימה לאחד מצינורות הצנטריפוגה המוכנים המכילים מתנול. לאטום כל צינור, לנער לערבב ביסודיות, ומקום על קרח יבש.ברגע שכל הדגימות נלקחו, שים את כולם על קרח. ודא שאף אחת מהדגימות לא קפאה. אם יש להקפיא, לחמם אותם בעדינות ביד תוך היפוך מתמיד.צנטריפוגה התאים ב 3, 000 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי גלולה את התאים. יוצקים את הנוזל, ו resuspend את גלולה לפחות מיליליטר אחד של מים קרים קרח על ידי צינורות במרץ למעלה ולמטה. מעבירים את ההשעיה לצינור כובע הבורג המוכן ומ מניחים את הצינור על קרח.צנטריפוגה הדגימות לזמן קצר במהירות גדולה מ 13, 000 פעמים g כדי מחדש גלולה את התאים. ואז למקם אותם בחזרה על קרח, ולהסיר את הנוזל. ראשית, להוסיף 400 microliters של מאגר AE, 40 microliters של SDS, ו 800 microliters של פנול ב pH נמוך.יש להתריע מחדש על ידי מערבולת למשך 10 שניות. ואז lyse התאים homogenizer במשך שלוש שתי דקות צרורות בהגדרת הכוח הנמוכה ביותר. השאירו את הדגימות על הקרח לשתי דקות בין פולסים הומוגניזציה.מניחים את התאים lysed על קרח יבש במשך חמש דקות עד שהוא מתגבש. לאחר מכן, השתמש microcentrifuge לסובב את התאים במהירות מעל 13, 000 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לבצע מיצוי פנול כלורופורם וחילוץ כלורופורם כמתואר בפרוטוקול הטקסט.מוסיפים בין 1/3 ל 1/2 של נפח של 10 ליתיום כלוריד טוחן ומערבבים כדי לזרז את RNA. צנטריפוגה במהירות מעל 13,000 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את הנוזל, ולסובב מחדש בקצרה את המדגם כדי להסיר את dregs.לאחר מכן, לשטוף את גלולה עם 300 כדי 500 microliters של 70% אתנול. צנטריפוגה גלולה שטף בקצרה, ולהסיר כל אתנול שנותר. ממיסים מחדש את גלולת ה-RNA ב-90 מיקרוליטרים של TE ב-pH 7.0 על ידי חימום ב-65 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות.לאחר בדיקת מינון RNA מלא, להעביר את ההשעיה לצינור 0.2 מיליליטר. כדי להתחיל, biotinylate על ידי הוספת 10 microliters של פתרון HPDP-ביוטין ל- RNA ומערבבים ביסודיות. דגירה בחושך ב 65 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 30 דקות.לאחר מכן, הכן אמצעי אחסון קטן של שרפין, עמודת אי-הכללת גודל כדי לא לכלול את הביוטין הלא מאוגד. הסר את התג התחתון של העמודה, שחרר את המכסה והצב את העמודה בצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר. צנטריפוגה ב 1, 500 פעמים גרם לדקה אחת כדי לשטוף את המאגר ולהשליך את הזרימה דרך.לאחר מכן הוסף בעדינות 0.3 מיליליטר של TE לראש העמודה וסובב שוב באמצעות אותם תנאים. מעבירים את העמוד השטוף לצינור טרי של 1.5 מיליליטר. לאחר השלמת הדגירה לדוגמה, הוסף את הדוגמה לראש העמודה.צנטריפוגה ב 1, 500 פעמים גרם במשך שתי דקות, עוזב את מדגם RNA biotinylated בתחתית הצינור. מחק את העמודה. ולהוסיף 1/3 ל 1/2 נפח של 10 ליתיום כלוריד טוחן לצינור המכיל את המדגם.מערבבים כדי לזרז מחדש את ה-RNA. ראשית, ממיסים מחדש את ה-RNA ב-200 מיקרוליטרים של מים שטופלו ב-DEPC. למדוד את ריכוז RNA, ולחשב כרכים עבור כל מדגם זה ייתן כמויות שוות של RNA עבור כל הדגימות.הוסף כמות זו של RNA לצינור טרי, והוסף מים שטופלו ב- DEPC בחזרה לנפח כולל של 200 מיקרוליטרים. כאשר מדגם הוא בטמפרטורת החדר, להוסיף 25 microliters של 10 x מאגר NaTM, 25 microliters של נתרן פוספט טוחן אחד, ו 2.5 microliters של 10% SDS. מערבבים היטב, וצנטריפוגה בעדינות בערך 100 פעמים g במשך פחות מ 30 שניות.הכן שני מיליליטר של מאגר חרוזים עבור כל מדגם עם מאגר NaTM אחד, 0.1 נתרן פוספט טוחן, ו 0.1% SDS. הוסף 50 microliters של חרוזים סטרפטבידין לצינור שימור נמוך 1.5 מיליליטר. מניחים את הצינור על המדף המגנטי ומחכים עד שהחורוזים יתיישבו.לאחר מכן, להסיר את הנוזל על ידי שאיפה. כדי לשטוף את חרוזים, להוסיף 200 מיליליטר של חיץ חרוזים ומערבולת עד גלולת חרוזים הוא resuspended באופן מלא. צנטריפוגה הצינור בערך 100 פעמים g לכל היותר חמש שניות.מניחים את הצינור במתלה המגנטי כדי לאפשר את חרוזים להיתפס על ידי המגנט. הסר את הנוזל על ידי שאיפה אם יש מספר קטן של דגימות. יוצקים את הנוזל ולאחר מכן שאף אם יש דגימות רבות.חסום עם 200 מיקרוליטרים של חיץ חרוזים, 10 מיקרוליטרים של גליקוגן ו-2.5 מיקרוליטרים של tRNA. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות תוך סיבוב סוף מעל סוף במהירות מתונה. לאחר מכן, הסר את הנוזל ושטף שוב, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.יש למפות את החמרוזים בדגימה, ולהדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך כדי סיבוב. במהלך הדגירה הזו, הכינו צינור טרי של 1.5 מיליליטר לכל דגימה. הוסף 1/10 נפח של שלושה אצטט נתרן טוחן ב pH 5.3 ו 20 מיקרוגרם של גליקוגן.צנטריפוגה בערך 100 פעמים g במשך שלוש שניות. הסר את ה- RNA הלא מאוגד מהחרוזים ושטף אותם כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי לסלק את ה-RNA, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של בטא מרפטנול בטא טרי שהוכן טרי לחרוזים.לאחר מערבולת וצנטריפוגה, מניחים את תרחיף במדף המגנטי. פיפטה RNA המכיל פתרון לתוך צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר מוכן. אלוט פעם נוספת כפי שתואר קודם לכן.לאחר מכן, מניחים את המדגם בחזרה במתלה המגנטי כדי להסיר שאריות חרוזים מן RNA אלוט ולהעביר את הנוזל טרי, כריכה נמוכה 0.5 צינור צנטריפוגה מיליליטר. מערבבים את הדגימה. ולאחר מכן להוסיף 2.5 כרכים של אתנול כדי לזרז nsRNA.לאחר ערבוב ודגירה, צנטריפוגה במהירות של לפחות 13, 000 פעמים g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. תשואות אופייניות עבור snRNA התאושש באמצעות פרוטוקול זה מוצגים כאן. שים לב כי התאוששות RNA בנקודת זמן אפס הוא חלק קטן מאוד של זה התאושש מנקודות זמן ארוכות יותר עם רק 0.3 מיקרוגרם של RNA להיות התאושש מכ 30 מיליארד תאים.לאחר רק 30 שניות של תיוג, עם זאת, מעל פי שניים RNA נאסף מאותו מספר של תאים. בעקבות הביואנליזה, ניתן לראות את מבשרי הרנ"א שלנו כשיא ליד 1,000 נוקלאוטידים וכפול פסגות ב-1, 700 עד 1, 800 נוקלאוטידים. השפע של ביניים אלה עולה ככל שהתיול נמשך.Thiolation מבוצע לאחר מכן עם דגימות נלקח במרווחים של 15 שניות מתחילת תיו-תיוג ואת העיבוד של תעתיק RNA ACT1 מנוטר. כפי שניתן לראות טרום mRNA ו lariats נוצרים גם לאחר רק 15 שניות של תיוג. לאחר כ -45 שניות עד דקה אחת, כמות lariats ו pre-mRNA להגיע שיווי משקל עם כמה שיותר של מינים אלה RNA נוצר על ידי שעתוק כפי מעובדים משם על ידי שזור.הצעדים הקשים ביותר הם אלה המערבים את חרוזים, כביסה, וחסימה. היזהר לא לאבד את חרוזים, או לתת להם להתייבש. לאחר שתטהר RNA מסונתז חדש, תוכל להשתמש בכל הליך ניתוח RNA מסורתי.מומלץ להפעיל את ה- RNA על אנליזה ביולוגית או דומה. לאחר מכן, אנו משתמשים בדרך כלל ב- QPCR וב- RNA-Seq כדי לנתח את ה- RNA. שיטה זו הוכיחה אידיאלית לניתוח הקינטיקה של עיבוד RNA.השלבים המסוכנים ביותר הם אלה באמצעות פנול וכלורופורם בחילוץ RNA. בכל פעם שאתה משתמש בכימיקלים אלה במיכל לא חתוך, לעשות זאת ברדס אדים, וללבוש בגדים מגן מתאימים, חלוק מעבדה, וכפפות. יש לדאוג במיוחד כי אין חרוזים זירקוניה בחוט של צינור כובע בורג, כמו זה יוביל דליפה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

מיצוי RNA מהיר וחסכוני של רקמת הלבלב חולדה

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...