Name: extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00
Duration: 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Wellcome finansiering til JB [104648]. Arbeid i Wellcome senter for Cell Biology er støttet av Wellcome kjerne finansiering [092076]. Forfatterne erkjenner medlemmer av laboratoriet for deres hjelp: Bella sentimental, Emanuela Sani, Susanna de Lucas-Arias og shiney George. Forfatterne vil også gjerne takke Patrick Cramer for plasmider YEpEBI31111.

<ol>
	<li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine.">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513 (2018).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li><li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity.">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li><li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast.">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li><li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion.">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA's+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression.">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li><li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).</li><li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li><li>R&#228;dle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis,+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture.">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).</li><li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics.">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li><li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system.">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li><li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboSys,+a+high-resolution,+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3&#8242;-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3&#8242;-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li><li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+fast+and+incredibly+close:+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast.">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li><li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters.">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li><li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast.">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li><li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimeLapse-seq:+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding.">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne artikkelen presenterer en protokoll for ekstremt rask og spesifikk 4tU merking, for gjenvinning av begynnende, nylig syntetisert RNA fra S. cerevisiae etter så lite som 15 S for merking, med svært lav forurensning av umerkede RNA.
Brukeren bør alltid sørge for å opprettholde integriteten til RNA-en ved bruk av kalde temperaturer og DEPC-behandlede reagenser. Streptavidin perle rensing er generelt pålitelig; perle bufferen er imidlertid vanskelig å håndtere; Det må gjøres fersk, med sine komponenter lagt i riktig rekkefølge, og ikke kjølt eller autoklaveres. Vanlige svakheter omfatter RNA-ufullstendig som oppløses etter nedbørs trinnene, og det blir heller ikke biotinylated eller på annen måte tapt under behandlingstrinnene. Det er omfattende hjelp til feilsøking i Tilleggsmaterialet.
Det er noen begrensninger å være klar over i ers4tU. En allerede nevnt er at 4tU bremser veksten av gjær (figur 1a). Bortsett fra endogenously thiolated RNAs9, kan bare RNAs som har blitt skrevet ut i løpet av merkings perioden, renses ved denne metoden. Polymerases stanset på gener gjennom thiolation tiden vil ikke produsere thiolated transkripsjoner som kan renses, selv om transkripsjoner som er delvis merket på grunn av Polymerases inn eller forlate en pausetilstand under thiolation kan gjenopprettes. Stammer som transkribere dårlig, enten på grunn av mutasjon eller vekstforhold, produsere lite nsRNA, selv om teknikkene som brukes her vil likevel forbedre utvinningen av nsRNA i forhold til andre metoder. Lengre tider og økt kultur volumer kan være nødvendig i disse stammene og forhold. Merk at uracil er en god kilde til nitrogen og så denne metoden bør være trialed før de brukes for studier som involverer nitrogen sult.
Den ers4tU protokollen er spesielt nyttig for analyse av kortvarig RNAs, hvorav mange er så raskt degradert at de ikke kan identifiseres uten ødeleggende den fornedrelse maskineri. Eksempler er kryptiske ustabile transkripsjoner (CUTs)4, og korte transkripsjoner produsert av tidlig avslutning eller promoter proksimale pause18 og antisens transkripsjon "oppstrøms" fra en promoter (ber)19. De mellom produkter produsert under prosessering av stabile RNA arter er også forbigående, men kan bli beriket ved hjelp av ers4tU transkripsjon4. Ers4tU-protokollen er derfor eksepsjonell i å tillate svært forbigående RNA-arter å bli analysert og tatt under nær fysiologiske forhold, som er en stor fordel i forhold til andre metoder. Denne teknikken har blitt brukt til å studere transkripsjon og nedstrøms RNA prosessering Kinetics i RNA polymerase mutanter som forlenge raskere eller tregere enn normalt20.
Thiolation er likeledes forenlig med RNA-SEQ og SLAM-SEQ21, tillater alle RNA produsert innen en meget kort tid vindu å bli kjennetegnet inne utsøkt detaljen.

RNA har en dynamisk natur; snart etter at den er produsert mye RNA er raskt behandlet og degradert. Foreløpig de fleste studier av RNA metabolisme analysere den totale cellulære RNA, som er mest fullstendig behandlet og på steady state nivå. Dette nivået avhenger av balansen mellom utbredelsen av transkripsjon, post-transcriptional modning og degradering. Analyse av prosesser som fører til steady state likevekt krever spesialiserte teknikker for å fange svært kortvarig RNA arter.
Metabolsk merking av RNA med nukleotid analoger som 4-thiouracil (4tU) eller 4-thiouridine (4sU) (se Duffy et al.1 for en utmerket vurdering), gir muligheten til å isolere Alkyltiokarbamid begynnende RNAs og deres prosessering mellom produkter. Men publiserte protokoller innebære merking ganger av flere minutter2,3, som er langsom i forhold til frekvensen av produksjonen av mange transkripsjoner. Det tar i rekkefølgen av ett minutt å transkribere gjennomsnittlig gjær genet, så merking gjær RNA for mindre enn ett minutt kan betraktes som svært kort. Den ekstremt raske og spesifikke 4 thiouracil protokollen (ers4tU) maksimerer signal til støyforhold ved å maksimere 4tU innlemmelse og minimere utvinningen av umerkede, eksisterende RNA gjør svært kort merking ganger mulig4.
Den alkyltiokarbamid basen må importeres til cellene raskt og i tilstrekkelig mengde til å merke den nye syntetisert RNA (nsRNA) på en effektiv måte. For å fremme dette, er celler dyrket i uracil medium, og uttrykk for en passende permease bidrar til å øke 4tU eller 4sU opptak (se tabell 1 for en liste over plasmider som bærer egnede permease gener og supplerende figur 1). 4tU's løselighet i natriumhydroksid unngår behovet for giftige organiske løsemidler som kreves av andre nukleotid analoger. Dessverre har det blitt observert voksende kulturer i lange perioder med alkyltiokarbamid nucleosides ved konsentrasjoner som er større enn 50 μM for å forstyrre ribosomer5. Men konsentrasjonen (10 μM) brukes her, og den ekstremt korte merking ganger, minimere skadelige effekter5 (figur 1a), mens fortsatt gir tilstrekkelig RNA for analyse.
Denne teknikken kan kombineres med rask og spesifikk auxin-mediert forringelse av et mål protein6,7 (figur 2), referert til som "β-EST Aid 4U" protokollen, der β-østradiol regulert uttrykk for auxin induserbart degron (AID)-systemet kombineres med 4tU-merking. Med β-EST AID 4U-tilnærmingen kan et mål protein tømmes og effekten på RNA-metabolismen overvåkes nøye (figur 2). Timingen er kritisk; Det er tilrådelig å vise den med følgende videoen og følge nøye med på figur 2 og dens animerte form (se supplerende figur 2).
Prosessering og nedbrytning av RNA må stoppes svært raskt for nøyaktig tidsoppløsning. Dette oppnås ved hjelp av metanol ved lav temperatur, som fikser celleinnholdet svært raskt og forringer cellemembranen samtidig bevare nukleinsyre syre innhold8. RNA-ekstraksjon skal være effektiv og ikke skade RNA-en. Mekanisk lyse er effektivt i fravær av chaotropic midler (ofte disse inneholder alkyltiokarbamid grupper, så bør unngås). Lithium klorid utfelling av RNA foretrekkes, da tRNAs er mindre effektivt igangsatte. tRNAs er raskt kopieres og naturlig thiolated9, så fjerner tRNAs reduserer konkurranse for biotinylation reagens. Hvis små, svært strukturerte RNAs er av interesse, anbefales alkohol-baserte RNA nedbør metoder.
For å gjenopprette thiolated RNA, er biotin covalently festet via de alkyltiokarbamid gruppene innlemmet i RNA med 4tU. Bruk av modifisert biotin, som festes via et spaltbare disulfide (f.eks. HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3 ́-(2 ́-pyridyldithio)pRopionamide,) eller MTS-biotin (metan thiosulfonate)) anbefales som det tillater utgivelsen av RNA ved tilsetning av et reduksjonsmiddel. Biotinylated RNA er affinitet renset på streptavidin koplet til magnetiske perler. Denne protokollen er lik andre som er oppført tidligere10 , men har vært intensivt optimalisert for å redusere bakgrunnen.
Det finnes to typer tiolderivat-eksperiment som kan utføres, kontinuerlig og usammenhengende merking. Hver har sine egne fordeler. I kontinuerlig merking legges 4tU til kulturen og prøvene som tas med jevne mellomrom. Denne typen eksperiment viser hvordan RNA-en behandles, og hvordan nivåene endres over tid. Eksempler er sammenligning av mutant med vill-type eksperimenter og et puls-jage eksperiment. Eksperimentene som vises i figur 3B, c er av denne typen. For usammenhengende merking en endring er indusert inn i systemet og RNA overvåkes. Når endringen har blitt indusert kulturen må deles inn i flere sub-kulturer, og til bestemte tider, hver og en er så alkyltiokarbamid-merket for en kort periode. Et eksempel er β-EST AID 4U vist i figur 27. Denne typen eksperiment er spesielt nyttig for å overvåke effekten av en metabolsk endring på RNA-behandling (se figur 3D).
En grafisk fremstilling av et alkyltiokarbamid-eksperiment er presentert i Figur 4 og figur 5, og et regneark som i stor grad forenkler ytelsen til protokollen er tilgjengelig (se 4tU eksperiment mal. xlsx). I tillegg til dette inneholder utfyllende informasjon en omfattende feilsøkingsveiledning. For β-EST AID 4U-protokollen som integrerer 4tU-merkingen med auxin-protokollen, se figur 2 og supplerende figur 2. Se Barrass et al.7 for den detaljerte nød tømming protokollen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#946;-mercaptoethanol (&#946;ME)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M3148</td>
			<td >CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25668</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMF (N,N-dimethylformamide)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td >Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EZ-link HPDP Biotin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21341</td>
			<td >Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark &#38; at -20 &#176;C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 &#176;C to resuspend.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Fisher Scientific&#160;</td>
			<td >G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen [20 mg/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10901393001</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>77712</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793620</td>
			<td >10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >63033</td>
			<td >1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >M/4000/PC17</td>
			<td >CAUTION Toxic and flammable</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td rowspan="2">Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-M</td>
			<td>5 M solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol, low pH.&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce Spin Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69702</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SCSM single drop-out &#8211;ura</td>
			<td >Formedium&#160;</td>
			<td >DSCS101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32318-M</td>
			<td>Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td>CAUTION corrosive</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >436143</td>
			<td>CAUTION irritant, do not inhale</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>NEB</td>
			<td>1420S</td>
			<td>Store at 4&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUPERase-In, RNase inhibitor</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See section 1.7 of the protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-thiouracil (4tU)&#160;</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>359930010</td>
			<td>Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >93362</td>
			<td>1 M solutions at various pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>5mg/ml, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base without amino acids&#160; with amonium sulphate</td>
			<td >Formedium</td>
			<td >CYN0410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeba Columns 0.5ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zirconia beads</td>
			<td>Thistle Scientific</td>
			<td>110791052</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beadbeater</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>112011EUR</td>
			<td >Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 &#176;C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="3" >Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H179467N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 50 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td rowspan="2" >Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, 2 mL, screw cap</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>723361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids</td>
			<td>Brand</td>
			<td >781332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)

Nukleotid analoge, 4-thiouracil (4tU), er lett tatt opp av celler og innlemmet i RNA som det er skrevet i vivo, slik at isolering av RNA produsert i en kort periode med merking. Dette gjøres ved å feste en biotin moiety til innarbeidet alkyltiokarbamid gruppe og affinitet rensing, ved hjelp av streptavidin belagt perler. Å oppnå en god avkastning på ren, nylig syntetisert RNA som er fri for eksisterende RNA, gjør kortere merking ganger mulig og tillater økt Temporal oppløsning i kinetisk studier. Dette er en protokoll for svært spesifikke, høykapasitets rensing av nylig syntetisert RNA. Protokollen som presenteres her beskriver hvordan RNA er Hentet fra gjær Saccharomyces cerevisiae. Protokollen for rensing av thiolated RNA fra total RNA bør imidlertid være effektiv ved hjelp av RNA fra en hvilken som helst organisme når den er Hentet fra cellene. Renset RNA er egnet for analyse av mange brukte teknikker, slik som Reverse transkriptase-qPCR, RNA-SEQ og SLAM-SEQ. Spesifisitet, følsomhet og fleksibilitet av denne teknikken gir uovertruffen innsikt i RNA metabolisme.

Typisk avkastning for nsRNA utvinnes ved hjelp av denne ers4tU protokollen vises i figur 1B, dette har blitt produsert av en bioanalyzer og spor viser utbytte av RNA versus størrelse (nukleotider [NT]). Merk, både i bioanalyzer og den innfelte grafen, at RNA-gjenoppretting fra punkt 0 er en svært liten del av den som utvinnes fra lengre tid punkter-omtrent 0,3 μg av RNA utvinnes fra ca. 109 celler sammenlignet med over dobbelt så mye etter bare 30 s med merking (0,8 μg av nsRNA) fra samme antall celler. RNA-gjenoppretting på 15 s er mer variabel som små forskjeller i utførelsen av sampling har en proporsjonalt større effekt på RNA-gjenoppretting. I det bioanalyzer sporet kan rRNA prekursorer ses på som en topp i nærheten av 1000 og en doublet på 1700 − 1800 NT. Overflod av disse mellom produkter øker som thiolation fortsetter.
Alkyltiokarbamid-merkingen ble brukt for å kvantifisere skjøting av ACT1 transkripsjon (Figur 3). Thiolation ble utført og prøver tatt ved 15 s intervaller fra starten av alkyltiokarbamid-merking og behandling av ACT1 RNA overvåket (figur 3a, b). Som det kan sees, pre-mRNA genereres (ved transkripsjon), og uforståelige (ved første trinn av skjøting fra pre-mRNA), selv etter bare 15 s av merking. Etter ca 45 s til 1 min, mengden av uforståelige og pre-mRNA nå likevekt med så mye av disse RNA artene blir skapt av transkripsjon som er behandlet bort av skjøting.
For å produsere dataene vist i figur 3c belastningen var pulserende med 4tU for 25 s og deretter jaget med uridindifosfatglukuronosyltransferase. Generasjonen av pre-mRNA og uforståelige når maksimalt 1 minutt. Dette sammenligner godt med figur 3b; maksimum oppnås etter 45 s for å nå likevekt pluss 25 s av merkingen. Etter toppen, nivåene nedgangen som alkyltiokarbamid-merket RNAs er jaget gjennom skjøting prosessen.
Figur 3D viser tømming av et protein skjøting faktor og dens effekt på RNA metabolisme, ved hjelp av β-EST Aid 4U system6,7. Her er Prp16p redusert fra nær fysiologiske nivåer til 5% av dette nivået etter 25 min av nedbryting. Prp16p er en viktig skjøting faktor for det andre trinnet av skjøting15. Uforståelige fjernes under det andre trinnet av skjøting (figur 3a), men her de øker over nivået av pre-MRNA som Prp16 blir begrensende. Ved senere nedbryting ganger, andre faktorer blir begrensende på grunn av sekundære effekter, slik at nivåer av lariat nedgang, og pre-mRNA nivåer stige. Nivået av skjøtes mRNA avslår.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> Figur 1: vekst i 4tU og RNA utvinning. (a) 4-thiouracil påvirker vekst. Øke konsentrasjonen av 4tU i YMM drop-out vekstmedium uten uracil øker dobling tiden av S. cerevisiae (BY4741) bærer p4FuiΔPEST plasmider. Veksten av fire replikere kulturer ble overvåket ved 30 ° c i en Tecan Infinite Pro 200. Alle kulturer var i logg fasen gjennom, med OD600 mellom 0,1 og 0,6. Mock er en kontroll kultur med en tilsvarende mengde NaOH lagt til, som ikke i seg selv endre vekstraten. Denne grafen viser at alkyltiokarbamid er kompromiss mellom rask merking og skade på cellen. Feil stolper er standard feil av 4 replikerer. (b) nsRNA yield øker lineært fra ca 15 s av merking. Den viktigste figuren viser bioanalyzer spor av renset, nsRNA fra 0 (ikke thiolated) til 2 min etter tilsetting av 4tU på 15 s intervaller. Merk at 15 s prøven ikke vises, da det var umulig å skille fra den umerkede prøven. De to store toppene tilsvarer ribosomal RNAs (rRNAs). Den rRNA forløpere og mellom produkter er synlige som flere topper på større molekylvekt enn eldre rRNAs. Utvinningen av disse forløpere og mellom produkter øker med tiden. Resultater fra ett representativt eksperiment vises. Den innfelte grafen viser utvinningen av nsRNA med økende inkubasjons med 4tU. Avkastningen av nsRNA øker med økende vekst tid med 4tU. Utvinningen er bemerkelsesverdig lineær (R2 = 0,934) gjennom hele tidsskalaen i dette eksperimentet, og viser en svak økning over bakgrunnen selv ved 15 s merking med 4tU selv om ikke skilles fra umerkede prøven av øyet fra bioanalyzer Spor. Feil stolper viser standard feil for tre biologiske replikeres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> Figur 2: β-EST Aid 4U β-EST Aid 4U grafisk protokoll. Et grafisk sammendrag av protokollen for β-EST AID 4U-protokollen. β-østradiol (β-EST) fremmer uttrykket av auxin induserbart degron (AID) system som i sin tur reduserer et AID * merket mål protein, se Barrass et al.7 for en detaljert protokoll. I dette tilfellet degron system uttrykk er initiert 25 min før protein degradering starter og thiolation på hver gang punktet er for 1 min. prøvene tas før induksjon og hvert 2. minutt under nedbryting. En animert versjon vises i supplerende figur 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> Figur 3: forløpere og mellom produkter av ACT1 RNA skjøting. Skjøting av ACT1 pre-mRNA transkripsjoner ble overvåket av KVANTITATIVE omvendt transkripsjon PCR16. Nivåene av ACT1 forløper (pre-mRNA), mellomliggende lariat-Exon2 (lariat) og skjøtes produkt (mRNA) vises normalisert mot nivået av ACT1 exon2 og steady state nivåer av disse RNAs. (a) plassering av qPCR produkter på ACT1 transkripsjon. Skjematisk av plasseringen av qPCR produkter som brukes til å analysen nivåene av forløpere, mellom produkter og varer av skjøting reaksjonen av ACT1 transkripsjoner16. Exoner representeres av esker, Intronets opprinnelse som en linje og qPCR-produktene som linjer med diamanter i begge ender, fargen matcher de som brukes i diagrammene. Pre-mRNA PCR er spesifikk for pre-mRNA og ikke noen mellom produkter av skjøting som dette produktet krysser grenen punktet som er forstyrret etter det første skrittet av skjøting. Lariat PCR vil oppdage produktet av det første skrittet av skjøting og excised lariat produsert etter den andre. Den mRNA PCR er spesifikk for produktet av skjøting, mRNA. Resultater fra ekson PCR (finnes i alle forløpere, mellom produkter, unntatt excised lariat) vises ikke i diagrammene da dette ble brukt til å normalisere dataene og er derfor alltid lik 1. (b) kontinuerlig thiolabelling. Mengden av pre-mRNA øker med tiden som 4tU er innarbeidet ved transkripsjon, og etter en kort forsinkelse, skjøting konverterer det til lariat-exon2 mellomliggende og skjøtes produkter. Nivåene av disse pre-mRNA og lariat arter er synlig over bakgrunnen etter så lite som 15 s av vekst med 4tU og nå et maksimum etter ca 45 s av kontinuerlig merking med 4tU, noe som peker deres produksjon er balansert ved konvertering til skjøtes mRNA og/eller degradering. Verdiene er normalisert til steady state (venstre-mest punkt i grafen), og ekson 2 nivåer for å vise sitt utseende og behandling i forhold til transkripsjon av ekson 2. Som RNA skjøting av ACT1 er i stor grad co-transcriptional4,17 skjøtes mRNA raskt blir den mest tallrike arter, er dens nivå lik som ekson 2. Standard feil av tre biologiske replikerer, hver analyseres i tre eksemplarer. (c) puls/Chase. Thiolation puls på 25 sekunder etterfulgt av jage med uridindifosfatglukuronosyltransferase. Sammenlignet med steady state nivåer av disse RNAs (venstre-mest punkt), er de i utgangspunktet svært rikelig i den nylig syntetisert bassenget. Nivåene gradvis avta som de er behandlet i mRNA (eller degradert), nærmer seg nivåer svært lik steady state nivåer med 5 min. standard feil av tre biologiske replikerer, hver analyseres i tre eksemplarer. (d) nsRNA og protein forringelse. Skjøting av ACT1 pre-mRNA transkripsjoner overvåkes av kvantitativ omvendt transkripsjon PCR som i panel (a) ved tømming av Prp16 protein ved hjelp av auxin degron systemet som beskrevet i figur 2. Prp16 protein nivåene er også vist i grafen plottet mot den andre Y-aksen som prosentandel av nivåer før auxin tømming. Prp16 er en viktig del av spliceosome, spesielt viktig for det andre trinnet av skjøting vist i panel (a), hvoretter uforståelige er degradert. Når dette trinnet blir begrensende uforståelige akkumuleres i utgangspunktet. På senere tidspunkt poeng skjøting svikter helt, uforståelige er ikke lenger produseres og pre-mRNA nivåer stige. Feil stolpene er standard feil på tre biologiske replikeres, hver analyseres i tre eksemplarer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> Figur 4: grafisk sammendrag av protokoll seksjonene 1 til 3. Cellene er thiolated med 4tU og lov til å vokse til å innlemme den modifiserte nukleotid inn i RNA. En thiolated S. pombe Spike kan legges til for å tillate normalisering på tvers av tids punkter og eksperimenter. Pulsen på 4tU kan bli jaget ved hjelp av un-thiolated uridindifosfatglukuronosyltransferase. Merking kan enten utføres kontinuerlig fra 4tU tillegg eller fra en endring til vekstforhold, kulturen splittet og 4tU lagt til kulturer i økende tider fra vekst tilstand endres, men hver merking bare for en kort tid. Cellene er samlet, og RNA forberedt fra cellene, fortrinnsvis ved hjelp av en homogenisator og fenol-baserte metoder. RNA-en er biotinylated og deretter biotinylated RNA-en renset fra en biotin med en størrelses ekskluderings søyle. NsRNA er nå klar for rensing med streptavidin perler (seksjon 4, figur 5). Tall i rødt tilsvarer trinn numrene i protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> Figur 5: grafisk sammendrag av protokoll delen 4. Etter på fra avsnittene 1 til 3 (Figur 4), blokkeres de streptavidin perlene, og biotinylated RNA-prøven legges til de forberedte perlene. Biotinylated RNA binder seg til de streptavidin perlene og den un-biotinylated RNA-en fjernes og vaskes. Biotinylated RNA er eluert fra perlene ved hjelp av βME og igangsatte klar for videre forskning. Tall i rødt tilsvarer trinn numrene i protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Supplerende figur 1: forbedring av nsRNA utvinning fra gjærceller med og uten ytterligere kopier av importøren på 1 og 3 minutter med alkyltiokarbamid. Merk at Fui1 er gjær egen promoter uttrykt fra en 2 μm plasmider. Den genomisk kopi av dette genet er til stede i begge disse stammene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 2: animert versjon av β-EST Aid 4U β-EST Aid 4U grafisk protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 1:4tU_experiment_template. xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmider navn</td>
			<td>Importør/permease</td>
			<td>Markør</td>
			<td>Kommentar</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td rowspan="2">Fui1 importerer Uracil og Uridindifosfatglukuronosyltransferase, noe som gjør den ideell for puls/jage eksperimenter.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>LEU2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui-ΔPEST</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td>PEST-motivet til Fui1 har blitt deaktivert, slik at permease ikke forringes når det er tilstrekkelig intracellulære uracil for cellens behov. Fungerer godt i merking eksperimenter og forbedrer puls/jage ytelse.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fur</td>
			<td>
S. cerevisiae Fur4</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Uracil permease</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">YEpEBI311</td>
			<td>H. sapiens ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2</td>
			<td rowspan="2">Miller et al.11. Inneholder også en HSV tymidin kinase gen.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(equilibrative nukleosid transporter)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Alle plasmider er 2 μm-baserte. Alle P4 plasmider og pAT er basert på pRS16 serien av plasmider. FUI1 og FUR4 er uttrykt fra sine egne, endogene arrangører.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: plasmider brukt med denne protokollen.

Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Bruken av thiolated uracil til følsomt og renser spesielt RNA fra gjær Saccharomyces cerevisiae.

Ekstremt rask og spesifikk metabolsk merking av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Denne metoden er viktig fordi ingen annen protokoll gjør at nylig syntetisert RNA kan analyseres på så kort tid, og tillate pulsjakteksperimenter med så kort puls. Denne protokollen fungerer godt med proteinuttømming, for eksempel Best AID 4U-protokollen. Den største fordelen er at bakgrunnen er lav.Dette tillater korte merking ganger, ved å fjerne nesten alle de ikke-thiolated RNA. Den skriftlige protokollen beskriver også mange forskjellige typer eksperimenter som kan utføres og hvordan du integrerer dem i denne teknikken. For å begynne denne prosedyren, vokse gjær i YMM medium til en OD 600 mellom 0,6 og 0,8.I en røykhette legger du til et metanol tilsvarende 30 til 50 % av det tiltenkte prøvevolumet til et 50 milliliter rør. Lukk rørene tett, merk dem og legg dem på tørris for å kjøle seg ned. Deretter merker du to milliliter rør for langtidslagring av prøvene og legger på is for å avkjøles.Legg zirkonia perler til de to milliliter rørene. Avkjøl minst en milliliter vann per prøve på is. Hvis en S.pombe pigg skal legges til kulturen, plasser en aliquot av thiolated S.pombe celler på is for å tine.Vortex den tinte aliquot og legge den til kulturen. Deretter legger 4tU til kulturen til en konsentrasjon på 10 mikromos og bland kraftig. Thio-label i en lengre periode mellom 15 sekunder og fem minutter.Ta prøver av kulturen med jevne mellomrom til slutten av tidskurset. Legg hver prøve til en av de tilberedte sentrifugerørene som inneholder metanol. Forsegle hvert rør, rist for å blande grundig, og legg på tørris.Når alle prøvene er tatt, plasser dem alle på is. Sørg for at ingen av prøvene har frosset. Hvis noen har frosset, varm dem forsiktig i hånden mens du inverterer hele tiden.Sentrifuge cellene på 3, 000 ganger g og ved fire grader Celsius i to minutter for å pellet cellene. Hell av væsken, og resuspend pellet i minst ett milliliter iskaldt vann ved kraftig pipettering opp og ned. Overfør suspensjonen til det klargjorte skrukorkens rør og plasser røret på isen.Sentrifuger prøvene kort med en hastighet som er større enn 13 000 ganger g for å re-pellet cellene. Legg dem deretter tilbake på isen, og fjern væsken. Først legger du til 400 mikroliter AE-buffer, 40 mikroliter SDS og 800 mikroliter fenol ved lav pH.Resuspend ved vortexing i 10 sekunder. Deretter lyse cellene i en homogenisator i tre to minutters utbrudd på den laveste strøminnstillingen. La prøvene stå på is i to minutter mellom homogeniseringspulser.Plasser de lysede cellene på tørris i fem minutter til den stivner. Deretter bruker du en mikrocentrifuge til å spinne cellene med en hastighet over 13 000 ganger g i fem minutter ved romtemperatur. Etter dette, utføre fenol kloroform ekstraksjon og kloroform ekstraksjon som beskrevet i tekstprotokollen.Tilsett mellom 1/3 til 1/2 av volumet av 10 molar litiumklorid og bland for å utløse RNA. Sentrifuge med en hastighet over 13 000 ganger g i fem minutter. Fjern væsken, og kort re-spinne prøven for å fjerne dregs.Vask deretter pelleten med 300 til 500 mikroliter på 70% etanol. Sentrifuger den vasket pellet kort, og fjern eventuelle gjenværende etanol. Oppløs RNA-pelletenen på nytt i 90 mikroliter TE ved en pH 7.0 ved oppvarming ved 65 grader Celsius mens du rister.Etter å ha sjekket for full RNA-solubilisering, overfør suspensjonen til et 0,2 milliliter rør. Til å begynne med, biotinyler ved å legge til 10 mikroliter HPDP-biotinløsning til RNA og bland godt. Inkuber i mørket ved 65 grader Celsius i 15 til 30 minutter.Deretter forbereder du et lite harpiksvolum, størrelsesekskluderingskolonne for å utelukke det innlemmede biotinet som ikke er innlemmet. Fjern den nederste koden på kolonnen, løsne hetten, og plasser kolonnen i et to milliliter sentrifugerør. Sentrifuge ved 1, 500 ganger g i ett minutt for å skylle ut bufferen og kaste gjennomstrømningen.Tilsett deretter forsiktig 0,3 milliliter TE øverst i kolonnen og spinn på nytt ved hjelp av de samme forholdene. Overfør den vasket kolonnen til et friskt 1,5 milliliter rør. Når eksempelinkubasjonen er fullført, legger du til eksemplet øverst i kolonnen.Sentrifuge ved 1, 500 ganger g i to minutter, slik at den biotinylererte RNA-prøven nederst på røret. Forkast kolonnen. Og tilsett 1/3 til 1/2 volum av 10 molar litiumklorid til røret som inneholder prøven.Bland for å utløse RNA på nytt. Først oppløse RNA i 200 mikroliter dePC-behandlet vann. Mål RNA-konsentrasjonen, og beregn volumer for hver prøve som vil gi like mengder RNA for alle prøver.Legg denne mengden RNA til et friskt rør, og tilsett DEPC-behandlet vann tilbake til et totalt volum på 200 mikroliter. Når en prøve er ved romtemperatur, tilsett 25 mikroliter med 10 x NaTM-buffer, 25 mikroliter av ett molarnatriumfosfat og 2,5 mikroliter med 10% SDS. Bland godt, og sentrifuger forsiktig ved ca. 100 ganger g i mindre enn 30 sekunder.Forbered to milliliter perlebuffer for hver prøve med én x NaTM-buffer, 0,1 molarnatriumfosfat og 0,1 %SDS. Tilsett 50 mikroliter streptavidin perler til en lav retensjon 1,5 milliliter rør. Plasser røret på magnetstativet og vent til perlene skal bosette seg.Fjern deretter væsken ved aspirasjon. For å vaske perlene, tilsett 200 milliliter perlebuffer og vortex til perlepelleten er helt resuspended. Sentrifuger røret på ca. 100 ganger g i maksimalt fem sekunder.Plasser røret i magnetstativet slik at perlene kan fanges opp av magneten. Fjern væsken ved aspirasjon hvis det er et lite antall prøver. Hell av væsken og aspirer deretter hvis det er mange prøver.Blokker med 200 mikroliter perlebuffer, 10 mikroliter glykogen og 2,5 mikroliter tRNA. Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter mens du roterer over ende ved moderat hastighet. Etter dette fjerner du væsken og vasker igjen, som beskrevet i tekstprotokollen.Resuspend perlene i prøven, og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter mens du roterer. Under denne inkubasjonen, lag et friskt 1,5 milliliter rør for hver prøve. Tilsett 1/10 volum av tre molarnatriumacetat ved pH 5,3 og 20 mikrogram glykogen.Sentrifuge ca. 100 ganger g i tre sekunder. Fjern den ubundne RNA fra perlene, og vask dem som beskrevet i tekstprotokollen. For å elute RNA, legg til 50 mikroliter med nylaget 0,7 molar beta mercaptoetanol til perlene.Etter vortexing og sentrifugering, plasser slurry i magnetstativet. Pipette RNA som inneholder oppløsning i de tilberedte 1,5 milliliter sentrifugerørene. Elute igjen som tidligere beskrevet.Deretter plasserer du prøven tilbake i magnetstativet for å fjerne gjenværende perler fra den rømte RNA og overføre væsken til et friskt, lavt bindende 0,5 milliliter sentrifugerør. Bland prøven. Og legg deretter til 2,5 volumer etanol for å utløse nsRNA.Etter blanding og inkubering, sentrifuge med en hastighet på minst 13,000 ganger g og ved fire grader Celsius i 20 minutter. Typiske utbytter for snRNA gjenopprettet ved hjelp av denne protokollen vises her. Merk at RNA-gjenoppretting på tidspunkt null er en svært liten del av det som utvinnes fra lengre tidspunkter med bare 0,3 mikrogram RNA blir gjenopprettet fra ca 30 milliarder celler.Etter bare 30 sekunder med merking samles imidlertid over dobbelt så mye RNA fra samme antall celler. I bioanalyzer-sporet kan våre RNA-forløpere ses som en topp nær 1000 nukleotider og en dobbel topp på 1700 til 1800 nukleotider. Overfloden av disse mellomprodukter øker etter hvert som tiolasjonen fortsetter.Tiolasjon utføres deretter med prøver som tas med 15 sekunders intervaller fra starten av tio-merking og behandling av ACT1 RNA-transkripsjon overvåkes. Som det kan ses pre-mRNA og lariats genereres selv etter bare 15 sekunder med merking. Etter ca 45 sekunder til ett minutt, mengden lariats og pre-mRNA nå likevekt med så mye av disse RNA arter blir opprettet av transkripsjon som behandles bort ved spleising.De vanskeligste trinnene er de som involverer perlene, vasking og blokkering. Vær forsiktig så du ikke mister perlene, eller for å la dem tørke ut. Når du har renset nylig syntetisert RNA, kan du bruke en tradisjonell RNA-analyseprosedyre.Det anbefales at du kjører RNA på en bioanalyzer eller lignende. Etter det bruker vi vanligvis QPCR og RNA-Seq til å analysere RNA. Denne metoden viste seg ideell for å analysere kinetikken til RNA-behandling.De farligste trinnene er de som bruker fenol og kloroform i RNA-ekstraksjonen. Hver gang du bruker disse kjemikaliene i en uforseglet beholder, gjør det i en røykhette, og bruk passende verneklær, en laboratoriefrakk og hansker. Vær spesielt forsiktig med at det ikke er noen zirkoniaperler i skruehettens tråd, da det vil føre til en lekkasje.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Svært Sensitive og Rapid Fluorescence Detection med en bærbar FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatisert Acoustic Doserings for serie Fortynning av Peptide agonister i Potens Fastsettelse Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Rask fluorescens-baserte karakterisering av enkelt ekstracellulær blemmer i menneskelig blod hydrogenion sporing analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Nettstedet-rettet mutagenese for In Vitro og Vivo eksperimenter eksemplifisert med RNA samhandling i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for RNA Isolation fra endothelial celler in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvåking av protein-RNA-interaksjonsdynamikk in vivo ved høy temporal oppløsning ved bruk av χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Rask og kostnadseffektiv RNA-ekstraksjon av rottepanasittvev

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-affinitetsrensing kombinert med RNA-sekvensering i Gram-positive bakterier

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Merking og visualisering av mitokondriegenomuttrykksprodukter i Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...