Name: extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00
Duration: 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Wellcome-finansiering till JB [104648]. Arbetet i Wellcome centrum för cell bio Logi stöds av Wellcome Core-finansiering [092076]. Författarna erkänner medlemmarna i labbet för deras hjälp: Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna de Lucas-Arias och SHINEY George. Författarna skulle också vilja tacka Patrick Cramer för plasmid YEpEBI31111.

<ol>
	<li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine.">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513 (2018).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li><li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity.">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li><li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast.">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li><li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion.">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA's+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression.">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li><li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).</li><li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li><li>R&#228;dle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis,+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture.">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).</li><li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics.">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li><li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system.">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li><li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboSys,+a+high-resolution,+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3&#8242;-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3&#8242;-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li><li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+fast+and+incredibly+close:+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast.">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li><li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters.">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li><li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast.">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li><li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimeLapse-seq:+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding.">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Denna artikel presenterar ett protokoll för extremt snabb och specifik 4tU märkning, för återvinning av begynnande, nyligen syntetiserade RNA från S. cerevisiae efter så lite som 15 S av märkning, med mycket låg förorening av OMÄRKTA RNA.
Användaren bör alltid vara noga med att bibehålla integriteten hos RNA genom användning av kalla temperaturer och DEPC-behandlade reagenser. Streptavidin pärla rening är i allmänhet tillförlitlig; dock är pärlbufferten svår att hantera; Det måste göras nytt, med dess delar som tillfogas i det rätt beställer, och inte kylt eller autoklaverat. Vanliga brister inkluderar RNA är ofullständigt upplöst efter nederbörden steg, och så är antingen inte en eller på annat sätt förlorat under bearbetningen steg. Det finns omfattande felsökningshjälp i tilläggsmaterialet.
Det finns vissa begränsningar att vara medveten om i ers4tU. En redan nämnt är att 4tU saktar tillväxten av jästen (figur 1a). Bortsett från den endogent tiolerade rnas9kan endast rnas som har transkriberats under märknings perioden renas med denna metod. Polymeraser som pausas på gener under tiolationstid kommer inte att producera tiolerade utskrifter som kan renas, även om utskrifter som är delvis märkta på grund av polymeraser som kommer in i eller lämnar ett pausat tillstånd under tiolation kan återvinnas. Stammar som transkribera dåligt, antingen på grund av mutation eller tillväxtförhållanden, producera lite nsRNA, även om de tekniker som används här kommer ändå att förbättra återhämtningen av nsRNA jämfört med andra metoder. Längre tider och ökade kultur volymer kan vara nödvändiga i dessa stammar och villkor. Observera att uracil är en bra källa till kväve och därför bör denna metod trialed innan den används för studier med kväve svält.
Protokollet ers4tU är särskilt användbart för analys av kortlivade RNAs, av vilka många är så snabbt försämrade att de inte kan identifieras utan att nedbrytande maskineriet förlamats. Exempel är kryptiska instabila utskrifter (nedskärningar)4, och korta utskrifter som produceras av förtida uppsägning eller promotor proximalt pausa18 och antisense transkription "uppströms" från en promotor (prompter)19. Intermediaterna som produceras under bearbetningen av stabila RNA-arter är också övergående men kan berikas med ers4tU transkription4. Protokollet ers4tU är därför exceptionellt när det tillåter mycket övergående RNA-arter att analyseras och fångas under nära fysiologiska förhållanden, vilket är en stor fördel jämfört med andra metoder. Denna teknik har använts för att studera transkription och nedströms RNA bearbetning kinetik i RNA-polymeras mutanter som elongate snabbare eller långsammare än normalt20.
Thiolation är också kompatibel med RNA-SEQ och SLAM-SEQ21, vilket gör att alla RNA produceras inom en mycket kort tid fönster för att kännetecknas i utsökt detalj.

RNA har en dynamisk karaktär; strax efter det produceras mycket RNA snabbt bearbetas och degraderas. För närvarande, de flesta studier av RNA-metabolism analysera det totala cellulära RNA, som är mestadels helt bearbetas och på steady state nivå. Denna nivå beror på balansen mellan överföringshastigheter, posttranskriptionell mognad och nedbrytning. Analys av de processer som leder till steady state jämvikt kräver specialiserade tekniker för att fånga mycket kortlivade RNA-arter.
Metabolisk märkning av RNA med nukleotidanaloger såsom 4-thiouracil (4tU) eller 4-tiouridin (4sU) (se Duffy et al.1 för en utmärkt översyn), erbjuder förmågan att isolera Thio-märkta begynnande rnas och deras bearbetning intermediärer. Publicerade protokoll omfattar dock märknings tider på flera minuter, varav2,3, vilket är långsamt i förhållande till produktionstakten för många utskrifter. Det tar i storleksordningen en minut att transkribera den genomsnittliga jästgenen, så märkning jäst RNA för mindre än en minut kan anses extremt kort. Den extremt snabba och specifika 4 thiouracil Protocol (ers4tU) maximerar signalen till brus förhållandet genom att maximera 4tU inkorporering och minimera återhämtningen av omärkta, redan existerande RNA gör mycket korta märknings tider möjligt4.
Den Thio-modifierade basen måste importeras till cellerna snabbt och i tillräcklig mängd för att effektivt märka det nya syntetiserade RNA (nsRNA). För att främja detta, celler odlas i uracil-fritt medium, och uttryck för en lämplig permease bidrar till att öka 4tU eller 4sU upptag (se tabell 1 för en lista över plasmider som bär lämpliga permease gener och kompletterande figur 1). 4Tuär löslighet i natriumhydroxid undviker behovet av giftiga organiska lösningsmedel som krävs av andra nukleotidanaloger. Tyvärr har odlingskulturer under långa perioder med tio-modifierade nukleosider vid koncentrationer som är större än 50 μM observerats för att störa ribosomerna5. Men den koncentration (10 μM) som används här, och de extremt korta märknings tiderna, minimerar skadliga effekter5 (figur 1a), samtidigt som det ger tillräckligt med RNA för analys.
Denna teknik kan kombineras med snabb och specifik auxin-medierad utarmning av ett målprotein6,7 (figur 2), kallat "β-Est Aid 4U"-protokollet, där β-estradiol reglerade uttrycket av auxin inducerbara degron (Aid) systemet kombineras med 4tu märkning. Med β-Est AID 4U-metoden kan ett målprotein töms och effekten på RNA-metabolismen övervakas noggrant (figur 2). Tidpunkten är kritisk; Det är tillrådligt att se den medföljande videon och ägna mycket uppmärksamhet åt figur 2 och dess animerade form (se kompletterande figur 2).
Bearbetning och nedbrytning av RNA måste stoppas extremt snabbt för noggrann tidsupplösning. Detta uppnås med hjälp av metanol vid låg temperatur, vilket fixar cellinnehållet mycket snabbt och försämrar cellmembranet samtidigt som nukleinsyrthalten bibehålls8. RNA-extraktionen ska vara effektiv och inte skada RNA. Mekanisk Lys är effektiv i avsaknad av chaotropic agenter (ofta dessa innehåller Thio grupper, så bör undvikas). Litium klo RID utfällning av RNA föredras, eftersom tRNAs är mindre effektivt utfälld. tRNAs är snabbt transkriberade och naturligt tiolated9, så att ta bort tRNAs minskar konkurrensen om biotinylering reagens. Om små, mycket strukturerade RNAs är av intresse, rekommenderas alkoholbaserade RNA-utfällnings metoder.
För att återvinna det thiolated RNA, biotin är kovalent fäst via Thio grupper införlivas i RNA med 4tU. Användning av modifierad biotin, som fäster via en klyvbar disulfid obligation (t. ex., HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3 ́-(2 ́-pyridyldithio)propionamid,) eller MTS-biotin (metan tiosulfonat)) rekommenderas som det tillstånd frigörare av RNA vid tillägg av ett reducerande medel. Den en RNA är affinitet renas på konjugerat kopplad till magnetiska pärlor. Detta protokoll liknar andra som listas tidigare10 men har intensivt optimerats för att minska bakgrunden.
Det finns två typer av tiol-märkning experiment som kan utföras, kontinuerlig och diskontinuerlig märkning. Var och en har sina egna fördelar. Vid kontinuerlig märkning läggs 4tU till i kulturen och proverna tas med jämna mellanrum. Den här typen av experiment visar hur RNA bearbetas och hur nivåerna ändras över tid. Exempel på detta är jämförelse av Mutant med Wild-Type experiment och ett puls-Chase experiment. Experimenten som visas i figur 3b, c är av denna typ. För diskontinuerlig märkning framkallas en ändring in i systemet, och RNA övervakade. När förändringen har inducerats måste kulturen delas upp i flera subkulturer, och vid bestämda tidpunkter är var och en sedan tio-märkt under en kort period. Ett exempel är β-Est AID 4U som visas i figur 27. Denna typ av experiment är särskilt användbart för att övervaka effekten av en metabolisk förändring på RNA-bearbetning (se figur 3D).
En grafisk representation av en Thio-märkning experiment presenteras i figur 4 och figur 5, och ett kalkylblad som förenklar protokollets prestanda är tillgänglig (se 4tu experiment Template. xlsx). Förutom detta innehåller tilläggsinformationen en omfattande felsökningsguide. För det β-Est AID 4U-protokoll som integrerar 4tU-märkning med auxin-utarmningsprotokollet, se figur 2 och kompletterande figur 2. Se Barrass et al.7 för detaljerad hjälp utarmning protokoll.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#946;-mercaptoethanol (&#946;ME)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M3148</td>
			<td >CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25668</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMF (N,N-dimethylformamide)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td >Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EZ-link HPDP Biotin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21341</td>
			<td >Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark &#38; at -20 &#176;C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 &#176;C to resuspend.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Fisher Scientific&#160;</td>
			<td >G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen [20 mg/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10901393001</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>77712</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793620</td>
			<td >10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >63033</td>
			<td >1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >M/4000/PC17</td>
			<td >CAUTION Toxic and flammable</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td rowspan="2">Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-M</td>
			<td>5 M solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol, low pH.&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce Spin Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69702</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SCSM single drop-out &#8211;ura</td>
			<td >Formedium&#160;</td>
			<td >DSCS101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32318-M</td>
			<td>Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td>CAUTION corrosive</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >436143</td>
			<td>CAUTION irritant, do not inhale</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>NEB</td>
			<td>1420S</td>
			<td>Store at 4&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUPERase-In, RNase inhibitor</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See section 1.7 of the protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-thiouracil (4tU)&#160;</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>359930010</td>
			<td>Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >93362</td>
			<td>1 M solutions at various pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>5mg/ml, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base without amino acids&#160; with amonium sulphate</td>
			<td >Formedium</td>
			<td >CYN0410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeba Columns 0.5ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zirconia beads</td>
			<td>Thistle Scientific</td>
			<td>110791052</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beadbeater</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>112011EUR</td>
			<td >Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 &#176;C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="3" >Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H179467N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 50 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td rowspan="2" >Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, 2 mL, screw cap</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>723361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids</td>
			<td>Brand</td>
			<td >781332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)

Nukleotidanalog, 4-thiouracil (4tU), är lätt tas upp av celler och införlivas i RNA som det transkriberas in vivo, vilket möjliggör isolering av RNA som produceras under en kort period av märkning. Detta görs genom att fästa en biotin-enhet till den inkorporerade Thio-gruppen och affinitetsrening med hjälp av konjugerat belagda pärlor. Att uppnå en god avkastning av rent, nyligen syntetiserade RNA som är fritt från befintligt RNA gör kortare märknings tider möjliga och medger ökad temporala upplösning i kinetiska studier. Detta är ett protokoll för mycket specifika, hög avkastning rening av nyligen syntetiserade RNA. Det protokoll som presenteras här beskriver hur RNA utvinns ur jästen Saccharomyces cerevisiae. Emellertid, protokollet för rening av thiolated RNA från totalt RNA bör vara effektiva med hjälp av RNA från någon organism när den har extraherats från cellerna. Det renade RNA lämpar sig för analys av många allmänt använda tekniker, såsom omvänt transkriptas-qPCR, RNA-SEQ och SLAM-SEQ. Specificiteten, känsligheten och flexibiliteten hos denna teknik möjliggör oöverträffad insikt i RNA-metabolism.

Typiska avkastningar för nsRNA återvinnas med detta ers4tU protokoll visas i figur 1b, detta har producerats av en bioanalyzer och spår visar avkastningen av RNA kontra storlek (nukleotider [NT]). Notera, i både bioanalysatorn trace och den infälld grafen, att RNA återhämtning från tid punkt 0 är en mycket liten del av som återhämtat sig från längre tid punkter-cirka 0,3 μg RNA återhämtat sig från cirka 109 celler jämfört med över dubbelt så mycket efter bara 30 s av märkning (0,8 μg nsRNA) från samma antal celler. RNA återhämtning vid 15 s är mer varierande som små skillnader i utförandet av provtagning har en proportionellt större effekt på RNA återhämtning. I bioanalyzer spår, rRNA prekursorer kan ses som en topp nära 1000 NT och en dubblett av toppar på 1700 − 1800 NT. Överflödet av dessa intermediärer ökar som tiolation fortsätter.
Tio-märkningen användes för att kvantifiera splitsning av ÄRV1 -avskriften (figur 3). Tiolation utfördes och prover togs vid 15 s intervall från början av tio-märkningen och bearbetningen av ÄRV1 RNA övervakades (figur 3a, b). Som kan ses, är pre-mRNA genereras (genom transkription), och svårbegriplig (genom det första steget av skarvning från pre-mRNA), även efter bara 15 s av märkning. Efter ca 45 s till 1 min, beloppen av svårbegriplig och pre-mRNA nå jämvikt med så mycket av dessa RNA arter som skapas genom transkription som bearbetas bort genom splitsning.
För att producera de data som visas i figur 3c var stammen pulsade med 4tu för 25 s och sedan jagade med uridin. Generationen av pre-mRNA och svårbegriplig når högst 1 minut. Detta jämförs väl med figur 3b. maximalt uppnått efter 45 s för att nå jämvikt plus 25 s av märkningen. Efter toppen, nivåerna sjunka som Thio-märkta RNAs är jagade genom skarvning processen.
Figur 3D visar utarmning av en proteinskarvning faktor och dess effekt på RNA metabolism, med hjälp av β-Est Aid 4U system6,7. Här, Prp16p reduceras från nära fysiologiska nivåer till 5% av denna nivå efter 25 min av utarmning. Prp16p är en viktig skarvning faktor för det andra steget i splitsning15. Lariats avlägsnas under det andra steget av skarvning (figur 3a), men här de ökar över nivån för pre-mRNA som Prp16 blir begränsande. Vid senare utarmning gånger, andra faktorer blir begränsande på grund av sekundära effekter, så att nivåerna av Lariat minska, och pre-mRNA nivåer stiger. Nivån på de skarvade mRNA minskar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> Figur 1: tillväxt i 4tU och RNA återhämtning. (a) 4-thiouracil påverkar tillväxten. Öka koncentrationen av 4tU i YMM Drop-out tillväxtmedium utan uracil ökar fördubblings tiden för S. cerevisiae (BY4741) bär p4FuiΔPEST plasmid. Tillväxt av fyra replikat kulturer övervakades vid 30 ° c i en Tecan oändlig Pro 200. Alla kulturer var i logg fasen hela, med OD600 mellan 0,1 och 0,6. Håna är en kontrollera kultur med ett likvärdigt belopp av NaOH tillfogade, som inte vid honom ändrar tillväxttakten. Detta diagram visar att tio-märkningen är en kompromiss mellan snabb märkning och skador på cellen. Felstaplar är standardfel på 4 replikat. bnsrna-avkastningen ökar linjärt från ca 15 s av märkningen. Huvudfiguren visar bioanalysatorn spår av renas, nsRNA från 0 (inte tiolated) till 2 min efter tillsats av 4tU vid 15 s intervall. Observera att 15 s-provet inte visas, eftersom det inte går att skilja från det omärkta provet. De två stora topparna motsvarar ribosomal RNAs (rRNAs). RRNA-prekursorer och intermediärer är synliga som flera toppar vid större molekylvikt än mogna rRNAs. Återhämtningen av dessa prekursorer och intermediärer ökar med tiden. Resultat från ett representativt experiment visas. Den infälld grafen visar återhämtningen av nsrna med ökande inkubering med 4tu. Avkastningen av nsRNA ökar med ökande tid av tillväxt med 4tU. Återhämtningen är anmärkningsvärt linjär (R2 = 0,934) under hela tidsskalan för detta experiment och visar en liten ökning över bakgrunden även vid 15 s märkning med 4tu även om den inte skiljer sig från det omärkta provet med öga från bioanalysatorn Spåra. Felstaplar visar standardfel för tre biologiska replikat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> Figur 2: β-Est stöd 4U β-Est Aid 4U grafiskt protokoll. En grafisk Sammanfattning av protokollet för det β-Est AID 4U-protokollet. β-estradiol (β-EST) främjar uttrycket av auxin inducerbara degron (stöd) system som i sin tur uttär ett stöd * taggade Target protein, hänvisa till Barrass et al.7 för ett detaljerat protokoll. I detta fall, degron system uttryck initieras 25 min innan proteinnedbrytning påbörjas och tiolation vid varje tidpunkt är för 1 min. prover tas före induktion och varje 2 minuter under utarmning. En animerad version visas i tilläggs siffran 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> Figur 3: prekursorer och intermediat för ÄRV1 RNA-skarvning. Skarvning av ÄRV1 pre-mRNA-utskrifter övervakades med kvantitativ omvänd Transkription PCR16. Nivåerna av ÄRV1 föregångare (pre-mRNA), mellanliggande Lariat-på exon2 (Lariat) och skarvas produkt (mRNA) visas normaliserade mot nivån på ÄRV1 på exon2 och steady state nivåer av dessa rnas. (a) lokalisering av qPCR-produkter på ÄRV1-avskriften. Schematiska av lokaliseringarna av de qPCR-produkter som används för att göra en analys av nivåerna av prekursorer, intermediärer och produkter av skarvning reaktionen av ÄRV1 avskrifter16. Exons representeras av lådor, intron som en linje och qPCR produkter som linjer med diamanter i vardera änden, färgen matchar de som används i diagrammen. Pre-mRNA PCR är specifikt för pre-mRNA och inte någon intermediat av skarvning som denna produkt korsar grenen punkt som störs efter det första steget i splitsning. Lariat PCR kommer att upptäcka produkten av det första steget i skarvning och censurerade Lariat produceras efter den andra. MRNA PCR är specifikt för produkten av skarvning, mRNA. Resultat från exon PCR (förekommer i alla prekursorer, intermediärer och produkter, utom den exciderade Lariat) visas inte i diagrammen eftersom detta användes för att normalisera data och är därför alltid lika med 1. bkontinuerlig tiolabelling. Mängden pre-mRNA ökar med tiden som 4tU införlivas genom transkription och efter en kort fördröjning, splitsning omvandlar den till Lariat-på exon2 mellanliggande och skarvade produkter. Nivåerna av dessa pre-mRNA och Lariat arter är detekterbara ovan bakgrund efter så lite som 15 s av tillväxt med 4tU och nå ett maximum efter cirka 45 s kontinuerlig märkning med 4tU, varvid deras produktion balanseras genom omvandling till skarvade mRNA och/eller degradering. Värden är normaliserade till deras steady state (vänster-mest punkt i grafen), och exon 2 nivåer för att visa deras utseende och bearbetning i jämförelse med transkription av exon 2. Eftersom RNA skarvning av ÄRV1 är till stor del Co-transkriptionella4,17 skarvade mRNA snabbt blir den mest förekommande arten, dess nivå liknar exon 2. Standard fel på tre biologiska replikat, varje analyseras i triplicate. (c) puls/jakt. Tiolation puls på 25 sekunder följt av Chase med uridin. Jämfört med de steady state nivåerna av dessa RNAs (vänster-mest punkt), de är initialt mycket riklig i den nyligen syntetiserade poolen. Nivåerna sjunker gradvis eftersom de bearbetas till mRNA (eller degraderas), närmar sig nivåer mycket liknar steady state nivåer av 5 min. standard fel på tre biologiska replikat, varje analyseras i triplicate. d) nsrna och protein förlust. Skarvning av ÄRV1 pre-mRNA-utskrifter som övervakas av kvantitativ omvänd TRANSKRIPTION PCR som i panel (a) vid utarmning av Prp16 proteinet med hjälp av auxin degron-systemet enligt beskrivningen i figur 2. Den Prp16 proteinnivåer visas också i diagrammet plottas mot den andra Y-axeln i procent av nivåer före auxin utarmning. Prp16 är en viktig del av spliceosome, särskilt viktigt för det andra steget i skarvning visas i panel (a), varefter svårbegriplig bryts ned. När detta kliver blir begränsa svårbegriplig ackumulera initialt. Vid senare tidpunkt punkter skarvning misslyckas helt, är svårbegriplig inte längre produceras och pre-mRNA nivåer stiger. Felstaplar är standardfel på tre biologiska replikat, varje analyseras i triplicate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> Figur 4: grafisk Sammanfattning av protokoll avsnitten 1 till 3. Cellerna är tiolated med 4tU och får växa för att införliva den modifierade nukleotiden i RNA. En thiolated S. pombe Spike kan läggas till att tillåta normalisering över tidspunkter och experiment. Pulsen på 4tU kan jagas med hjälp av un-thiolated uridin. Märkningen kan antingen utföras kontinuerligt från 4tU addition eller från en förändring till tillväxtvillkor, kultur Split och 4tU läggas till kulturer vid ökande tider från tillväxtvillkor förändring, men varje märkning endast för en kort tid. Cellerna samlas in, och RNA framställs från cellerna, företrädesvis med hjälp av en homogenisator och fenol-baserade metoder. RNA är en och sedan en RNA renas från oinkorporerade biotin med hjälp av en storlek uteslutning kolumn. Nsrna är nu klar för rening med konjugerat pärlor (avsnitt 4, figur 5). Tal i rött motsvarar steg numren i protokollet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> Figur 5: grafisk Sammanfattning av protokoll avsnitt 4. Enligt avsnitten 1 till 3 (figur 4) blockeras konjugerat-pärlorna och det biotinylerade RNA-provet tillsätts till de beredda pärlorna. Den en RNA binder till konjugerat pärlor och un-en RNA bort och tvättas. Den en RNA elueras från pärlorna med βme och fälls redo för vidare forskning. Tal i rött motsvarar steg numren i protokollet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande figur 1: förbättring av nsRNA återhämtning från jästceller med och utan ytterligare kopior av importören på 1 och 3 minuter av tio-märkning. Observera att Fui1 är jästen egen promotor uttryckt från en 2 μm plasmid. Den genomiska kopian av genen förekommer i båda dessa stammar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.</a>
Kompletterande figur 2: animerad version av β-Est stöd 4U β-Est Aid 4U grafiskt protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.</a>
Kompletterande fil 1:4tU_experiment_template. xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmid namn</td>
			<td>Importör/permease</td>
			<td>Markör</td>
			<td>Kommentar</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td rowspan="2">Fui1 importerar uracil och uridin, vilket gör den idealisk för puls/Chase experiment.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>LEU2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui-ΔPEST</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td>PEST-motivet i Fui1 har inaktiverats, så permeasen bryts inte ned när det finns tillräckligt med intracellulär uracil för cellens behov. Fungerar bra i märknings experiment och förbättrar puls/Chase prestanda.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fur</td>
			<td>
S. cerevisiae Fur4</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Uracil permease</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">YEpEBI311</td>
			<td>H. sapiens ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2</td>
			<td rowspan="2">Miller et al.11. Innehåller även en HSV tymidin-kinasgen.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(equilibrative nukleosidanaloger transportör)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Alla plasmider är 2 μm baserade. Alla P4 plasmider och pAT är baserade på pRS16 -serien av plasmider. FUI1 och FUR4 uttrycks från deras egna, endogena initiativtagare.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: plasmider som används med detta protokoll.

Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Användningen av thiolated uracil att känsligt och specifikt rena nyligen transkriberade RNA från jästen Saccharomyces cerevisiae.

Extremt snabb och specifik metabolisk märkning av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Denna metod är betydande eftersom inget annat protokoll tillåter nyligen syntetiserade RNA att analyseras på så kort tid skala, och tillåta puls-chase experiment med en sådan kort puls. Detta protokoll fungerar bra med protein utarmning, såsom Best AID 4U-protokollet. Den största fördelen är att bakgrunden är låg.Detta gör att de korta märkningstider, genom att ta bort nästan alla nonthiolated RNA. Det skriftliga protokollet beskriver också många olika typer av experiment som skulle kunna utföras och hur man integrerar dem i denna teknik. Till att börja detta förfarande, växa jäst i YMM medium till en OD 600 mellan 0,6 och 0,8.I en draghuv, tillsätt en metanol motsvarande 30 till 50%av den avsedda provvolymen till ett 50 milliliterrör. Stäng rören tätt, märka dem, och placera dem på torris för att kyla. Därefter etikett två milliliter rör för långsiktig lagring av proverna och placera på is för att svalna.Lägg zirkonikulärpärlorna till de två milliliterrören. Kyl minst en milliliter vatten per prov på is. Om en S.pombe spik ska läggas till kulturen, placera en alikvot av tiolerad S.pombe celler på is att tina.Vortexa den tinade alikvoten och lägg till den i kulturen. Tillsätt sedan 4tU till kulturen till en koncentration av 10 mikromolar och blanda kraftigt. Thio-label under en längre tid mellan 15 sekunder och fem minuter.Ta prov på kulturen med jämna mellanrum till slutet av tidskursen. Tillsätt varje prov till ett av de beredda centrifugrören som innehåller metanol. Försegla varje rör, skaka för att blanda ordentligt, och placera på torris.När alla prover har tagits, placera dem alla på is. Se till att inget av proverna har frusit. Om någon har frusit, värm dem försiktigt i handen medan invertering ständigt.Centrifugera cellerna vid 3, 000 gånger g och vid fyra grader Celsius i två minuter för att pelleta cellerna. Häll av vätskan och resuspend pelleten i minst en milliliter iskallt vatten genom att kraftigt pipettera upp och ner. Överför fjädringen till det förberedda skruvlocksröret och lägg röret på is.Centrifugera proverna kort vid en hastighet som är större än 13, 000 gånger g för att åter pelleta cellerna. Placera sedan tillbaka dem på is, och ta bort vätskan. Först, lägg i 400 mikroliter av AE-buffert, 40 mikroliter av SDS, och 800 mikroliter av fenol vid ett lågt pH.Resuspend genom att vortexa i 10 sekunder. Sedan lyse cellerna i en homogenisator för tre två minuters skurar på den lägsta effektinställningen. Låt proverna på is i två minuter mellan homogeniseringspulserna.Placera de lyserade cellerna på torris i fem minuter tills den stelnar. Därefter använder en mikrocentrifug för att snurra cellerna med en hastighet över 13, 000 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur. Efter detta, utföra fenol kloroform extraktion och kloroform extraktion som beskrivs i texten protokollet.Tillsätt mellan 1/3 till 1/2 av volymen av 10 molar litiumklorid och blanda för att fälla ut RNA. Centrifugera med en hastighet över 13, 000 gånger g i fem minuter. Ta bort vätskan, och kort snurra provet för att ta bort drägg.Sedan, tvätta pelleten med 300 till 500 mikroliter av 70%etanol. Centrifugera den tvättade pelleten kort, och avlägsna eventuell kvarvarande etanol. Återlösa RNA-pelleten i 90 mikroliter te vid ett pH 7.0 genom att värma vid 65 grader Celsius medan du skakar.Efter kontroll av fullständig RNA solubilisering, överför suspensionen till ett 0,2 milliliter rör. Till att börja med biotinylera genom att tillsätta 10 mikroliter HPDP-biotinlösning till RNA och blanda noggrant. Inkubera i mörker vid 65 grader Celsius i 15 till 30 minuter.Därefter förbereda en liten harts volym, storlek uteslutning kolumn för att utesluta den oinkorporerade biotin. Ta bort bottentaggen på kolonnen, lossa locket och placera kolonnen i ett centrifugrör på två milliliter. Centrifugera vid 1, 500 gånger g i en minut för att spola ut bufferten och kassera genomflödet.Lägg sedan försiktigt till 0,3 milliliter TE till kolumnens överkant och snurra igen med samma villkor. Överför den tvättade kolonnen till ett färskt 1,5 milliliterrör. När provinkubationen är klar, lägger du till provet till kolumnens överkant.Centrifugera vid 1, 500 gånger g i två minuter, vilket lämnar det biotinylerade RNA-provet i botten av röret. Kasta kolumnen. Och tillsätt 1/3 till 1/2 volym av 10 molar litiumklorid till röret som innehåller provet.Blanda för att åter fälla ut RNA. Först åter upplös RNA i 200 mikroliter av DEPC-behandlat vatten. Mät RNA-koncentrationen, och beräkna volymer för varje prov som kommer att ge lika stora mängder RNA för alla prover.Lägg till denna mängd RNA till ett nytt rör, och tillsätt DEPC-behandlat vatten tillbaka upp till en total volym av 200 mikroliter. När ett prov är i rumstemperatur, tillsätt 25 mikroliter av 10 x NaTM buffert, 25 mikroliter av en molar natriumfosfat, och 2,5 mikroliter av 10%SDS. Blanda noggrant, och centrifug försiktigt vid cirka 100 gånger g i mindre än 30 sekunder.Förbered två milliliter av pärlbuffert för varje prov med en x NaTM-buffert, 0,1 molar natriumfosfat och 0,1%SDS. Tillsätt 50 mikroliter streptavidin pärlor till en låg retention 1,5 milliliter rör. Placera röret på magnetstället och vänta på att pärlorna ska lägga sig.Ta sedan bort vätskan genom aspiration. För att tvätta pärlorna, tillsätt 200 milliliter av pärla buffert och virvel tills pärla pelleten är helt resuspended. Centrifugera röret vid ungefär 100 gånger g i högst fem sekunder.Placera röret i magnetstället för att låta pärlorna fångas upp av magneten. Avlägsna vätskan genom aspiration om det finns ett litet antal prover. Häll av vätskan och aspirera sedan om det finns många prover.Block med 200 mikroliter av pärlbuffert, 10 mikroliter glykogen, och 2,5 mikroliter av tRNA. Inkubera i rumstemperatur i 20 minuter medan roterande över slutet vid måttlig hastighet. Efter detta, ta bort vätskan och tvätta igen, som beskrivs i textprotokollet.Resuspend pärlorna i provet, och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter medan roterande. Under denna inkubation, preparera ett färskt 1,5 milliliterrör för varje prov. Tillsätt 1/10 volym av tre molarnatriumacetat vid pH 5,3 och 20 mikrogram glykogen.Centrifugera vid ungefär 100 gånger g i tre sekunder. Ta bort det obundna RNA:na från pärlorna och tvätta dem så som det skisseras i textprotokollet. För att elera RNA, tillsätt 50 mikroliter av nyberedda 0,7 molar beta merkaptoetanol till pärlorna.Efter vortexing och centrifugering, placera slurry i den magnetiska rack. Pipettera RNA-innehållande lösningen i de beredda centrifugrören på 1,5 milliliter. Elute en gång till som tidigare beskrivits.Placera sedan tillbaka provet i det magnetiska stället för att avlägsna kvarvarande pärlor från det eluterade RNA och överföra vätskan till ett färskt, lågt bindande centrifugeringsrör med 0,5 milliliter. Blanda provet. Och tillsätt sedan 2,5 volymer etanol till fällning nsRNA.Efter blandning och inkubering, centrifug med en hastighet av minst 13, 000 gånger g och vid fyra grader Celsius i 20 minuter. Typiska avkastningar för snRNA som återvinns genom att använda detta protokoll, visas här. Observera att RNA-återhämtning vid tidpunkt noll är en mycket liten del av den som återhämtat sig från längre tidspunkter med endast 0,3 mikrogram RNA som återvinns från cirka 30 miljarder celler.Efter bara 30 sekunder av märkning, men över dubbelt så mycket RNA samlas in från samma antal celler. I bioanalyzerspåret kan våra RNA-prekursorer ses som en topp nära 1, 000 nukleotider och en doublet av toppar på 1, 700 till 1, 800 nukleotider. Överflödet av dessa intermediärer ökar som tiolering fortsätter.Tiolering utförs sedan med prover som tas med 15 sekunders intervall från starten av tio-märkning och bearbetningen av ACT1 RNA-avskrift övervakas. Som kan ses pre-mRNA och lariats genereras även efter bara 15 sekunder av märkning. Efter ca 45 sekunder till en minut når mängden lariats och pre-mRNA jämvikt med så mycket av dessa RNA-arter som skapas genom transkription som bearbetas bort genom splitsning.De svåraste stegen är de som involverar pärlor, tvätt och blockering. Var försiktig så att du inte tappar pärlorna, eller att låta dem torka ut. När du har renat nyligen syntetiserade RNA, kan du använda någon traditionell RNA-analys förfarande.Det rekommenderas att du kör RNA på en bioanalyzer eller liknande. Därefter använder vi normalt QPCR och RNA-Seq för att analysera RNA. Denna metod visade sig vara idealisk för att analysera kinetiken i RNA-bearbetning.De mest farliga stegen är de som använder fenol och kloroform i RNA-extraktionen. Varje gång du använder dessa kemikalier i en oförseglig behållare, gör det i en rök huva, och bära lämpliga skyddskläder, en labbrock, och handskar. Var särskilt försiktig att det inte finns några zirkonia pärlor i gängan på skruvlocket röret, eftersom det kommer att leda till en läcka.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Mycket känslig och snabb fluorescensdetektion med en bärbar FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiserad Acoustic Utlämning för serieutspädning av peptidagonister i Styrka Fastställande Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Snabb fluorescens-baserade karakterisering av enda extracellulär blåsor i människans blod med nanopartiklar-tracking analys

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Webbplats riktad mutagenes för In Vitro och i Vivo experiment exemplifieras med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Översätta ribosom affinitetsrening (fälla) för RNA-isolering från endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Övervakning av protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo vid hög tidsupplösning med χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Snabb och kostnadseffektiv RNA-utvinning av råtta bukspottskörteln vävnad

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-affinitetsrening i kombination med RNA-sekvensering i grampositiva bakterier

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Märkning och visualisering av mitokondriella genomuttrycksprodukter i bagerijäst Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...