Name: extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00
Duration: 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Bu çalışma Wellcome'nin JB'ye sağladığı fonla desteklenmiştir [104648]. Wellcome Hücre Biyolojisi Merkezi'ndeki çalışmalar Wellcome çekirdek finansmanı ile desteklenmiştir [092076]. Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna De Lucas-Arias ve Shiney George: Yazarlar yardım için laboratuvar üyeleri kabul. Yazarlar da plazmid YEpEBI31111için Patrick Cramer teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine.">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513 (2018).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li><li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity.">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).</li><li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li><li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast.">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li><li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion.">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA's+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression.">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li><li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).</li><li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li><li>R&#228;dle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis,+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture.">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).</li><li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics.">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li><li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system.">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li><li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboSys,+a+high-resolution,+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3&#8242;-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3&#8242;-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li><li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+fast+and+incredibly+close:+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast.">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li><li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters.">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li><li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast.">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li><li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimeLapse-seq:+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding.">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makale, son derece hızlı ve spesifik 4tU etiketleme için bir protokol sunar, yeni doğan kurtarma için, yeni sentezlenmiş RNA S. cerevisiae daha az 15 s etiketleme sonra, etiketlenmemiş RNA tarafından çok düşük kontaminasyon ile.
Kullanıcı her zaman soğuk sıcaklıklar ve DEPC ile tedavi reaktifler kullanarak RNA bütünlüğünü korumak için dikkat etmelidir. Streptavidin boncuk arınma genellikle güvenilir; ancak, boncuk tampon işlemek zordur; bileşenleri doğru sırada eklenmiş ve soğutulmuş veya otoklavlı değil, taze yapılmalıdır. Yaygın başarısızlıklar arasında RNA'nın yağış adımlarından sonra tamamen çözülememesi ve bu nedenle işleme adımları sırasında biyolojik olarak biyolojik olarak çözülmemesi veya başka bir şekilde kaybolmaması sayılabilir. Ek malzemede kapsamlı sorun giderme yardımı vardır.
Ers4tU'da dikkat edilmesi gereken bazı sınırlamalar vardır. Bir zaten bahsedilen 4tU maya büyüme yavaşlar (Şekil 1a). Endojen olarak thiolated RNA9dışında, sadece etiketleme döneminde transkripsiyonu olan RNA'lar bu yöntemle saflaştırılabilir. Tiyasyon süresi boyunca genler üzerinde duraklatılmış polimerazlar saflaştırılabilen tiyitasyon transkriptleri üretmez, ancak tiyatifasyon sırasında duraklatılmış bir duruma giren veya bırakan polimerazlar nedeniyle kısmen etiketlenmiş transkriptler kurtarılabilir. Mutasyon veya büyüme koşulları nedeniyle kötü transkripsiyonu yapılan suşlar, burada kullanılan teknikler diğer yöntemlere göre nsRNA'nın iyileşmesini artıracak olsa da, az nsRNA üretir. Bu suşve koşullarda daha uzun süreler ve artan kültür hacimleri gerekebilir. Urasil'in iyi bir azot kaynağı olduğunu ve bu nedenle bu yöntemin azot açlığı ile ilgili çalışmalarda kullanılmadan önce denenmesi gerektiğini unutmayın.
Ers4tU protokolü özellikle kısa ömürlü RNA'ların analizinde yararlıdır ve bunların birçoğu o kadar hızlı bozulur ki, bozulma makinelerini sakat bırakmadan tespit edilemezler. Örnekler şifreli kararsız transkript (CUTs)4ve kısa transkript erken sonlandırma veya organizatör proksimal duraklama18 ve antisense transkripsiyon "upstream" bir promotör (PROMPTs)19tarafından üretilen içerir. Kararlı RNA türlerinin işlenmesi sırasında üretilen ara lar da geçicidir ancak ers4tU transkripsiyon4kullanılarak zenginleştirilebilir. Bu nedenle ers4tU protokolü, son derece geçici RNA türlerinin yakın fizyolojik koşullar altında analiz edilip yakalanmasına izin vermek açısından istisnaidir ve bu da diğer yöntemlere göre büyük bir avantajdır. Bu teknik, normal20'dendaha hızlı veya daha yavaş uzamış RNA polimeraz mutantlarında transkripsiyon ve aşağı RNA işleme kinetiklerini incelemek için kullanılmıştır.
Thiolation da RNA-seq ve SLAM-seq21ile uyumludur , tüm RNA çok kısa bir süre içinde üretilen izin zarif ayrıntılı olarak karakterize edilecek.

RNA dinamik bir doğaya sahiptir; kısa bir süre sonra çok RNA hızla işlenir ve bozulur üretilir. Şu anda, RNA metabolizmasının çoğu çalışma toplam hücresel RNA analiz, çoğunlukla tam olarak işlenmiş ve sabit devlet düzeyinde. Bu seviye transkripsiyon oranları, transkripsiyon sonrası olgunlaşma ve bozulma arasındaki dengeye bağlıdır. Sabit durum dengesine yol açan süreçlerin analizi, çok kısa ömürlü RNA türlerini yakalamak için özel teknikler gerektirir.
RNA'nın 4-thiouracil (4tU) veya 4-tiouridin (4sU) gibi nükleotid analogları ile metabolik etiketlemesi (mükemmel bir inceleme için Bkz. Duffy ve ark. 1), tiyo etiketli yeni doğan RNA'ları ve bunların işleme aralarını izole etme olanağı sunar. Ancak, yayınlanan protokoller birkaç dakika etiketleme süreleri içerir2,3, birçok transkript üretim oranına göre yavaş. Bu ortalama maya geni transkripsiyonu için bir dakika sırayla sürer, bu yüzden bir dakikadan az maya RNA etiketleme son derece kısa olarak kabul edilebilir. Son derece hızlı ve spesifik 4 thiouracil protokolü (ers4tU) 4tU kuruluş maksimize ve etiketsiz kurtarma en aza indirerek gürültü oranı sinyali maksimize, önceden var olan RNA mümkünçokkısa etiketleme süreleri 4 .
Tiyo modifiye baz verimli bir şekilde yeni sentezlenen RNA (nsRNA) etiketlemek için hızlı ve yeterli miktarda hücrelere ithal edilmelidir. Bunu teşvik etmek için, hücreler urasil içermeyen ortamda yetiştirilir ve uygun bir permazin ekspresyonu 4tU veya 4sU alımını artırmaya yardımcı olur (uygun permaz genleri taşıyan plazmidlerin listesi için Tablo 1'e ve Ek Şekil1'e bakınız). 4tU'nun sodyum hidroksitteki çözünürlüğü, diğer nükleotit analoglarının gerektirdiği toksik organik çözücülere olan ihtiyacı önler. Ne yazık ki, 50 μM'den büyük konsantrasyonlarda tiyo modifiye nükleozitler ileuzun süre büyüyen kültürlerin ribozomları bozduğu gözlenmiştir 5. Ancak, burada kullanılan konsantrasyon (10 μM) ve son derece kısa etiketleme süreleri, zararlı etkileri en aza indirir5 (Şekil1a),hala analiz için yeterli RNA verirken.
Bu teknik, "β-est AID 4U" protokolü olarak adlandırılan ve β-est aid 4U protokolü olarak adlandırılan ve kandinin ekspresyonunun düzenlendiği bir hedef protein6,7 (Şekil2)hızlı ve spesifik yardımcı aracılı tükenmesi ile kombine edilebilir. indüklemez degron (AID) sistemi 4tU etiketleme ile birleştirilir. β-est AID 4U yaklaşımı ile hedef protein tükenebilir ve RNA metabolizması üzerindekietkisi yakından izlenebilir (Şekil 2). Zamanlama çok önemlidir; eşlik eden videoyu görüntülemeniz ve Şekil 2'ye ve animasyonformuna yakın ilgi göstermeniz tavsiye edilir (Bkz. Ek Şekil2).
Doğru zaman çözünürlüğü için RNA'nın işlenmesi ve bozulması son derece hızlı bir şekilde durdurulmalıdır. Bu çok hızlı hücre içeriğini giderir ve nükleik asit içeriği korurken hücre zarını bozar düşük sıcaklıkta metanol kullanılarak elde edilir8. RNA ekstraksiyonu verimli olmalı ve RNA'ya zarar vermemelidir. Mekanik lisis chaotropic ajanların yokluğunda etkilidir (genellikle bu tiyo grupları içerir, bu yüzden kaçınılmalıdır). RNA lityum klorür çökelti tercih edilir, tRNA'lar daha az verimli çöktürülmüş olduğundan. tRNA'lar hızla transkripsiyonuve doğal olarak thiolated 9, bu nedenle tRNA'ların çıkarılması biyotinylasyon reaktifi için rekabeti azaltır. Küçük, yüksek yapılı RNA'lar ilgi çekiciyse, alkol bazlı RNA yağış yöntemleri önerilir.
Tiyitli RNA kurtarmak için, biotin kovalent 4tU ile RNA dahil tiyo grupları ile bağlanır. Dekolte edilebilir bir disülfit bağı (örneğin, HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamide, p ropionamide, veya MTS-biotin (Metan thulfonate)) ile bağlanan modifiye biyotin kullanımı önerilir. bir indirgeyici madde ekleyerek RNA serbest bırakılmasına izin verir gibi. Biyotinylated RNA arınmış streptavidin manyetik boncuklar ile birleştiğinde saf. Bu protokol, daha önce10 olarak listelenen diğer protokollere benzer, ancak arka planı azaltmak için yoğun olarak optimize edilmiştir.
Sürekli ve kesintisiz etiketleme, yapılabilir tiyol etiketleme deneyi iki türü vardır. Her birinin kendi avantajları vardır. Sürekli etiketlemede 4tU kültüre eklenir ve düzenli aralıklarla alınan numuneler alınır. Bu tür bir deneme, RNA'nın nasıl işlenir ve düzeylerin zaman içinde nasıl değiştiğini gösterir. Örnekler arasında mutantın vahşi tip deneylerle karşılaştırılması ve nabız kovalama deneyi sayılabilir. Şekil 3b,c'de gösterilen deneyler bu türdedir. Kesintili etiketleme için sisteme bir değişiklik indüklenir ve RNA izlenir. Değişim indüklendikten sonra kültür birkaç alt kültüre ayrılmalıdır ve belirli zamanlarda, her biri kısa bir süre için thio-etiketli. Bir örnek şekil 27'de gösterilen β-est AID 4U'dur. Bu tür deneyler, metabolik bir değişikliğin RNA işleme üzerindeki etkisini izlemek için özellikle yararlıdır (Bkz. Şekil 3d).
Bir tio-etiketleme deneyinin grafik gösterimi Şekil 4 ve Şekil5'te sunulur ve protokolün performansını büyük ölçüde kolaylaştıran bir elektronik tablo mevcuttur (bkz. 4tU deneme template.xlsx). Bunun yanı sıra Ek Bilgiler kapsamlı bir sorun giderme kılavuzu içerir. 4tU etiketlemeyi auxin tükenme protokolüile birleştiren β-est AID 4U protokolü için Şekil 2 ve Ek Şekil2'ye bakınız. Ayrıntılı AID tükenme protokolüiçin 7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#946;-mercaptoethanol (&#946;ME)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M3148</td>
			<td >CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25668</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMF (N,N-dimethylformamide)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td >Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EZ-link HPDP Biotin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21341</td>
			<td >Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark &#38; at -20 &#176;C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 &#176;C to resuspend.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Fisher Scientific&#160;</td>
			<td >G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen [20 mg/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10901393001</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>77712</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793620</td>
			<td >10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >63033</td>
			<td >1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >M/4000/PC17</td>
			<td >CAUTION Toxic and flammable</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td rowspan="2">Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-M</td>
			<td>5 M solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol, low pH.&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td>Store in the dark at 4 &#176;C. CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce Spin Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69702</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SCSM single drop-out &#8211;ura</td>
			<td >Formedium&#160;</td>
			<td >DSCS101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32318-M</td>
			<td>Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td>CAUTION corrosive</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >436143</td>
			<td>CAUTION irritant, do not inhale</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>NEB</td>
			<td>1420S</td>
			<td>Store at 4&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SUPERase-In, RNase inhibitor</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See section 1.7 of the protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-thiouracil (4tU)&#160;</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>359930010</td>
			<td>Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >93362</td>
			<td>1 M solutions at various pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>5mg/ml, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base without amino acids&#160; with amonium sulphate</td>
			<td >Formedium</td>
			<td >CYN0410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeba Columns 0.5ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zirconia beads</td>
			<td>Thistle Scientific</td>
			<td>110791052</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beadbeater</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>112011EUR</td>
			<td >Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 &#176;C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="3" >Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H179467N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 50 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td rowspan="2" >Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, centrifuge, 15 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.001</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes, 2 mL, screw cap</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>723361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids</td>
			<td>Brand</td>
			<td >781332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extremely rapid and specific metabolic labelling of rna in vivo with 4-thiouracil (ers4tu)

Nükleotid analog, 4-thiouracil (4tU), kolayca hücreler tarafından alınır ve vivo olarak RNA dahil, etiketleme kısa bir süre içinde üretilen RNA izolasyon sağlayan. Bu dahil thio grubu ve yakınlık arındırıcı bir biotin moiety ekleyerek yapılır, streptavidin kaplı boncuklar kullanılarak. Önceden var olan RNA'dan arınmıştır saf, yeni sentezlenmiş RNA iyi bir verim elde etmek kısa etiketleme süreleri mümkün kılar ve kinetik çalışmalarda artan zamansal çözünürlüğe izin verir. Bu, yeni sentezlenen RNA'nın çok özel ve yüksek verimli saflaştırılması için bir protokoldür. Burada sunulan protokol, RNA'nın Saccharomyces cerevisiae mayasından nasıl çıkarılabildiğini açıklamaktadır. Ancak, hücrelerden çıkarıldıktan sonra, itolitli RNA'nın total RNA'dan arındırılması için protokol herhangi bir organizmadan Gelen RNA kullanılarak etkili olmalıdır. Saflaştırılmış RNA ters transkriptaz-qPCR, RNA-seq ve SLAM-seq gibi birçok yaygın olarak kullanılan teknikler tarafından analiz için uygundur. Bu tekniğin özgüllüğü, duyarlılığı ve esnekliği RNA metabolizmasına benzersiz bir bakış açısı sağlar.

Bu ers4tU protokolü kullanılarak kurtarılan nsRNA'nın tipik verimleri Şekil 1b'degösterilmiştir , bu bir biyoanalizör tarafından üretilmiştir ve iz RNA'nın büyüklüğüne karşı verimi gösterir (nükleotitler [nt]). Not, hem biyoanalizör izinde hem de inset grafiğinde, rna kurtarma zaman noktası 0'dan sonra uzun zaman noktalarından kurtarılan çok küçük bir kısmıdır - yaklaşık 0,3 μg RNA yaklaşık 109 hücreden iki kat daha fazla ile karşılaştırıldığında kurtarıldı aynı sayıda hücreden sadece 30 s (nsRNA 0.8g) etiketleme sonra. 15 s'de RNA geri kazanımı, örneklemenin gerçekleştiririndeki küçük farkların RNA geri kazanımı üzerinde orantılı olarak daha büyük bir etkisi olduğundan daha değişkendir. Biyoanalizör takibinde rRNA öncüleri 1000 nt'ye yakın bir tepe ve 1700−1800 nt'de bir çift tepe olarak görülebilir. Bu ara ların bolluğu, tiyasyon devam ettikçe artar.
THio-etiketleme ACT1 transkriptinin birleştirilmesini ölçmek için kullanılmıştır (Şekil 3). Tiyo-etiketlemenin başlangıcından itibaren 15 s aralıklarla alınan numuneler ve ACT1 RNA'nın işlenmesi izlenmiştir (Şekil3a,b). Görüldüğü gibi, pre-mRNA (transkripsiyon ile) oluşturulur ve lariats (pre-mRNA dan birleştirme ilk adımda), etiketleme sadece 15 s sonra bile. Yaklaşık 45 s-1 dk sonra, lariats ve pre-mRNA miktarları bu RNA türlerinin kadar transkripsiyon tarafından oluşturulan olarak birleştirme ile işlenir ile denge ulaşmak.
Şekil 3c'de gösterilen verileri üretmek için zorlanma 4tU ile 25 s'ye darbe aldı ve daha sonra idrarla kovalandı. Pre-mRNA ve lariats üretimi maksimum 1 dakikada ulaşır. Bu şekil 3bile iyi karşılaştırır; 45 s sonra elde edilen maksimum denge artı etiketleme 25 s ulaşmak için. Zirveden sonra, thio etiketli RNA'lar birleştirme işlemi boyunca kovalandıkça seviyeler düşer.
Şekil 3d β-est AID 4U sistemi 6 kullanarak, bir protein birleştirme faktörü ve RNA metabolizması üzerindeki etkisini tükenmesi gösterir6,7. Burada Prp16p, 25 dk tükenmeden sonra fizyolojik seviyelere yakın olan bu seviyenin %5'ine düşürülür. Prp16p15birleştirme ikinci adım için önemli bir birleştirme faktörüdür. Lariats birleştirme ikinci adımsırasında kaldırılır (Şekil 3a), ama burada Prp16 sınırlayıcı hale geldikçe ön mRNA düzeyinin üzerinde artış. Daha sonraki tükenme zamanlarında, ikincil etkiler nedeniyle diğer faktörler sınırlayıcı hale gelir, böylece lariat düzeyleri azalır ve pre-mRNA düzeyleri yükselir. Spliced mRNA düzeyi azalır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> Şekil 1: 4tU ve RNA kurtarma büyüme. (a) 4-thiouracil büyümeyi etkiler. Urasil olmadan YMM bırakma büyüme ortamında 4tU konsantrasyonunun artırılması, p4FuiΔPEST plazmidini taşıyan S. cerevisiae'nin (BY4741) iki katına çıkarılmasını artırır. Tecan Infinite Pro 200'de 4 çoğaltma kültürü 30 °C'de izlendi. Tüm kültürler, 0.1 ve 0.6 arasında OD600 ile, boyunca günlük aşamasında idi. Mock, büyüme hızını tek başına değiştirmeyen eşdeğer miktarda NaOH eklenen bir kontrol kültürüdür. Bu grafik, tiyo-etiketlemenin hızlı etiketleme ile hücrehasarı arasında uzlaşma olduğunu göstermektedir. Hata çubukları 4 çoğaltma standart hatadır. (b) nsRNA verimi yaklaşık 15 s etiketlemeden doğrusal olarak artar. Ana figür, 15 s aralıklarla 4tU ilave edildikten sonra 0 (thiolated değil) ile 2 dk arasında saflaştırılmış, nsRNA biyoanalizör izlerini gösterir. Etiketlenmemiş örnekten ayırt edilememiştir gibi 15 s'lik örneğin gösterilmediğini unutmayın. İki büyük zirve ribozomal RNA'lara (rRNA) karşılık gelir. rRNA öncüleri ve ara etkileri, olgun rRNA'lardan daha yüksek molekül ağırlığında birkaç tepe olarak görülebilir. Bu öncüllerin ve ara ların geri kazanımı zamanla artar. Bir temsili denemenin sonuçları gösterilir. Inset grafiği 4tU ile artan kuluçka ile nsRNA kurtarma gösterir. nsRNA verimi 4tU ile büyüme süresinin artmasıyla artar. Kurtarma bu deneyin zaman ölçeği boyunca son derece doğrusal (R2 = 0.934) ve biyoanalizör göz tarafından etiketlenmemiş örnek ayırt olmasa bile 4tU ile 15 s etiketleme bile arka plan üzerinde hafif bir artış gösterir Izleme. Hata çubukları üç biyolojik çoğaltma için standart hata gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> Şekil 2: β-est AID 4U β-est AID 4U grafik protokolü. β-est AID 4U protokolünün grafiksel özeti. β-estradiol (β-est) auxin inducible degron (AID) sisteminin ekspresyonunu teşvik eder ve bu sistem aid* etiketli hedef proteini tüketir, ayrıntılı bir protokol için Barrass vd. 7'ye başvurun. Bu durumda protein yıkımı başlamadan 25 dakika önce degron sistem ekspresyonu başlatılır ve her zaman noktasında thiolation 1 dk. Örnekler indüksiyondan önce ve tükenme sırasında her 2 dakikada bir alınır. Animasyonlu bir sürüm Ek Şekil2'de görünür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> Şekil 3: ACT1 RNA birleştirmenin öncülleri ve ara ları. ACT1 pre-mRNA transkriptlerinin birleştirilmesi nicel ters transkripsiyon PCR16ile izlendi. ACT1 öncül (pre-mRNA), ara lariat-exon2 (Lariat) ve spliced ürün (mRNA) düzeyleri ACT1 Exon2 düzeyine ve bu RNA'ların sabit durum düzeylerine göre normalleştirilmiş olarak gösterilmiştir. (a) ACT1 transkriptinde qPCR ürünlerinin yeri. ACT1 transkriptlerinin birleştirme reaksiyonunun öncüllerinin, ara larının ve ürünlerinin düzeylerini titretmek için kullanılan qPCR ürünlerinin konumlarının şeması16. Ekonlar kutular, intron bir çizgi olarak ve her iki ucunda elmas ile çizgiler olarak qPCR ürünleri ile temsil edilir, renk grafiklerde kullanılan eşleşir. Pre-mRNA PCR pre-mRNA için özeldir ve bu ürün birleştirmenin ilk adımından sonra bozulan dal noktasını geçtiği için herhangi bir ara birleştirme değildir. Lariat PCR birleştirme ilk adım ve ikinci sonra üretilen excised lariat ürün tespit edecektir. mRNA PCR, splicing, mRNA ürününe özgüdür. Exon PCR'nin sonuçları (excised lariat hariç tüm öncüllerde, ara ürünlerde ve ürünlerde mevcut) grafiklerde gösterilmez, çünkü bu veriler normalleştirmek için kullanılır ve bu nedenle her zaman 1'e eşittir. (b) Sürekli tiyatılma. 4tU transkripsiyon la dahil edildikçe pre-mRNA miktarı zamanla artar ve kısa bir gecikmeden sonra birleştirme, bu miktarı lariat-exon2 ara ve birleştirilmiş ürünlere dönüştürür. Bu pre-mRNA ve lariat türlerinin seviyeleri 4tU ile büyüme 15 s kadar az sonra arka plan üzerinde tespit edilebilir ve 4tU ile sürekli etiketleme yaklaşık 45 s sonra maksimum ulaşmak, bu noktada üretim dilimlenmiş dönüşüm ile dengeli mRNA ve/veya bozulma. Değerler sabit durumlarına (grafiğin en sol daki noktası) normalleştirilmiştir ve ekson 2 düzeyleri, ekson 2'nin transkripsiyonuna göre görünümlerini ve işlemelerini göstermek için normalleşir. ACT1 RNA birleştirme büyük ölçüde co-transkripsiyonel4olduğundan,17 spliced mRNA hızla en bol türler haline gelir, seviyesi exon 2 benzer. Üç biyolojik kopyanın standart hatası, her biri üç kat daha fazla test edilmiş. (c) Nabız/kovalamaca. 25 saniyelik thiolation nabzı idrarla kovalamaca nın ardından. Bu RNA'ların (en sol nokta) sabit durum düzeyleriyle karşılaştırıldığında, başlangıçta yeni sentezlenen havuzda çok bolmiktarda bulunurlar. MRNA'ya (veya bozulmuş) işlendikçe, seviyeler kademeli olarak azalır ve her biri üç biyolojik kopyanın standart hatası ile sabit durum seviyelerine çok benzer seviyelere yaklaşır. (d) nsRNA ve protein tükenmesi. Act1 pre-mRNA transkriptlerinin panelde olduğu gibi kantitatif ters transkripsiyon PCR tarafından izlenen (a ) Şekil 2'de açıklandığı gibi auxin degron sistemini kullanarak Prp16 proteininin tükenmesi üzerine birleştirilmesi . Prp16 protein düzeyleri de ikinci Y eksenine karşı çizilen grafikte auxin tükenmesi öncesinde ki seviyelerin yüzdesi olarak görüntülenir. Prp16, panelde gösterilen birleştirmenin ikinci adımıiçinözellikle önemli olan spliceosome'ın hayati bir bileşenidir. Bu adım sınırlayıcı hale geldiğinde lariats başlangıçta birikir. Daha sonraki zamanda puan birleştirme tamamen başarısız olur, lariats artık üretilir ve pre-mRNA düzeyleri yükselir. Hata çubukları, her biri üç biyolojik çoğaltmanın standart hatasıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> Şekil 4: Protokol bölümlerinin grafik özeti 1-3. Hücreler 4tU ile itmiyedilmiştir ve modifiye nükleotiti RNA'ya dahil etmek için büyümesine izin verilir. Bir tiyitli S. pombe başak zaman noktaları ve deneyler arasında normalleştirme sağlamak için eklenebilir. 4tU'nun nabzı, thiolated olmayan idrar ididin kullanılarak takip edilebilir. Etiketleme ya sürekli 4tU ek veya büyüme koşulları için bir değişiklik yapılabilir, kültür bölünmüş ve 4tU büyüme durumu değişikliği artan zamanlarda kültürlere eklendi, ama her etiketleme sadece kısa bir süre için. Hücreler toplanır ve RNA hücrelerden hazırlanır, tercihen homogenizer ve fenol bazlı yöntemler kullanılarak. RNA biyotinylated ve daha sonra biyotinylated RNA bir boyut dışlama sütunu kullanılarak unincorporated biotin saflaştırılmış. nsRNA şimdi streptavidin boncuk (bölüm 4, Şekil 5)ile arınma için hazırdır. Kırmızı daki sayılar protokoldeki adım numaralarına karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> Şekil 5: Protokol bölümünün grafik özeti 4. Bölüm 1'den 3'e (Şekil4)göre streptavidin boncuklar bloke edilir ve biyotinylated RNA örneği hazırlanan boncuklara eklenir. Biyotinylated RNA streptavidin boncuk ve un-biotinylated RNA bağlanır kaldırıldı ve yıkanmış. Biyotinylated RNA βME kullanılarak boncuklar eluted ve daha fazla araştırma için hazır çökelti. Kırmızı daki sayılar protokoldeki adım numaralarına karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: 1 ve 3 dakika tiyo-etiketleme de ithalatçıek kopyaları ile ve olmadan maya hücrelerinden nsRNA kurtarmaiyileştirilmesi. Fui1'in mayanın 2 μm plazmidden ifade edilen kendi organizatörü olduğunu unutmayın. Bu genin genomik kopyası bu her iki suşta da mevcuttur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
Ek Şekil 2: β-est AID 4U β-est AID 4U grafik protokolünün animasyonlu versiyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
Ek Dosya 1: 4tU_experiment_template.xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plazmid Adı</td>
			<td>İthalatçı/permease</td>
			<td>Işaretleyici</td>
			<td>Yorum</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td rowspan="2">Fui1, Urasil ve Uridine'i ithal ederek nabız/kovalamaca deneyleri için idealdir.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>LEU2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui-ΔPEST</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Fui1'in PEST motifi devre dışı bırakılmıştır, bu nedenle hücre içi ihtiyacı için yeterli hücre içi urasil olduğunda perma azolmaz. Etiketleme deneylerinde iyi çalışır ve nabız/kovalamaca performansını artırır.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fur</td>
			<td>
S. cerevisiae Kürk4</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Urasil permaz</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">YEpEBI311</td>
			<td>H. Sapiens ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2</td>
			<td rowspan="2">Miller ve ark.11. Ayrıca HSV timidine kigin geni içerir.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(dengeleyici nükleozit taşıyıcı)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Tüm plazmidler 2 μm esaslıdır. Tüm p4 plazmidler ve pAT plazmidlerin pRS16 serisi dayanmaktadır. FUI1 ve FUR4 kendi, endojen organizatörleri ifade edilir.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Plazmidler bu protokol ile kullanılır.

Watch this Scientific Journal Video about Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU at JoVE.com

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Hassas ve özellikle maya Saccharomyces cerevisiaeyeni transkripsiyonu RNA arındırmak için tiolated urasil kullanımı .

RNA In Vivo'nun 4-Thiouracil (Ers4tU) ile Son Derece Hızlı ve Spesifik Metabolik Etiketlemesi

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Başka hiçbir protokol yeni sentezlenmiş RNA gibi kısa bir zaman ölçeğinde analiz edilmesine izin verir, çünkü bu yöntem önemlidir ve bu kadar kısa bir darbe ile darbe-kovalamaca deneyleri sağlar. Bu protokol, Best AID 4U protokolü gibi protein tükenmesi ile iyi çalışır. Ana avantajı arka plan düşük olmasıdır.Bu, hemen hemen tüm nonthiolated RNA kaldırarak, kısa etiketleme süreleri sağlar. Yazılı protokol ayrıca yapılabileceği birçok farklı deney türünü ve bunları bu tekniğe nasıl entegre edebileceklerini de ayrıntılarıyla anlatır. Bu prosedüre başlamak için YMM ortasında mayayı 0,6 ile 0,8 arasında Bir OD 600'e yetiştirin.Bir duman kaputunda, 50 mililitrelik bir tüpe istenilen numune hacminin %30 ila %50'sine eşdeğer bir metanol ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın, etiketleyin ve soğuması için kuru buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, numunelerin uzun süreli depolanması için iki mililitrelik tüpleri etiketleyin ve soğuması için buzüzerine yerleştirin.İki mililitretüplerzirkoni adak ekleyin. Buz üzerinde numune başına en az bir mililitre su soğutun. Kültüre bir S.pombe çivisi eklenecekse, çözülmek için buz üzerinde siolated S.pombe hücrelerinin bir aliquot yerleştirin.Girdap çözülmüş aliquot ve kültürekleyebilirsiniz. Sonra 10 mikromolar bir konsantrasyon için kültüre 4tU ekleyin ve şiddetle karıştırın. 15 saniye ile beş dakika arasında bir süre için thio-label.Zaman kursunun sonuna kadar düzenli aralıklarla kültür den örnekler alın. Her örneği metanol içeren hazırlanan santrifüj tüplerinden birine ekleyin. Mühür her tüp, iyice karıştırmak için sallayın ve kuru buz üzerine yerleştirin.Tüm numuneler alındıktan sonra hepsini buza yerleştirin. Örneklerin hiçbirinin dondurulmamadığından emin olun. Herhangi bir dondurulmuş varsa, sürekli ters çevirerek elinize hafifçe ısıtın.Hücreleri 3,000 kez g ve dört santigrat derecede iki dakika boyunca hücreleri pelet için santrifüj. Sıvı dökün ve şiddetle yukarı ve aşağı boru ile buz soğuk su en az bir mililitre pelet resuspend. Süspansiyonu hazırlanan vida kapağı tüpüne aktarın ve tüpü buza yerleştirin.Hücreleri yeniden peletlemek için 13,000 kez g'den daha büyük bir hızda numuneleri kısaca santrifüj edin. Sonra buz üzerine geri yerleştirin ve sıvı çıkarın. İlk olarak, 400 mikrolitre AE tampon, 40 mikrolitre SDS ve 800 mikrolitre fenol düşük pH ekleyin.10 saniye girdap tarafından yeniden askıya alın. Daha sonra hücreleri homogenizer en düşük güç ayarında üç iki dakikalık patlamalar için lize. Homojenizasyon darbeleri arasında örnekleri iki dakika buzun üzerinde bırakın.Lysed hücreleri katılanıncaya kadar kuru buzun üzerine beş dakika yerleştirin. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 13.000 kez g'nin üzerinde bir hızda hücreleri döndürmek için bir mikrosantrifüj kullanın. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi fenol kloroform ekstraksiyonu ve kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirin.RNA çökelti 10 molar lityum klorür hacminin 1/3 ila 1/2 arasında ekleyin ve karıştırın. Santrifüj 13,000 kez g'den beş dakika daha hızlı. Sıvıyı çıkarın ve dregs kaldırmak için kısa bir süre örnek yeniden döndürün.Sonra, % 70 etanol 300 ila 500 mikrolitre ile pelet yıkayın. Yıkanmış peleti kısa bir süre için santrifüj edin ve kalan etanolleri çıkarın. RNA peletini 90 mikrolitre TE'de pH 7.0'da sallayarak 65 derecede ısıtarak yeniden çözün.Tam RNA çözünürasyon kontrol ettikten sonra, süspansiyonu 0,2 mililitrelik bir tüpe aktarın. Başlamak için, RNA'ya 10 mikrolitre HPDP-biotin çözeltisi ekleyerek biyotinylate ve iyice karıştırın. Karanlıkta 65 derecede 15-30 dakika kuluçkaya yat.Daha sonra, küçük bir reçine hacmi, boyut dışlama sütununa dahil edilmemiş biotin hariç hazırlayın. Sütunun alt etiketini çıkarın, kapağı gevşetin ve sütunu iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Arabelleği temizlemek ve akışı atmak için bir dakika boyunca 1, 500 kez g santrifüj.Daha sonra sütunun üst kısmına 0,3 mililitre TE ekleyin ve aynı koşulları kullanarak tekrar döndürün. Yıkanmış kolonu 1,5 mililitrelik taze bir tüpe aktarın. Örnek kuluçka tamamlandığında, örneği sütunun üst bölümüne ekleyin.İki dakika boyunca 1, 500 kez g santrifüj, tüpün altında biyotinylated RNA örneği bırakarak. Sütunu atın. Ve numuneyi içeren tüpe 10 molar lityum klorür 1/3 ila 1/2 hacim ekleyin.RNA'yı yeniden çöktürmek için karıştırın. İlk olarak, Depc tarafından işlenmiş suyun 200 mikrolitre rna yeniden eritin. RNA konsantrasyonu ölçün ve tüm numuneler için eşit miktarda RNA verecek her numune için hacimleri hesaplayın.Bu miktarda RNA'yı taze bir tüpe ekleyin ve DEPC ile işlenmiş suyu toplam 200 mikrolitre hacmine kadar ekleyin. Bir numune oda sıcaklığında olduğunda, 10 x NaTM tampon25 mikrolitre, bir azı lı sodyum fosfat 25 mikrolitre ve% 10 SDS 2.5 mikrolitre ekleyin. Iyice karıştırın ve 30 saniyeden daha kısa bir süre boyunca yaklaşık 100 kez g hafifçe santrifüj.Bir x NaTM tamponu, 0.1 molar sodyum fosfat ve %0.1 SDS ile her numune için iki mililitre boncuk tamponu hazırlayın. Düşük tutma 1.5 mililitre tüp streptavidin boncuk 50 mikrolitre ekleyin. Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve boncukların yerleşmesini bekleyin.Sonra, aspirasyon ile sıvı çıkarın. Boncukları yıkamak için, boncuk pelet tamamen askıya alınana kadar boncuk tampon ve girdap 200 mililitre ekleyin. Tüpü yaklaşık 100 kez en fazla beş saniye santrifüj edin.Boncukmıknatıs tarafından yakalanan izin vermek için manyetik rafa tüp yerleştirin. Az sayıda örnek varsa sıvıyı aspirasyon ile çıkarın. Sıvı yıkın ve sonra çok sayıda örnek varsa aspire.200 mikrolitre boncuk tamponu, 10 mikrolitre glikojen ve 2,5 mikrolitre tRNA ile blok. Orta hızda uç üzerinde dönerken 20 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi sıvıyı çıkarın ve tekrar yıkayın.Numunedeki boncukları yeniden askıya alın ve dönerken oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bu kuluçka sırasında, her örnek için taze bir 1,5 mililitrelik tüp hazırlayın. PH 5.3 ve glikojen 20 mikrogram üç molar sodyum asetat 1/10 hacim ekleyin.Üç saniye boyunca yaklaşık 100 kez g santrifüj. Bağlanmamış RNA'yı boncuklardan çıkarın ve metin protokolünde belirtildiği gibi yıkayın. RNA'yı eleştirmek için, boncuklara taze hazırlanmış 0,7 molar beta merkaptoetanol 50 mikrolitre ekleyin.Girdap ve santrifüj sonra, manyetik raf içinde bulamaç yerleştirin. Pipet Hazırlanan 1.5 mililitrelik santrifüj tüpler içine çözelti içeren RNA. Elute bir kez daha daha açıklandığı gibi.Daha sonra, eluted RNA artık boncuk kaldırmak ve taze, düşük bağlayıcı 0,5 mililitre santrifüj tüp sıvı aktarmak için manyetik raf geri örnek yerleştirin. Örneği karıştırın. Ve sonra nsRNA çökelti için etanol 2.5 cilt ekleyin.Karıştırma ve kuluçka sonra, en az 13, 000 kez g ve 20 dakika boyunca dört derece santigrat hızda santrifüj. Bu protokol kullanılarak kurtarılan snRNA'nın tipik verimleri burada gösterilmiştir. Sıfır noktasındaki RNA kurtarmasının, yaklaşık 30 milyar hücreden sadece 0,3 mikrogram RNA'nın kurtarıldığı uzun zaman noktalarından kurtarılançok küçük bir kısmı olduğunu unutmayın.Etiketleme sadece 30 saniye sonra, ancak, iki kat daha fazla RNA aynı sayıda hücre den toplanır. Biyoanalizör takibinde, RNA öncüllerimiz 1,000 nükleotite yakın bir tepe ve 1, 700'e 1, 800 nükleotitte bir çift tepe olarak görülebilir. Bu ara ların bolluğu, tiyasyon devam ettikçe artar.Thiolation daha sonra thio-labeling başlangıcından itibaren 15 saniye aralıklarla alınan örnekler ile gerçekleştirilir ve ACT1 RNA transkript işleme izlenir. Görüldüğü gibi pre-mRNA ve lariatlar sadece 15 saniye etiketlemeden sonra bile üretilir. Yaklaşık 45 saniye ile bir dakika arasında bir dakika sonra, lariats ve pre-mRNA miktarı bu RNA türlerinin çok transkripsiyon tarafından oluşturulan olarak birleştirme tarafından işlenir ile dengeye ulaşmak.En zor adımlar boncuk, yıkama ve engelleme içeren olanlar vardır. Boncukları kaybetmemeye veya kurumasına izin vermemeye dikkat edin. Yeni sentezlenen RNA'yı saflaştırdıktan sonra, herhangi bir geleneksel RNA analiz yordamını kullanabilirsiniz.RNA'yı bir biyoanalizör veya benzeri bir şekilde çalıştırmanız önerilir. Bundan sonra, normalde RNA analiz etmek için QPCR ve RNA-Seq kullanın. Bu yöntem, RNA işleme kinetik analiz için ideal olduğunu kanıtladı.En tehlikeli adımlar RNA ekstraksiyonfenol ve kloroform kullananlardır. Bu kimyasalları mühürsüz bir kapta her kullandığınızda, bunu bir duman başlığında yapın ve uygun koruyucu giysiler, laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin. Bir sızıntıya yol açacaktır gibi vida kapağı tüp iplik hiçbir zirkon boncuk lar olduğunu özellikle dikkat edin.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Rat Pankreas Dokusunun Hızlı ve Uygun Maliyetli RNA Ekstraksiyonu

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...