Name: genotyping and quantification of in situ hybridization staining in zebrafish
Uploaded: 2020-01-28T12:00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish at JoVE.com

Nous tenons à remercier le personnel des services biomédicaux à Oxford et Birmingham pour l'excellente élevage de poissons zèbres. T.D. a été financé par une bourse d'études doctorales Wellcome Trust Chromosome and Developmental Biology (#WT102345/Z/13/Z). R.M. et M.K. ont été financés par la British Heart Foundation (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) et sont reconnaissants de leur généreux soutien. R.M. reconnaît le soutien du BHF Centre of Research Excellence (RE/13/1/30181), Oxford.

Les procédures impliquant des sujets animaux sont réglementées par la Loi de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) et ont été approuvées par le ministère de l'Intérieur et l'Organisme local d'examen du bien-être et de l'éthique des animaux.
1. Image embryons ish-tachés
<ol><li>Préparer une solution de glycérol (50 % à 80 % dans un tampon PBS 1x) et mélanger pour homogénéiser la solution (p. ex., laisser dans un rouleau pendant au moins 5 min). Cette solution peut être conservée pendant des mois à température ambiante.</li>
	<li>Après l'hybridation in situ14,15,16,17, transférer les embryons à la solution de glycérol avec une pipette Pasteur de 3 ml et laisser se contenter d'au moins 5 min. Si l'imagerie des embryons de plus de 24 hpf (heures après la fécondation), ils peuvent être blanchis comme décrit18.<ol>
<li>Préparer et étiqueter suffisamment de tubes PCR pour transférer des embryons tachés d'ISH après l'imagerie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 100% de glycérol au fond du puits dans une lame de dépression en verre avec une pipette Pasteur de 3 ml.</li>
	<li>À l'aide d'une pipette Pasteur de 3 ml, transférer un seul embryon taché d'ISH sur la glissière de verre et orienter au besoin sous un stéréomicroscope équipé d'un appareil photo numérique et d'un éclairage inférieur et supérieur. REMARQUE : Utilisez des pointes de pipette de chargement de gel pour positionner les embryons en fonction de l'imagerie, mais d'autres outils (p. ex. forceps, aiguille disséquante) seront tout aussi adéquats.</li>
	<li>À l'aide du premier embryon, ajuster le temps d'illumination et d'exposition au grossissement désiré. Utilisez ces conditions pour TOUS les embryons dans la même expérience (c.-à-d., si l'imagerie de 40 embryons à partir d'un incross mutant hétérozygote, assurez-vous que l'éclairage, le temps d'exposition et le grossissement sont les mêmes pour tous).</li>
	<li>Imagez autant d'embryons que nécessaire. Étiquetez chaque image avec un numéro unique. Après l'imagerie, transférer l'embryon dans un tube/plaque PCR étiqueté avec le même numéro. REMARQUE : Les images doivent être enregistrées sous forme de fichiers TIF, mais d'autres formats sont également adéquats.<ol>
<li>Au besoin, retirer l'excès de glycérol dans les tubes/plaques PCR. REMARQUE : À ce stade, les embryons peuvent être stockés dans les tubes PCR pendant plusieurs semaines à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extraire l'ADN et le génotype des embryons ish-tachés
REMARQUE: Ici, utilisez une méthode fiable et peu coûteuse pour isoler l'ADN génomique basé sur la méthode HoTSHOT19 avec une efficacité d'extraction d'ADN de 95%-100%3.
<ol><li>Une fois l'imagerie terminée, ajouter de 40 à 75 l de tampon de lyse alcaline (p. ex., HoTSHOT) à chaque tube.</li>
	<li>Incuber à 95 oC pendant environ 30 min et refroidir les tubes à 4 oC avant d'ajouter un volume égal de tampon de neutralisation. Une incubation d'une nuit à 4 oC peut améliorer l'efficacité du PCR. REMARQUE : À ce stade, l'ADN génomique peut être utilisé pour le génotypage ou stocké à -20 oC jusqu'à ce qu'il soit nécessaire.</li>
	<li>Échantillons de génotype avec une méthode appropriée (p. ex. HRMA, RFLP)3,20,21 selon les besoins pour la mutation d'intérêt.</li>
	<li>Notez le génotype correspondant à chaque échantillon (p. ex., à l'aide d'un logiciel de tableur).</li>
</ol>3. Quantifier l'intensité pixel des embryons tachés d'ISH (analyse d'image à l'aide du logiciel Fidji)
<ol><li>Pour quantifier l'intensité du signal de coloration de coloration in situ hybridation (ISH), convertissez toutes les images en échelle grise 8 bits comme décrit3. Si les images ont été enregistrées comme . fichiers TIF, utiliser une macro Fidji pour la conversion par lots3. Vous pouvez également convertir des images dans d'autres formats (p. ex., . JPG) à . TIF en utilisant un logiciel approprié, puis convertir à l'échelle grise 8 bits en utilisant Fidji. Pour plus de commodité, voici la procédure étape par étape qui a été publié précédemment3, avec quelques modifications.</li>
	<li>Ouvrez des images aux Fidji et inverser l'image avec Edit 'gt; Invert. Ensuite, changer le type d'image à 8 bits (Image 'gt; Type 'gt; 8-bit).</li>
	<li>À l'aide de l'outil de sélection du polygone, dessiner manuellement la région d'intérêt (ROI) sur l'image autour de la région contenant le signal.</li>
	<li>Appuyez sur t pour ouvrir le gestionnaire de retour sur investissement. Utilisez la commande Mesure du gestionnaire du retour sur investissement pour mesurer l'intensité du retour sur investissement. Copiez la valeur moyenne de la fenêtre Résultats à un logiciel de tableur.</li>
	<li>Déplacez le même ROI, assurant la même taille et la même forme que la région d'origine, à une région du poisson zèbre ne contenant aucune coloration. Répétez l'étape 3.4 pour mesurer l'arrière-plan.</li>
	<li>Pour obtenir l'intensité moyenne du pixel du signal ISH, soustrayez la valeur moyenne d'intensité de la région d'arrière-plan de celle de la région tachée pour chaque embryon.</li>
	<li>Attribuez chaque valeur d'intensité à un génotype (à partir de l'étape 2.3).</li>
</ol>4. Analyser les résultats à l'aide de tests statistiques appropriés
<ol><li>Tracez toutes les valeurs sur une parcelle Q-Q pour identifier les écarts par rapport à la distribution normale. REMARQUE : La distribution normale peut également être vérifiée avec le test Kolmogorov-Smirnov ou le test Shapiro-Wilk. Cependant, pour les grandes tailles d'échantillon il y a un risque élevé de faux positifs dans ces essais.</li>
	<li>S'il y a de fortes déviations par rapport à la distribution normale, transformez toutes les valeurs (en utilisant les fonctions ln ou sqrt) pour vous assurer qu'elles sont normalement distribuées avant de procéder.</li>
	<li>Analyser les différences entre les valeurs (transformées si nécessaire) attribuées à chaque génotype (wt vs heterozygote vs mutant) avec ANOVA à 2 queues avec des niveaux de confiance de 95%, ce qui explique l'égalité des écarts avec le test de Levene et la correction Welch. Pour les comparaisons par paires entre chaque paire de génotypes, utilisez le test post-hoc de Tukey (écarts égaux) ou Games-Howell (écarts inégaux).<ol>
<li>Si les valeurs ne sont pas normalement distribuées malgré la transformation, utilisez un test non paramétrique (Kruskall-Wallis) pour analyser les différences entre les valeurs classées et le test de comparaisons multiples d'un Dunn post-hoc avec la correction Bonferroni pour le pairwise Comparaisons.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tracez les valeurs non transformées (à partir de l'étape 3.6) comme des parcelles de points pour la meilleure représentation des résultats.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRz:+a+database+of+zebrafish+validated+sgRNAs.">CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).</li><li>Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+pipeline+for+parallel+image-based+quantification+of+gene+expression+and+genotyping+after+in+situ+hybridisation.">An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation.</a> Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).</li><li>Bresciani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBFbeta+and+RUNX1+are+required+at+2+different+steps+during+the+development+of+hematopoietic+stem+cells+in+zebrafish.">CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish.</a> Blood. 124 (1), 70-78 (2014).</li><li>Gore, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+hematopoiesis+by+DNA+methylation.">Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation.</a> Elife. 5, e11813 (2016).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Specific+Gain+of+RTK+Signalling+Uncovers+Selective+Cell+Vulnerability+during+Embryogenesis.">Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis.</a> PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).</li><li>Wen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA5+SUMOylation+is+indispensable+for+zebrafish+cardiac+development.">GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).</li><li>Espin-Palazon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence.">Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence.</a> Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).</li><li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium.">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).</li><li>Genthe, J. R., Clements, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-spondin+1+is+required+for+specification+of+hematopoietic+stem+cells+through+Wnt16+and+Vegfa+signaling+pathways.">R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways.</a> Development. 144 (4), 590-600 (2017).</li><li>Kalev-Zylinska, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx1+is+required+for+zebrafish+blood+and+vessel+development+and+expression+of+a+human+RUNX1-CBF2T1+transgene+advances+a+model+for+studies+of+leukemogenesis.">Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis.</a> Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).</li><li>Butko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata2b+is+a+restricted+early+regulator+of+hemogenic+endothelium+in+the+zebrafish+embryo.">Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo.</a> Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Lleras Forero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+of+the+zebrafish+axial+skeleton+relies+on+notochord+sheath+cells+and+not+on+the+segmentation+clock.">Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Jowett, T., Yan, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+in+situ+hybridization+to+zebrafish+embryos.">Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos.</a> Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Narayanan, R., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+by+Whole+Mount+in+situ+Hybridization+and+DNA+Extraction+for+Genotyping+of+Zebrafish+Embryos.">Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos.</a> Bio-protocol. , e3193 (2019).</li><li>Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gata1/pu.1+lineage+fate+paradigm+varies+between+blood+populations+and+is+modulated+by+tif1gamma.">The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma.</a> EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).</li><li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+(HotSHOT).">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li><li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies.">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li><li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+morpholino+use+in+zebrafish.">Guidelines for morpholino use in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 13 (10), e1007000 (2017).</li><li>El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation:+A+phenomenon+in+search+of+mechanisms.">Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms.</a> PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).</li><li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns.">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components.">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).</li><li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).</li><li>Meier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+binding+partners+of+Ldb1+are+required+for+haematopoietic+development.">Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development.</a> Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).</li><li>Kettleborough, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+analysis+of+zebrafish+protein-coding+gene+function.">A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function.</a> Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).</li><li>Leung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+VEGFA+functions+in+arteriogenesis+and+hematopoietic+stem+cell+specification.">Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification.</a> Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Quelques facteurs devraient être pris en considération lors de l'utilisation de cette méthode pour quantifier l'expression des gènes. Les conditions d'imagerie doivent être maintenues tout au long de l'expérience (par exemple l'éclairage, les temps d'exposition et le positionnement des embryons) afin de réduire la variabilité entre les mesures. Un point critique est d'éviter la sursouture des échantillons, car les différences dans la coloration entre les échantillons peuvent être masquées. Par exemple, la diminution de l'expression vegfA en l'absence d'Eto2 dans les embryons de laevis 30 de Xenopus n'a pu être détectée qu'en surveillant soigneusement la coloration sur une période de 24 heures. Ainsi, il est de bonne pratique de déterminer empiriquement les niveaux de coloration adéquats pour chaque gène qui représentent le mieux son expression, sans atteindre la saturation. La surcoloration augmentera également artificiellement l'intensité de pixel de fond dans les images converties à l'échelle grise 8 bits et faussera les résultats de quantitation. Dans les cas extrêmes, le niveau de fond dans les tissus embryonnaires peut être plus élevé que le signal ISH dans le retour sur investissement sélectionné et ces échantillons devraient être exclus de l'analyse. Un phénomène similaire a été observé lorsque nous avons testé la pertinence du jaune non taché pour la correction du fond (figure 4). Après l'inversion et la conversion à 8 bits les pixels plus foncés dans la région jaune deviennent plus lumineux que le signal ISH dans l'embryon et rendent l'arrière-plan corrigé des valeurs négatives. Ainsi, éviter l'utilisation du jaune pour la correction de fond. La mesure du signal de fond dans les zones pigmentées de l'embryon (p. ex., les yeux ou la partie dorsal du tronc à partir de 26/28 hpf) faussera également les résultats de quantitation et devrait également être évitée. Il existe des protocoles disponibles pour le blanchiment des embryons de poisson zèbre, avant ou après ISH18 et le blanchiment des embryons de plus de 24 hpf avant l'imagerie est recommandée.
Étant donné que cette méthode repose sur la mesure de l'intensité des pixels dans une zone définie par rapport à une intensité de pixel de fond dans une zone non tachée équivalente, elle n'est pas appropriée pour la quantitation de gènes omniprésents ou presque omniprésents exprimés tels quels. Au lieu de cela, il est bien adapté pour mesurer l'expression des gènes avec une distribution spatialement restreinte où une zone pour mesurer l'intensité des pixels de fond peut être facilement identifiée. Notre analyse supplémentaire suggère maintenant que l'utilisation d'une zone plus petite (3-4x plus petite) pour la correction de fond donne des résultats similaires à l'utilisation d'une zone équivalente à celle du retour sur investissement. Cela étend l'applicabilité de la méthode aux gènes exprimés dans des domaines spatiaux plus larges (et nécessitant ainsi des RVI plus importants pour les mesures d'intensité), à condition d'utiliser des zones clairement non tachées de l'embryon pour la correction de fond.
Enfin, nous suggérons que le génotypage soit effectué en parallèle ou après la quantitation de l'image afin de minimiser les biais de l'expérimentateur. Demander à un deuxième expérimentateur de répéter la quantitation sur des échantillons anonymisés et de comparer avec la première ensemble de mesures aidera également à réduire le biais de l'expérimentateur. Si les images à quantifier proviennent d'une comparaison entre les traitements qui ne nécessitent pas de génotypage (p. ex., type sauvage vs inhibiteur chimique ou type sauvage vs MO knockdown), l'expérimentateur effectuant les mesures doit être aveuglé par l'identité du Échantillon.

L'introduction de technologies d'édition du génome (ZFN, TALENs et plus récemment, CRISPR/Cas9) a conduit à une augmentation massive du nombre de laboratoires à travers le monde qui utilisent ces systèmes pour étudier la fonction de gènes spécifiques in vivo. Les poissons zèbres en particulier sont propices à la manipulation génétique et de nombreux mutants ont été générés au cours des dernières années1,2. Pour les biologistes du développement, l'une des méthodes les plus courantes pour évaluer les conséquences phénotypiques des mutations génétiques dans le développement embryonnaire est l'hybridation in situ (ISH). En l'absence de défauts morphologiques évidents qui séparent les mutants homozygotes de leur type sauvage ou de leurs frères et sœurs hétérozygotes, il est essentiel d'être en mesure d'identifier correctement différents génotypes avec précision.
L'ISH classique s'appuie sur des analyses qualitatives des intensités de signal pour tirer des conclusions sur les interactions réglementaires entre le gène d'intérêt et les gènes marqueurs sélectionnés. Bien qu'utiles, ces analyses souffrent de variations techniques et peuvent être biaisées par les attentes des chercheurs. Ainsi, une méthode a été développée pour quantifier l'expression des gènes après l'imagerie des embryons tachés d'ISH, sans connaissance préalable du génotype correspondant. Ceci a été suivi d'une extraction efficace d'ADN et d'un génotypage qui nous a permis de corréler quantitativement le génotype avec l'expression génique3. Alors que le génotypage des embryons post ISH a été utilisé avant4,5, quantification basée sur l'image des modèles ISH n'a pas été largement utilisé en dehors d'un couple d'études6,7. Les alternatives les plus populaires reposent sur la notation visuelle ou le comptage des cellules ish-tachées8,9,10, à la fois sujettes à une mauvaise reproductibilité et le biais des chercheurs. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les changements dans les gènes avec des modèles d'expression qui sont spatialement restreints, tels que runx1 ou gata2b, tous deux exprimés dans un sous-ensemble restreint de cellules de plancher aortique appelé l'endothélium hémogène11,12.
Ici, nous visons à fournir un guide pratique pour la mise en œuvre de la quantification par l'analyse d'image en utilisant Fidji13, ainsi que le protocole d'extraction et de génotypage de l'ADN. Ceci est destiné à illustrer visuellement notre méthode précédemment publiée3. Notre méthode permet une représentation précise de la variation de l'expression génique détectée par ISH et une affectation impartiale des niveaux d'expression génique à des génotypes spécifiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids)</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>A1402-3700</td>
			<td>96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>LW4114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavity slides</td>
			<td>Brand</td>
			<td>BR475535-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0)</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10289651</td>
			<td>the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F3000 Fiber Optic Cold Light Source</td>
			<td>Photonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8.01</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotSHOT alkaline lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td>25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotSHOT neutralization buffer</td>
			<td></td>
			<td>Tris HCl 40 mM, pH 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X) pH 7.4</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping and quantification of in situ hybridization staining in zebrafish

L'hybridation in situ (ISH) est une technique importante qui permet aux chercheurs d'étudier la distribution de l'ARNm in situ et a été une technique critique en biologie du développement depuis des décennies. Traditionnellement, la plupart des études d'expression génique reposaient sur l'évaluation visuelle du signal ISH, une méthode sujette à des biais, en particulier dans les cas où les identités d'échantillons sont connues a priori. Nous avons déjà fait rapport sur une méthode pour contourner ce biais et fournir une quantification plus précise des signaux ISH. Ici, nous présentons un guide simple pour appliquer cette méthode pour quantifier les niveaux d'expression des gènes d'intérêt dans les embryons ish-tachés et corréler cela avec leurs génotypes correspondants. La méthode est particulièrement utile pour quantifier les signaux d'expression génique séminospécifiques dans des échantillons de génotypes mixtes et elle offre une alternative impartiale et précise aux méthodes traditionnelles de notation visuelle.

Ici, nous décrivons l'application pratique du pipeline pour la quantitation d'image et le génotypage des embryons tel qu'il est publié ailleurs3. Le flux de travail de la méthode est indiqué dans la figure 1. Pour illustrer comment utiliser cette méthode, ISH a été réalisé pour dnmt3bb.1 dans 33 embryons de hpf à partir d'un runx1W84X /22 incross (Figure 2). 130 embryons ont été photographiés en utilisant les mêmes conditions d'illumination que celles décrites dans le protocole et les étiquetant avec un numéro unique. Après la formation image, chaque embryon a été transféré à un tube de PCR pour le génotypage. À ce stade, l'analyse d'image a été effectuée pour attribuer une valeur d'intensité de pixel à chaque image. Le génotype a ensuite été affecté à son image correspondante et les valeurs d'intensité des pixels regroupées en fonction de leur génotype pour l'analyse statistique. Une diminution de l'expression dnmt3bb.1 a été détectée chez les mutants runx1W84X/W84X (Figure 2A,B)3, en accord avec les observations précédentes5. Fait intéressant, les embryons d'hétérozygote runx1W84X/MD n'ont montré aucune différence significative dans l'expression dnmt3bb.1 (Figure 2A,B) par rapport à ses frères et sœurs de type sauvage, ce qui suggère qu'une copie de Runx1 est suffisante pour maintenir l'expression dnmt3bb.1 à des niveaux appropriés.
Beaucoup de mutants de poisson zèbre ne montrent pas un phénotype embryonnaire qui peut autrement être détecté en utilisant d'autres technologies de perte de fonction comme les oligonucléotides morpholino (MO). Cet écart peut être attribué à un certain nombre de causes, y compris les effets hors cible, la compensation des protéines maternelles, un allèle hypomorphe23 ou le phénomène récemment découvert de compensation génétique24,25,26,27. Dans cet exemple, nous avons demandé si l'expression runx1 a été réduite ou perdue dans les mutants lmo4auob100 depuis que les données précédemment publiées à l'aide d'un MO lmo4a suggéré que runx1 est diminué dans les morphants lmo4a 28. Ici, l'analyse n'a révélé aucune différence significative dans l'expression runx1 entre le type sauvage et lmo4auob100 mutants homozygous3 (Figure 3A,B). Une analyse plus approfondie par l'embryon unique qPCR a montré qu'il y avait une diminution faible mais significative de l'expression runx1 chez les mutants lmo4auob100 (Figure 3C). Ainsi, il est possible que la quantification de l'image ne soit pas en mesure de détecter de petites différences dans les niveaux d'expression. Alternativement, l'absence de différence entre les génotypes que nous avons détectés est réelle et les expériences qPCR détectent des changements dans l'expression runx1 dans d'autres tissus comme le telenchephalon où lmo4a et runx1 sont exprimés. Les chercheurs devraient toujours vérifier leurs résultats avec une méthode indépendante comme qPCR, mais idéalement enrichissant pour le tissu d'intérêt par la cytométrie de flux, par exemple.
Dans de rares cas où l'ISH a un arrière-plan élevé (figure 3D), la valeur d'intensité des pixels de cette zone est si élevée que la soustraction de la valeur du signal produit un nombre négatif et, dans de tels cas, ces embryons seraient exclus de l'analyse. D'après notre expérience, cela s'est produit dans environ 0,4 % des embryons sondés runx13, mais peut varier d'une expérience à l'autre, de sondes ou de lots de réactifs. Bien que cela puisse être une limitation de la méthode, la faible fréquence de fond élevé est très peu susceptible d'influencer les résultats globaux.
Pour tester l'effet de la sélection de différentes zones pour les corrections de fond, nous avons d'abord mesuré l'intensité pixel du signal ISH runx1 dans 28 embryons hpf, en utilisant différentes régions pour les corrections de fond (Figure 4). Quatre régions différentes ont été sélectionnées : deux dans la région du tronc (R1 et R2), une dans la région jaune (non tachée, mais susceptible d'accumuler des taches de fond) et une zone plus petite antérieure au ROI (R4, Figure 4B). La mesure de l'intensité des pixels dans ces régions a montré une différence d'intensité relativement stable entre le retour sur investissement et l'une ou l'autre zone de fond(figure 4C). Cependant, R3 a toujours montré des valeurs très élevées (au-dessus de celles du roi-roi). Après l'inversion et la conversion à 8 bits, la région jaune semble très lumineux et n'est donc pas adapté pour une utilisation comme une correction de fond. R2 était plus proche du retour sur investissement, mais contenait un signal ISH, et l'utiliser pour la correction a diminué l'intensité moyenne des pixels par rapport à R1 (situé plus dorsally, loin du signal ISH) ou R4. Ainsi, R1 ou R4 sont des zones appropriées qui peuvent être utilisées pour la correction de fond (malgré la superficie de R4 étant plus petite que celle de R1). Ensuite, nous avons souhaité comparer comment l'utilisation de R1 ou R4 a affecté les résultats lors de la comparaison de l'expression runx1. Pour cela, nous avons croisé dll4- heterozygotes29 et analysé l'expression runx1 dans le type sauvage choisi au hasard et dll4-/-embryons (Figure 4E). Bien que l'utilisation de R1 ou R4 pour la correction de fond ait affecté les valeurs individuelles, les intensités moyennes de pixels dans le même génotype n'étaient pas significativement différentes (Figure 4E). De plus, la comparaison de l'expression runx1 donne toujours des valeurs d'intensité moyenne similaires entre les génotypes utilisant des zones R1 ou R4 comme correction de fond (respectivementR116,3 etR418,2). Pris ensemble, nous avons conclu que, bien que le choix de la zone de fond soit important, les principaux critères sont qu'il n'inclut pas les régions jaunes (enclins à l'accumulation de taches de fond) et qu'il ne devrait pas contenir de coloration (spécifique) qui pourrait fausser les valeurs d'intensité de pixels de l'arrière-plan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig1a.jpg"> Figure 1 : Flux de travail du protocole parallèle de quantitation et de génotypage de l'image. Les embryons prélevés sur un croisement de poissons hétérozygotes pour un allèle mutant sont sondés pour le gène mesuré avec un protocole ISH standard. Après l'imagerie, l'ADN génomique est extrait à l'aide du protocole HotSHOT en ajoutant le tampon de lyse directement à l'embryon dans un tube PCR de 0,2 ml, suivi d'une incubation de 30 min à 95 oC. Cet ADN est utilisé pour le génotypage des embryons par PCR, PCR et le polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP), les essais de KASP ou toute autre méthode appropriée. En parallèle, les images de chaque embryon sont inversées et converties en échelle grise 8 bits. Les ROI de forme et de taille identiques contenant le signal ISH (jaune) et l'arrière-plan (bleu) sont sélectionnés et mesurés manuellement. Les mesures, attribuées aux génotypes correspondants, sont analysées statistiquement. Figure adaptée de Dobrzycki et coll.3<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig02.jpg"> Figure 2 : La quantitation d'image chez les mutants runx1 révèle des niveaux réduits d'expression dnmt3bb.1 par ISH. (A) Exemple d'images d'ISH dans 33 hpf de type sauvage (bleu), runx1-/W84X (vert) et runx1W84X/W84X (orange) embryons, montrant dnmt3bb.1 expression dans l'aorte dorsal. (B) Les valeurs d'intensité des pixels de l'ARNm dnmt3bb.1 dans les embryons runx1W84X/W84X(n-36) sont significativement diminuées par rapport aux types sauvages (n-32) et aux hétérozygotes (n-62) (ANOVA, p lt; 0,001). Les coefficients de variation sont respectivement de 24 %, 22 % et 21 % pour les groupes de type sauvage, d'hétérozygote et de mutants. Le point de données bleu, vert et orange correspond à l'exemple d'images du panneau A. Les barres représentent la moyenne de l'essai post-hoc de l'indice s.d. p 'lt;0.001 (tests post-hoc Games-Howell). Figure adaptée de Dobrzycki et coll.3<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig03.jpg"> Figure 3 : Mesurer les niveaux d'expression runx1 par ISH chez les mutants lmo4auob100. (A) Images représentatives de l'ISH pour runx1 en type sauvage de 28 hpf (bleu), hétérozygotes (vert) et lmo4auob100/uob100 (orange) embryons, montrant l'expression dans l'aorte dorsale. (B) Quantification du signal de l'ARNm runx1, détecté par ISH, à partir de 28 hpf type sauvage (n 15), heterozygous lmo4a'/- (het) (n '34) et lmo4auob100/uob100 mutant (n '18) embryons d'un embrayage ne montre aucune différence significative dans l'intensité du pixel runx1 parmi les différents génotypes (ANOVA,'aNOVA, 'gt; p 0.6). Le point de données bleu, vert et orange correspond à l'exemple d'images du panneau A. Les barres représentent des embryonsd'ARNm runx1 normalisés (2- Ct)en type sauvage unique (bleu; n-12) et lmo4auob100/uob100 (mut, orange; n-12) embryons, mesurés par qRT-PCR, montrant des niveaux diminués de runx1 chez les mutants par rapport au type sauvage. p lt; 0,05(t test). (D) Exemple d'une expérience ISH sur un embryon de 28 hpf (taché pour runx1, pointes de flèche jaunes) montrant un fond élevé. Figure adaptée de Dobrzycki et coll.3<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig04.jpg"> Figure 4 : Effet de la correction de l'intensité de fond sur les résultats de la mesure. (A) Image représentative de la coloration runx1 ISH dans un embryon de type sauvage à 28 hpf. (B) Même image après l'inversion et la conversion en 8 bits. La région d'intérêt (ROI) est mise en évidence en vert et quatre zones différentes utilisées pour la correction de fond (R1-R4) sont mises en évidence en jaune. (C) Mesures de l'intensité brute des pixels dans toutes les régions indiquées dans le panneau B. Notez que l'intensité en R3 (jaune) est constamment plus élevée que le signal ISH réel dans le ROI (n-11). (D) Niveaux d'expression Runx1 dans le ROI en utilisant les zones d'arrière-plan R1, R2 et R4. Zones de retour sur investissement, R1, R2 et R3-28500 pixels; R4 à 8500 pixels. Notez que l'arrière-plan R3 n'a pas été utilisé pour cette comparaison car la correction de fond (ROI-R3) a constamment donné des valeurs négatives. (E) Niveaux d'expression Runx1 dans le type sauvage et dll4-/- mutants utilisant R1 ou R4 pour la correction de fond (n -10 pour chaque échantillon). L'analyse statistique dans les panneaux D et E a été effectuée à l'aide d'un test Kruskal-Wallis non paramétrique, en supposant que les valeurs d'intensité des pixels ne sont normalement pas distribuées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Les technologies d'édition génétique ont permis aux chercheurs de générer des mutants de poissons zèbres pour étudier la fonction génique avec une relative facilité. Ici, nous fournissons un guide pour effectuer le génotypage d'embryons parallèles et la quantification des signaux d'hybridation in situ chez le poisson zèbre. Cette approche impartiale offre une plus grande précision dans les analyses phénotypiques basées sur l'hybridation in situ.

Génotypage et quantification de l'hybridation in situ Taining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Les conséquences des mutations sur l’expression des gènes sont souvent évaluées qualitativement par hybridation in situ et généralement notées visuellement, ce qui est subjectif et biaisé par les attentes du chercheur. Cette méthode fournit un moyen plus cohérent de comparer les expériences in situ en quantifiant les intensités d’image et supprime ce biais. Cela peut également être facilement adapté à d’autres systèmes modèles qui utilisent l’hybridation in situ comme lecteur d’une expression génétique.Commencez par l’imagerie des embryons tachés d’hybridation in situ ou d’ISH. Préparer une solution de glycérol et la mélanger pour homogénéiser. Transférez les embryons à la solution glycérol avec une pipette Pasteur de trois millilitres et laissez-les se contenter d’au moins cinq minutes.Préparez et étiquetez suffisamment de tubes PCR pour transférer les embryons tachés d’ISH après l’imagerie, puis utilisez une pipette Pasteur de trois millilitres pour ajouter 100% glycérol au fond du puits d’une glissade de dépression de verre. Transférez un seul embryon taché d’ISH sur la lame de verre et orientez-le sous un microscope stéréo équipé d’un appareil photo numérique et d’un éclairage inférieur et supérieur. À l’aide du premier embryon, ajustez l’éclairage et le temps d’exposition au grossissement désiré.Imagez autant d’embryons que nécessaire et étiquetez chaque image avec un nombre unique. Après l’imagerie, transférer chaque embryon dans un tube PCR étiqueté avec le même nombre et, si nécessaire, aspirer l’excès de glycérol des tubes PCR. Pour extraire l’ADN, ajouter 40 à 75 microlitres d’un tampon de lyse alcaline tel que HoTSHOT à chaque tube.Incuber les tubes à 95 degrés Celsius pendant environ 30 minutes, puis les refroidir à quatre degrés Celsius. Ajoutez un volume égal de tampon de neutralisation et procédez au génotypage pour la mutation d’intérêt. Pour effectuer l’analyse d’image, sélectionnez et ouvrez l’image aux Fidji et inversionz-la en cliquant sur Modifier puis Inversez, puis convertissez le type d’image en 8 bits en cliquant sur l’onglet Image, en sélectionnant type et en sélectionnant 8 bits.Sélectionnez l’outil polygone et dessinez manuellement la région d’intérêt ou le retour sur investissement sur l’image autour de la région qui contient le signal ISH à mesurer. Appuyez sur T pour ouvrir le gestionnaire de roi et sélectionner la région d’intérêt, puis cliquez sur Mesurer. Copiez la valeur moyenne de la fenêtre Résultats à une feuille de calcul.Pour mesurer l’intensité de l’arrière-plan, déplacez le retour sur investissement vers une région de l’embryon sans coloration et cliquez sur Ajouter dans le gestionnaire de retour sur investissement. Sélectionnez la région d’arrière-plan et cliquez sur Mesurer, puis enregistrez la valeur d’intensité moyenne dans la feuille de calcul. Obtenez l’intensité moyenne des pixels du signal d’hybridation NC2 en soustrayant l’intensité moyenne de l’arrière-plan de celle de la région tachée.Après avoir déterminé l’intensité moyenne des pixels de chaque échantillon, attribuez un génotype à chaque échantillon. Si le génotype ne peut pas être déterminé, exclure l’échantillon de l’analyse ultérieure. Trier les valeurs moyennes d’intensité de l’échantillon en fonction du génotype et procéder à des tests statistiques.L’utilité de cette technique a été démontrée sur ISH pour dnmt3bb. 1 dans les embryons d’un runx1 hétérozygotes incross. Une diminution de dnmt3bb.1 expression a été détectée chez les mutants homozygotes runx1 tandis que les embryons hétérozygotes n’ont montré aucune différence significative dans dnmt3bb. 1 expression. En essayant de déterminer l’effet de la mutation lmo4 sur l’expression runx1, cette analyse n’a pas montré de différences significatives dans l’expression entre le type sauvage et les mutants homozygous lmo4.Cependant, une petite diminution de l’expression runx1 a été détectée par qPCR d’embryon simple. Dans environ 0,4 % des embryons sondés par runx1, l’ISH avait un fond élevé qui a donné lieu à un nombre négatif lorsqu’il a été soustrait du signal. Dans de tels cas, les embryons ont été exclus de l’analyse.Quatre régions différentes sur les embryons ont été testées pour optimiser les corrections de fond. Bien qu’il y ait eu une différence relativement stable dans l’intensité du retour sur investissement dans l’une ou l’autre des zones de fond, R3 a toujours montré une intensité plus élevée que le retour sur investissement et ne devrait pas être utilisé pour la correction de fond. R1 et R4 se sont avérés être les domaines les plus appropriés pour la correction des antécédents.Il est important de trouver les meilleures conditions pour l’imagerie et de les garder inchangées tout au long de l’expérience. Nous recommandons également de quantifier l’intensité des pixels avant d’attribuer un génotype à chaque échantillon.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

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Comprendre organogenèse précoce aide d&#39;un simplifié<em&gt; In Situ</em&gt; Protocole hybridation in<em&gt; Xenopus</em

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Recherche

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In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

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Imagerie de calcium fluorescent et hybridation in situ subséquente pour la caractérisation neuronale de précurseur dans Les laevis de Xenopus

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

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Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...