Name: genotyping and quantification of in situ hybridization staining in zebrafish
Uploaded: 2020-01-28T12:00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish at JoVE.com

ברצוני להודות לצוות השירותים הביו-רפואיים באוקספורד וברמינגהאם עבור גידול דגים מעולה. T.D. היה ממומן על ידי כרומוזום אמון ברוכים ה#WT102345 בביולוגיה התפתחותית מלגה לדוקטורט (בשנת המאה השלוש/13/Z). עקב חומרי גלם ו-מ. מ. מומן על ידי קרן הלב הבריטית (BHF IBSR מלגת/13/50/30436) ומודים על תמיכתם הנדיבה. עקב חומרי גלם מכיר תמיכה ממרכז BHF של מצוינות מחקר (RE/13/1/30181), אוקספורד.

הליכים הכרוכים בנושאי בעלי חיים מוסדרים על ידי בעלי החיים (הליכים מדעיים) חוק 1986 ואושר על ידי המשרד הביתי ואת החיים המקומיים רווחה וביקורת אתית גוף.
1. העוברים ויטראז
<ol><li>הכינו פתרון גליצרול (50% – 80% ב-1x מאגר PBS) וערבבו כדי להגון את התמיסה (למשל, להשאיר ברולר לפחות 5 דקות). פתרון זה ניתן לשמור במשך חודשים בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר באתרו היברידיזציה14,15,16,17, העברת עוברים לפתרון גליצרול עם הפיפטה 3 מ ל ולצאת להתפשר לפחות 5 דקות. אם הדמיה עוברים מעלה 24 hpf (שעות הפריה פוסט), הם עשויים להיות מולבן כמתואר18.<ol>
<li>הכן ותייג מספיק צינורות PCR כדי להעביר עוברים ויטראז ' לאחר הדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף 100% גליצרול לחלק התחתון של הבאר בשקופית שקופית של זכוכית עם שלושה מ ל של פסטר.</li>
	<li>שימוש 3 mL פסטר הצינורות, העברת עובר מוכתם איש אחד לשקופית זכוכית האוריינט כנדרש תחת stereomicroscope מצויד עם מצלמה דיגיטלית האור התחתון העליון. הערה: ג'ל לשימוש הטענת הצינורות למיקום העוברים להדמיה, אך כלים אחרים (למשל, מלקחיים, המחט מבתר) יהיו נאותים באותה מידה.</li>
	<li>באמצעות העובר הראשון, כוונן את זמן ההארה והחשיפה בהגדלה הרצויה. השתמש בתנאים אלה עבור כל העוברים באותו ניסוי (כלומר, אם הדמיה 40 עוברים מתוך heterozygous מוטציה incross, לוודא את ההארה, זמן חשיפה ההגדלה זהה עבור כל).</li>
	<li>תמונה כמו עוברים רבים ככל הנדרש. סמן כל תמונה באמצעות מספר ייחודי. לאחר הדמיה, להעביר את העובר לצינור PCR/צלחת מתויג עם אותו מספר. הערה: יש לשמור תמונות כקבצי TIF, אך גם תבניות אחרות מתאימות.<ol>
<li>במקרה הצורך, הסר גליצרול עודפות בצינורות/צלחות ה-PCR. הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את העוברים בצינורות ה-PCR במשך מספר שבועות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. לחלץ DNA ו גנוטיפ העוברים ויטראז
הערה: כאן, להשתמש בשיטה אמינה וזולה כדי לבודד דנ א גנומית מבוסס על שיטה המאצ19 עם יעילות חילוץ ה-dna של 95%-100%3.
<ol><li>לאחר השלמת ההדמיה, הוסף 40-75 μL של מאגר לפירוק אלקליין (למשל, מצליחן) לכל צינורית.</li>
	<li>מודטה ב 95 ° c עבור כ 30 דקות ומצננים את הצינורות עד 4 ° צ' לפני הוספת נפח שווה של ניטרול מאגר. דגירה של לילה ב-4 ° צ' עשויה לשפר את יעילות ה-PCR. הערה: בשלב זה, ה-DNA של גנומית יכול לשמש עבור הקלדה או מאוחסן ב-20 ° c עד שהוא נדרש.</li>
	<li>מדגימות גנוטיפ עם שיטה מתאימה (למשל, hrma, RFLP)3,20,21 כנדרש עבור מוטציה של עניין.</li>
	<li>הערה ה-גנוטיפ המתאים לכל דוגמה (לדוגמה, באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני).</li>
</ol>3. מכמת את עוצמת הפיקסל של העוברים ויטראז ' (ניתוח תמונה באמצעות תוכנת פיג'י)
<ol><li>כדי לכמת את היברידיזציה באתרו (ISH) מכתים את עוצמת האות, להמיר את כל התמונות לגווני אפור 8-bit כמתואר3. אם התמונות נשמרו בתור. TIF קבצים, השתמש במאקרו פיג'י עבור המרת אצווה3. לחילופין, להמיר תמונות בפורמטים אחרים (למשל,. JPG) ל-. טיף באמצעות תוכנה מתאימה ולאחר מכן המרה לגווני אפור של 8 סיביות באמצעות פיג'י. לנוחיותך, הנה ההליך צעד אחר צעד שפורסם בעבר3, עם כמה שינויים.</li>
	<li>פתחו תמונות בפיג והיפוך התמונה בעריכה > היפוך. לאחר מכן שנו את סוג התמונה ל-8 סיביות (תמונה &Gt; סוג > 8 סיביות).</li>
	<li>בעזרת כלי בחירת המצולע, ציירו את אזור הריבית (ROI) באופן ידני בתמונה שמסביב לאזור המכיל את האות.</li>
	<li>הקש t כדי לפתוח את מנהל הROI. השתמש בפקודה מדידה של מנהל הroi כדי למדוד את עוצמת ההחזר. העתק את הערך הממוצע מחלון התוצאות לתוכנת גיליון אלקטרוני.</li>
	<li>להעביר את אותו ROI, להבטיח את אותו גודל וצורה כמו האזור המקורי, לאזור של דג שאינו מכיל כתמים כלשהם. חזור על שלב 3.4 כדי למדוד את הרקע.</li>
	<li>כדי להשיג את עוצמת הפיקסל הממוצע של האות ISH, הפחת את ערך העוצמה הממוצע של אזור הרקע מתוך זה של האזור הוכתם עבור כל עובר.</li>
	<li>הקצה כל ערך אינטנסיביות ל-גנוטיפ (משלב 2.3).</li>
</ol>4. ניתוח התוצאות במבחנים סטטיסטיים מתאימים
<ol><li>התווה את כל הערכים בהתוויה אחת של Q-Q כדי לזהות סטיות מהתפלגות רגילה. הערה: ניתן גם לאמת את ההפצה הרגילה עם מבחן הקולמוגורוב-סמירנוף או מבחן שפירו-וילק. עם זאת, עבור גדלים גדולים במדגם יש סיכון גבוה של תוצאות חיוביות שגויות בבדיקות אלה.</li>
	<li>אם קיימות סטיות חזקות מהתפלגות רגילה, הפוך את כל הערכים (באמצעות פונקציות ln או sqrt) כדי לוודא שהם מופצים בדרך כלל לפני שתמשיך.</li>
	<li>לנתח את ההבדלים בין הערכים (שינוי אם הכרחי) מוקצה לכל גנוטיפ (wt נגד הטרוזיציטים נגד מוטציה) עם 2-זנבית ANOVA עם 95% רמות ביטחון, חשבונאות לשוויון של סטיות עם בדיקה של לוונו תיקון וולש. עבור השוואות זיווגים בין שני סוגי גנוטיפים, השתמש בבדיקה של Tukey (סטיות שוות) או משחקים-האוול (שונויות לא שוות).<ol>
<li>אם הערכים לא מופצים בדרך כלל למרות הטרנספורמציה, השתמש במבחן לא פרמטרי (קרוסה-ווליס) כדי לנתח את ההבדלים בין ערכים מדורגים לבין מבחן השוואות מרובות של דאן לאחר הניתוח עם בונפררוני תיקון עבור זיווגים שוואות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התווה את הערכים שאינם משתנים (משלב 3.6) כחלקות נקודה עבור הייצוג הטוב ביותר של התוצאות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRz:+a+database+of+zebrafish+validated+sgRNAs.">CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).</li><li>Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+pipeline+for+parallel+image-based+quantification+of+gene+expression+and+genotyping+after+in+situ+hybridisation.">An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation.</a> Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).</li><li>Bresciani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBFbeta+and+RUNX1+are+required+at+2+different+steps+during+the+development+of+hematopoietic+stem+cells+in+zebrafish.">CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish.</a> Blood. 124 (1), 70-78 (2014).</li><li>Gore, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+hematopoiesis+by+DNA+methylation.">Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation.</a> Elife. 5, e11813 (2016).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Specific+Gain+of+RTK+Signalling+Uncovers+Selective+Cell+Vulnerability+during+Embryogenesis.">Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis.</a> PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).</li><li>Wen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA5+SUMOylation+is+indispensable+for+zebrafish+cardiac+development.">GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).</li><li>Espin-Palazon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence.">Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence.</a> Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).</li><li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium.">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).</li><li>Genthe, J. R., Clements, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-spondin+1+is+required+for+specification+of+hematopoietic+stem+cells+through+Wnt16+and+Vegfa+signaling+pathways.">R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways.</a> Development. 144 (4), 590-600 (2017).</li><li>Kalev-Zylinska, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx1+is+required+for+zebrafish+blood+and+vessel+development+and+expression+of+a+human+RUNX1-CBF2T1+transgene+advances+a+model+for+studies+of+leukemogenesis.">Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis.</a> Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).</li><li>Butko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata2b+is+a+restricted+early+regulator+of+hemogenic+endothelium+in+the+zebrafish+embryo.">Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo.</a> Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Lleras Forero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+of+the+zebrafish+axial+skeleton+relies+on+notochord+sheath+cells+and+not+on+the+segmentation+clock.">Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Jowett, T., Yan, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+in+situ+hybridization+to+zebrafish+embryos.">Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos.</a> Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Narayanan, R., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+by+Whole+Mount+in+situ+Hybridization+and+DNA+Extraction+for+Genotyping+of+Zebrafish+Embryos.">Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos.</a> Bio-protocol. , e3193 (2019).</li><li>Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gata1/pu.1+lineage+fate+paradigm+varies+between+blood+populations+and+is+modulated+by+tif1gamma.">The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma.</a> EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).</li><li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+(HotSHOT).">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li><li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies.">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li><li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants.">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li><li>Jin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoietic+stem/progenitor+cells+manifest+distinct+differentiation+output+in+the+zebrafish+VDA+and+PBI.">Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI.</a> Developement. 136 (4), 647-654 (2009).</li><li>Stainier, D. Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+morpholino+use+in+zebrafish.">Guidelines for morpholino use in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 13 (10), e1007000 (2017).</li><li>El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation:+A+phenomenon+in+search+of+mechanisms.">Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms.</a> PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).</li><li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns.">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components.">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).</li><li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).</li><li>Meier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+binding+partners+of+Ldb1+are+required+for+haematopoietic+development.">Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development.</a> Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).</li><li>Kettleborough, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+analysis+of+zebrafish+protein-coding+gene+function.">A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function.</a> Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).</li><li>Leung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+VEGFA+functions+in+arteriogenesis+and+hematopoietic+stem+cell+specification.">Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification.</a> Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

יש לשקול מספר גורמים כאשר משתמשים בשיטה זו לכמת את הביטוי הגנטי. יש לשמור על תנאי ההדמיה במהלך הניסוי (לדוגמה, תאורה, זמני חשיפה ומיצוב העובר) כדי לצמצם את השונות בין המידות. נקודה קריטית היא להימנע מצביעת הדגימות, מכיוון שהבדלים בין הדגימות עשויים להיות רעולי פנים. למשל, הירידה בביטוי של ולפה בהעדר Eto2 ב קסנפוס זריזה העוברים30 ניתן להבחין רק על ידי כתמים ניטור בזהירות על פני תקופה של 24 שעות. לכן, זה אימון טוב כדי מדעית לקבוע רמות מכתים הולם עבור כל הגן הטוב ביותר לייצג את הביטוי שלה, מבלי להגיע לרוויה. כתמים מיותר גם להגדיל באופן מלאכותי את עוצמת פיקסלים ברקע בתמונות בגווני אפור שהומרו 8-bit ולהטות את תוצאות הקוונרה. במקרים קיצוניים, רמת הרקע ברקמות עובריים עשויה להיות גבוהה יותר מאשר האות ISH ב-ROI שנבחר ואין לכלול בדוגמאות אלה מהניתוח. תופעה דומה נצפתה כאשר בדקנו את התאמתו של החלמון הבלתי מוכתם לתיקון רקע (איור 4). לאחר היפוך והמרה של 8-bit פיקסלים כהים באזור החלמון להיות בהירים יותר מאשר אות ISH בעובר ולהפוך את הרקע מתוקן ערכים שליליים. כך, למנוע את השימוש בחלמון לתיקון רקע. מדידת אות הרקע באזורי פיגמנט בעובר (למשל, את העיניים או את החלק המאחור של הגזע מ 26/28 hpf ואילך) יהיה להטות באופן שווה את תוצאות כימות וצריך גם להימנע. ישנם פרוטוקולים זמינים עבור עוברי הלבנת דגים, או לפני או אחרי ISH18 ו עוברים הלבנת מעלה 24 hpf לפני מומלץ הדמיה.
מאחר ששיטה זו מסתמכת על מדידת עוצמת הפיקסלים באזור מוגדר כנגד עוצמת פיקסלים ברקע באזור שאינו מוכתם באופן שווה, אין זה מתאים לכמת של גנים מסוימים או כמעט בלתי-מוגדרים. במקום זאת, הוא מתאים היטב למדידת ביטוי של גנים עם התפלגות מוגבלת מרחב שבו אזור למדידת עוצמת פיקסל ברקע ניתן לזהות בקלות. הניתוח הנוסף שלנו מרמז כעת כי באמצעות שטח קטן יותר (3-4x קטן יותר) עבור תיקון רקע תשואות תוצאות דומות לשימוש באזור שווה ערך לזה של ההחזר. זה מרחיב את הישימות של השיטה לגנים הביע תחומים רחבים יותר (ובכך דורשים ROIs גדול יותר עבור מדידות אינטנסיביות), כל עוד אפשר להשתמש באזורים ברורים בלתי מוכתמים של העובר לתיקון הרקע.
בסופו של דבר, אנו מציעים שהגנוטיפים יבוצעו במקביל או לאחר כימות התמונה כדי למזער את הטיית הניסויים. בקשת ניסויים שנייה כדי לחזור על הפחתת הדגימה על דגימות אנניטיות ולהשוות עם הערכה הראשונה של המידות תסייע גם להפחית את ההטיה באמצעות מזהה. אם התמונות שניתן לכמת הן מהשוואה בין טיפולים שאינם דורשים גנוטיפ (למשל, סוג פראי לעומת מעכב כימי או סוג פראי לעומת MO הסתרה), הניסויים לבצע את המידות צריך לעוור את זהותו של ה דוגמה.

המבוא של טכנולוגיות עריכת הגנום (ZFN, TALENs ולאחרונה, CRISPR/Cas9) הובילה לעלייה מסיבית במספר מעבדות ברחבי העולם העושים שימוש במערכות אלה כדי ללמוד את הפונקציה של גנים ספציפיים vivo. Zebrafish במיוחד הם לקלה מניפולציה גנטית ומוטציות רבות נוצרו בעבר האחרון1,2. עבור ביולוגים התפתחותיים, אחת השיטות הנפוצות ביותר כדי להעריך את ההשלכות הפנותיות של מוטציות גנים בפיתוח עובריים הוא באתרו היברידיזציה (ISH). בהעדר פגמים מורפולוגיים ברורים המפרידים בין מוטציות homozygous מסוג פראי שלהם או heterozygous אחים, זה חיוני כדי לזהות כראוי גנוטיפים שונים במדויק.
ה-ISH הקלאסי מסתמך על ניתוחים איכותניים של עוצמות האות כדי לגזור מסקנות בנוגע לאינטראקציות רגולטוריות בין גן הריבית והגנים המסומנים בסמן. למרות שהיא שימושית, מנתח זה סובל מווריאציה טכנית ועשוי להיות מוטה בציפיות החוקרים. לפיכך, פותחה שיטה לכמת ביטוי גנים לאחר שעברו הדמיה של העוברים ויטראז ', ללא ידע מוקדם של גנוטיפ המקביל. זה היה לאחר הפקת דנ א יעיל והקלדה שאפשרו לנו גנוטיפ כמותית עם ביטוי גנים3. בעוד את ה-גנופיקציה של העוברים פוסט ish כבר בשימוש לפני4,5, התמונה מבוסס הכמת של תבניות ISH לא היה בשימוש נרחב מלבד כמה מחקרים6,7. החלופות הפופולריות ביותר מסתמכות על הניקוד החזותי או על הספירה של תאים מוכתמים בעלי ערך8,9,10, שניהם נוטים להיות מוכתמים ירודים וחוקר הטיה. שיטה זו שימושית במיוחד כדי ללמוד שינויים בגנים עם דפוסי הביטוי כי הם מוגבלים מרחב, כגון runx1 או gata2b, שניהם מבוטא מערכת מוגבלת של תאי הרצפה של אבי העורקים המכונה המוגלובין אנדותל11,12.
כאן, אנו שואפים לספק מדריך מעשי ליישום הקוונפיקציה על ידי ניתוח תמונה באמצעות פיג'י13, כמו גם את הפקת ה-DNA ואת פרוטוקול גנוהקלדה. זה נועד להמחיש חזותית שיטה שפורסמה בעבר שלנו3. השיטה שלנו מאפשרת ייצוג מדויק של הווריאציה ביטוי הגנים שזוהו על ידי ISH ו הקצאה משוחדת של רמות ביטוי גנים לגנוסוגים ספציפיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids)</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>A1402-3700</td>
			<td>96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>LW4114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavity slides</td>
			<td>Brand</td>
			<td>BR475535-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0)</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10289651</td>
			<td>the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F3000 Fiber Optic Cold Light Source</td>
			<td>Photonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8.01</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotSHOT alkaline lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td>25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotSHOT neutralization buffer</td>
			<td></td>
			<td>Tris HCl 40 mM, pH 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X) pH 7.4</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping and quantification of in situ hybridization staining in zebrafish

היברידיזציה באתרו (ISH) היא טכניקה חשובה המאפשרת לחוקרים ללמוד התפלגות mRNA באתרו והייתה טכניקה קריטית בביולוגיה התפתחותית במשך עשורים. באופן מסורתי, רוב המחקרים ביטוי גנים הסתמך על הערכה חזותית של האות ISH, שיטה הנוטה הטיה, במיוחד במקרים שבהם זהויות לדוגמה ידועים בפריורי. אנו דיווחו בעבר על שיטה לעקוף הטיה זו ולספק כימות מדויקות יותר של אותות ISH. כאן, אנו מציגים מדריך פשוט כדי להחיל שיטה זו כדי לכמת את רמות הביטוי של גנים של עניין עוברים ויטראז ולתאם את זה עם גנוסוגים המתאימים שלהם. השיטה היא שימושית במיוחד כדי לכמת ביטוי מוגבל של גנים מוגבלים בדגימות של גנוטיפים מעורבים והוא מספק חלופה משוחדת ומדויקת לשיטות הניקוד המסורתי ויזואלי.

כאן, אנו מתארים את היישום המעשי של צינור עבור כימות התמונה והעובר הקלדה כפי שפורסם במקום אחר3. זרימת העבודה עבור פעולת השירות מוצגת באיור 1. כדי להמחיש כיצד להשתמש בשיטה זו, התבצע ערך עבור dnmt3bb. 1 ב- 33 hpf עוברים מ runx1W84X/+22 incross (איור 2). 130 עוברים שנוצרו באמצעות אותם מצבי תאורה כמפורט בפרוטוקול ומתייג אותם במספר ייחודי. לאחר הדמיה, כל עובר הועבר לצינור ה-PCR לצורך הקלדה. בשלב זה, ניתוח התמונה בוצע כדי לייחס ערך של עוצמת פיקסלים לכל תמונה. ה-גנוטיפ הוקצה לתמונה המתאימה וערכי עוצמת הפיקסלים שקובצו בהתאם ל-גנוטיפ שלהם לניתוח סטטיסטי. ירידה בביטוי dnmt3bb .1 זוהה ב RUNX1W84X/W84X מוטציות (איור 2א, ב)3, בהסכם עם תצפיות קודמות5. מעניין, runx1W84X/+ heterozygous העוברים לא הראו הבדלים משמעותיים dnmt3bb. 1 ביטוי (איור 2א, ב) לעומת אחים סוג פראי שלה, הרומז כי עותק אחד של runx1 מספיק כדי לשמור על dnmt3bb. 1 ביטוי ברמות המתאימות.
רבים מוטציות דג זברה להיכשל להראות פנוטיפ מעובריים שניתן לזהות בדרך אחרת באמצעות אובדן אחר של טכנולוגיות פונקציה כמו ליגוראוסטינו olig, הגאות (MOs). פער זה ניתן לייחס מספר גורמים כולל אפקטים מחוץ ליעד, פיצוי חלבון אימהי, היפואומורפית אלל23 או התופעה שהתגלתה לאחרונה של פיצוי גנטי24,25,26,27. בדוגמה זו, שאלנו אם runx1 ביטוי הופחת או אבד ב lmo4auob100 מוטציות מאז שפורסמו בעבר נתונים באמצעות lmo4a מו הציע כי runx1 הצטמצמה ב lmo4a שמורנים28. כאן, הניתוח לא חשף הבדלים משמעותיים בביטוי runx1 בין סוג פראי ו lmo4auob100 homozygous מוטציות3 (איור 3A, ב). ניתוח נוסף על ידי העובר היחיד qPCR הראה כי היה ירידה קטנה אך משמעותית בביטוי runx1 lmo4auob100 מוטציות (איור 3ג). לכן, ייתכן שקוונפיקציה של התמונה לא תוכל לזהות הבדלים קטנים ברמות הביטוי. לחילופין, חוסר הבדל בין הגנוטיפים שגילינו הוא אמיתי והניסויים qPCR מזהים שינויים runx1 ביטוי ברקמות אחרות כמו telenchephalon שבו הן lmo4a והן runx1 מבוטא. החוקרים צריכים תמיד לאמת את התוצאות שלהם עם שיטה עצמאית כמו qPCR, אבל באופן אידיאלי מעשיר את רקמת העניין על ידי הזרם cy, למשל.
במקרים נדירים שבהם ל-ISH יש רקע גבוה (איור 3D), ערך עוצמת הפיקסלים של אזור זה גבוה כל כך שהחיסור מערך האות מפיק מספר שלילי ובמקרים כאלה העוברים לא ייכללו בניתוח. בניסיון שלנו, זה התרחש כ 0.4% העוברים בנחקר3 אבל עשוי להשתנות בין ניסויים, מרגשים או קבוצות של ריאגנטים. למרות שזה יכול להיות מגבלה של השיטה, התדר הנמוך של הרקע הגבוה הוא לא סביר מאוד להשפיע על התוצאות הכלליות.
כדי לבדוק את ההשפעה של בחירת אזורים שונים לתיקוני רקע, אנו מדדו לראשונה את עוצמת הפיקסל של האות runx1 ISH ב -28 העוברים השונים, באמצעות אזורים שונים לתיקוני רקע (איור 4). ארבעה אזורים שונים נבחרו: שניים באזור הגזע (R1, ו-R2), אחד באזור החלמון (בלתי מוכתם, אבל סביר לצבור כתמים ברקע) ואזור קטן יותר הקדמי של התשואה (אר סי, איור 4ב). מדידת עוצמת הפיקסלים באזורים אלה הראתה הבדל יציב יחסית באינטנסיביות בין התשואה לאזור הרקע (איור 4ג). עם זאת, R3 תמיד הראו ערכים גבוהים מאוד (מעל אלה ב-ROI). לאחר היפוך והמרה ל-8-bit, אזור החלמון נראה בהיר מאוד ולכן אינו מתאים לשימוש כתיקון רקע. R2 היה קרוב יותר התשואה אבל הכיל כמה אות ISH, ושימוש בו עבור תיקון ירד את עוצמת פיקסל ממוצע בהשוואה או R1 (ממוקם דורסלי נוספת, הרחק מהאות ISH) או אר אר. כך, או R1 או אר אר הם האזורים המתאימים שניתן להשתמש בהם עבור תיקון רקע (למרות השטח של אר 4 להיות קטן יותר מזה של R1). הבא, ביקשו להשוות את השימוש R1 או אר 4 השפיעו על התוצאות בעת השוואת runx1 expression. בשביל זה, אנחנו לחצות dll4+/- הטרוזיטים29 וניתח runx1 ביטוי באקראי סוג פראי נבחר ו Dll4-/-עוברים (איור 4E). למרות שהשימוש ב-R1 או בארה ב לתיקון רקע מושפע מערכים בודדים, עוצמות הפיקסלים הממוצע באותו גנוטיפ לא היו שונות באופן משמעותי (איור 4E). יתר על כן, השוואת runx1 ביטוי עדיין מניב ערכי עוצמה ממוצע דומה בין גנוטיפים באמצעות האזורים R1 או 4 כתיקון רקע (μR1= 16.3 ו-μ4= 18.2, בהתאמה). יחד, הגענו למסקנה כי למרות הבחירה של אזור הרקע חשוב, הקריטריונים העיקריים היא כי הוא אינו כולל אזורי חלמון (מועדים להצטברות של כתמים ברקע) וכי הוא לא צריך להכיל כל (ספציפי) מכתים שעשוי להטות את ערכי עוצמת הפיקסל של הרקע.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig1a.jpg"> איור 1: זרימת העבודה של כימות התמונה המקבילית ופרוטוקול ההקלדה. עוברים שנאספו מתוך incross של דגים heterozygous עבור אלל מוטציה נחקר עבור הגן הנמדד עם פרוטוקול ISH סטנדרטי. לאחר הדמיה, דנ א גנומית מופק באמצעות פרוטוקול מצליחן על ידי הוספת מאגר הליזה ישירות על העובר בצינור 0.2 mL PCR, ואחריו 30 דקות דגירה ב 95 ° c. ה-DNA הזה משמש להקלדה של העוברים על ידי ה-pcr, pcr ו הגבלת אורך של קטע ההגבלה (RFLP), kasp בחני או כל שיטה מתאימה אחרת. במקביל, התמונות עבור כל עובר הן הפוכות ומומרות לסולם אפור של 8 סיביות. ROIs של צורה וגודל זהים המכילים את האות ISH (צהוב) והרקע (כחול) נבחרים ונמדדים באופן ידני. , המידות, המוקצות לגנוטיפים מתאימים. מנותחות מבחינה סטטיסטית האיור הותאם מ Dobrzycki et al.3<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig02.jpg"> איור 2: כימות התמונה ב-runx1 מוטציות חושף רמות מופחתת של dnmt3bb. 1 ביטוי על ידי ISH. (A) לדוגמה תמונות של ISH ב-33 hpf סוג פראי (כחול), runx1+/w84 x (ירוק) ו runx1W84X/W84X (כתום) עוברים, מציג dnmt3bb. 1 ביטוי בראש העורקים הראש. (ב) ערכי עוצמת פיקסלים של dnmt3bb. 1 mrna ב runx1W84X/W84Xעוברים (n = 36) ירדו באופן משמעותי בהשוואה לסוגי בר (n = 32) ו הטרוזיטים (n = 62) (ANOVA, p < 0.001). המקדמים של וריאציה הם 24%, 22% ו -21% עבור סוג פראי, הטרוזיציטים וקבוצות מוטציה, בהתאמה. נקודת נתונים כחול, ירוק וכתום מתאימות לתמונות לדוגמה מהחלונית A. הסורגים מייצגים ממוצע ± ש גויטיין * * *p< 0.001 (משחקים-האוול לאחר הבדיקה הפוסט-הוק). האיור הותאם מ Dobrzycki et al.3<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig03.jpg"> איור 3: מדידת רמות ביטוי runx1 על ידי ISH ב lmo4auob100מוטציות. (א) דמויות מייצגות של ISH עבור runx1 בסוג של 28 hpf פראי (כחול), heterozygous (ירוק) ו lmo4auob100/uob100 (כתום) עוברים, מציג את הביטוי בראש העורקים הראש. (ב) כימות האות runx1 mrna, זיהה על ידי ISH, מן 28 hpf פראי סוג (n = 15), heterozygous lmo4a+/- (הט) (n = 34) ו lmo4auob100/uob100 מוטציה (n = 18) עוברים ממצמד אחד מראה לא הבדל משמעותי בעוצמת פיקסל runx1 בין גנוסוגים שונים (ANOVA,> p 0.6) נקודת נתונים כחול, ירוק וכתום מתאימות לתמונות לדוגמה מהחלונית A. הסורגים מייצגים ממוצע ± ש גויטיין (C) boxplots הצגת רמות runx1 mrna מנורמל (2-ΔCt) בסוג פראי יחיד (כחול; n = 12) ו lmo4auob100/uob100 (מוט, כתום; n = 12) עוברים, שנמדדו על ידי רביעיית ה-PCR, מראה רמות נמוכות של runx1 במוטציות בהשוואה לסוג פראי. *p < 0.05 (t מבחן). (ד) דוגמה לניסוי ISH על העובר 28 (מוכתם בrunx1, ראשי חץ צהובים) המראה רקע גבוה. האיור הותאם מ Dobrzycki et al.3<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig04.jpg"> איור 4: ההשפעה של תיקון עוצמת הרקע על תוצאות המדידה. (א) דמות מייצגת של runx1 ISH כתמים ב העובר סוג פראי ב 28 hpf. (ב) אותה תמונה לאחר היפוך והמרה ל-8 סיביות. אזור הריבית (ROI) מודגש בירוק ובארבעה אזורים שונים המשמשים לתיקון רקע (R1-פור) מודגשים בצהוב. (ג) מדידות של עוצמת פיקסלים גולמיים בכל האזורים המוצגים בלוח B. הערה העוצמה ב-R3 (חלמון) היא גבוהה באופן עקבי מאשר האות ISH בפועל של ההחזר (n = 11). (D) Runx1 ביטויים בתוך ההחזר באמצעות R1, R2 ו-4 אזורי רקע. אזורים עבור ROI, R1, R2 ו R3 ~ 28500 פיקסלים; . אר. 8500 פיקסלים שים לב כי R3 רקע לא נעשה שימוש עבור השוואה זו כתיקון הרקע (ROI-R3) בעקביות הניב ערכים שליליים. (ה) Runx1 רמות ביטויים בסוג פראי ו- dll4-/- מוטציות באמצעות R1 או 4 עבור תיקון הרקע (n = 10 עבור כל דוגמה). ניתוח סטטיסטי בלוחות D ו-E בוצע באמצעות מבחן מחקר מקרוקאל-ווליס, בהנחה כי ערכי עוצמת הפיקסל לא מופצים בדרך כלל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish at JoVE.com

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

טכנולוגיות לעריכת גנים אפשרו לחוקרים ליצור מוטציות דג זברה לחקור פונקציה גנטית בקלות יחסית. כאן, אנו מספקים מדריך לבצע היפוך העובר מקבילי וכימות של אותות היברידיזציה באתרו ב zebrafish. גישה זו לא משוחדת מספק דיוק גדול יותר בניתוחים פנוטיניים המבוססים על היברידיזציה באתרו.

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

ההשלכות של מוטציות על ביטוי גנים מוערכות לעתים קרובות באופן איכותי על ידי היברידיזציה situ ובדרך כלל הבקיע חזותית, אשר סובייקטיבי מוטה על ידי הציפיות של החוקר. שיטה זו מספקת דרך עקבית יותר להשוות בניסויי situ על ידי כימות התעצמות התמונה והסרת הטיה זו. זה יכול גם להיות מותאם בקלות למערכות מודל אחרות שמשתמשות בהכלאה situ כקורא של ביטוי גנים.התחל על ידי הדמיה של עוברים היברידיים-או מוכתמים ISH. מכינים תסכול גליצרול ומערבבים אותו להומוגניזציה. מעבירים את העוברים לתסכול גליצרול עם פיפטה פסטר שלושה מיליליטר ולהשאיר אותם להסתפק לפחות חמש דקות.הכן ותייג מספיק צינורות PCR כדי להעביר את העוברים מוכתמים ISH לאחר הדמיה, ולאחר מכן להשתמש פיפטה פסטר שלושה מיליליטר להוסיף 100% גליצרול לתחתית של שקופית דיכאון זכוכית. מעבירים עובר בודד עם ויטראז' איש למגלשת הזכוכית ומכווןים אותו תחת מיקרוסקופ סטריאו המצויד במצלמה דיגיטלית ותאורה תחתונה וטופ. בעזרת העובר הראשון, התאימו את זמן התאורה והחשיפה בהגדלה הרצויה.תדמיין מספר עוברים רבים כנדרש ותייג כל תמונה במספר ייחודי. לאחר הדמיה, להעביר כל עובר לצינור PCR שכותרתו עם אותו מספר ואם יש צורך לשאיף את גליצרול עודף מצינורות PCR. כדי לחלץ את ה- DNA, להוסיף 40 עד 75 microliters של מאגר תזה אלקליין כגון HoTSHOT לכל צינור.דגירה הצינורות ב 95 מעלות צלזיוס במשך כ 30 דקות ולאחר מכן לקרר אותם לארבע מעלות צלזיוס. הוסף נפח שווה של מאגר נטרול ולהמשיך עם genotyping עבור המוטציה של עניין. כדי לבצע ניתוח תמונה, בחר פתח את התמונה בפיג'י והפוך אותה על-ידי לחיצה על ערוך ולאחר מכן הפוך, ולאחר מכן המר את סוג התמונה ל- 8 סיביות על-ידי לחיצה על הכרטיסיה תמונה, בחירה באפשרות סוג ובחירה ב- 8 סיביות.בחרו בכלי מצולע וציירו ידנית את אזור העניין או ה-ROI בתמונה מסביב לאזור המכיל את אות ה- ISH שיש למדוד. הקש T כדי לפתוח את מנהל ההשקעות (ROI Manager) ולבחור את אזור העניין ולאחר מכן לחץ על מדידה. העתק את הערך הממוצע מחלון התוצאות לגיליון אלקטרוני.כדי למדוד את עוצמת הרקע, העבר את ההשקעה לאזור בעובר ללא כתמים ולחץ על הוסף במנהל ההשקעות. בחר את אזור הרקע ולחץ על מדידה ולאחר מכן רשום את ערך העוצמה הממוצע בגיליון האלקטרוני. השג את עוצמת הפיקסל הממוצעת של אות ההכלאה NC2 על-ידי חיסור עוצמת הממוצע של הרקע מזה של האזור המוכתם.לאחר קביעת עוצמת הפיקסל הממוצעת של כל דגימה, הקצו גנוטיפ לכל דגימה. אם לא ניתן לקבוע את הסוג, אל תכלול את המדגם בניתוח הבא. מיין את ערכי עוצמת המדגם הממוצעים לפי גנוטיפ והמשך בבדיקות סטטיסטיות.התועלת של טכניקה זו הוכח על ISH עבור dnmt3bb. 1 בעוברים מ- incross הטרוזיגוס runx1. ירידה ב-dnmt3bb.ביטוי אחד זוהה במוטנטים הומוזיגים runx1 בעוד עוברים הטרוזיגים לא הראו הבדלים משמעותיים dnmt3bb. ביטוי אחד. כאשר מנסים לקבוע את ההשפעה של מוטציה lmo4 על ביטוי runx1, ניתוח זה לא הראה הבדלים משמעותיים בביטוי בין סוג הבר מוטציות lmo4 הומוזיגוס.עם זאת, ירידה קטנה בביטוי runx1 זוהתה על ידי qPCR עובר יחיד. בכ-0.4% מהעוברים הנחויים של runx1, ל-ISH היה רקע גבוה שהסתיים במספר שלילי כאשר הוא הוחסך מהאות. במקרים כאלה, העוברים לא נכללו בניתוח.ארבעה אזורים שונים על העוברים נבדקו כדי לייעל תיקוני רקע. אמנם היה הבדל יציב יחסית בעוצמת ההשקעה בכל אחד מאזורי הרקע, R3 תמיד הראה עוצמה גבוהה יותר מאשר ROI ואין להשתמש בו לתיקון רקע. R1 ו- R4 הוכיחו את עצמם כתחומים המתאימים ביותר לתיקון רקע.חשוב למצוא את התנאים הטובים ביותר עבור ההדמיה ולשמור אותם ללא שינוי לאורך כל הניסוי. מומלץ גם לכמת את עוצמת הפיקסל לפני הקצאת גנוטיפ לכל דגימה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני דרוזופילה Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...